專利名稱：：細菌淀粉酶在牛類動物的飼料中的用途的制作方法
技術領域：
：現(xiàn)代農業(yè)系統(tǒng)中的高產(chǎn)牛(COW)在下述條件下生長，所述條件的特征為非常高的乳產(chǎn)量(奶牛(dairycow))或生長速率(肉用牛(beefcattle))，其后為同樣高的能量需求。當增加攝入超過維持水平時，飼料的利用率(utilisation)就會顯著下降。部分出于此原因，反芻動物飼料中包括了越來越易于降解的飼料，例如含淀粉原料，如基于谷類的濃縮物和全谷物青貯飼料(wholecerealsilage)。經(jīng)常在排泄物(faeces)中回收含淀粉材料，這說明這些祠料組分的利用率還可進一步增加。本發(fā)明涉及細菌淀粉酶在牛類動物(bovineanimal)，如奶牛和肉用牛的飼料中的用途，特別是用于改進乳產(chǎn)量(milkyield)、增重(weightgain)、表觀消化率(apparentdigestibility)、4吏用尼龍袋法(nylonbagmethod)的飼沖+干物質(feedstuffdrymatter)的消失(disappearance)，和/或飼泮牛專爭4b率(feedconversion)。本發(fā)明還涉及組合物，如包含細菌淀粉酶的飼料添加劑和飼料，以及制備這些纟且合物的方法。相關領域的描述WO03/068256Al描述了用于改進反芻動物營養(yǎng)的淀粉酶飼料補充劑。使用的淀粉酶是由米曲霉(Aspergillusoryzae)產(chǎn)生的真菌淀粉酶。Tricarico等在AnimalScience2005，81:365-374描述了含有a-淀粉酶活性的米曲霉提取物對泌乳的(lactating)荷爾斯坦因(Holstein)奶牛的瘤胃發(fā)酵(ruminalfermentation)和乳產(chǎn)生的影響。美國專利號3,250,622公開了特定添加劑的用途，所述添加劑含有蛋白分解酶和淀粉分解酶以及膠酶(gumase)，其與磨碎的麥芽載體密切相關，用于刺激奶牛中乳的產(chǎn)生。沒有指定所述酶的來源。Mora-Jaimes等(Agrociencia36(1)(2002),31-39)研究了用淀粉酶處理的喂食羊羔的高粱谷物的性能和瘤胃發(fā)酵。Rojo等(AnimalFeedScienceandTechnology,123-124(2005),655-665)研究了來自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和黑曲霉(Aspergillusniger)的夕卜源淀粉酶對瘤胃淀粉消化和羊羔性能的影響。WO01/41795Al涉及蛋白酶和季氨羧酸內鹽的組合在球蟲病(coccidiosis)和細菌感染的治療和/或預防中的用途。而且還要求保護通常的動物增重的改進。可以包括木聚糖酶和/或淀粉酶。提到了來自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的a-淀粉酶。雖然也提到了反芻動物，然而所有實例都涉及肉用子雞(broilerchick)。本發(fā)明的目的是提供可替代的、優(yōu)選改進的淀粉酶，其可以通過改進飼料利用率、乳產(chǎn)量和/或增重而減輕上述問題。此外，或者可選地，本發(fā)明的淀粉酶可以具有改進的性質，如劑量響應曲線(dose-responseprofile),pH曲線、?；€(wěn)定性(pelleting-stability)、溫度穩(wěn)定性、膽汁鹽(bile-salt)穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性，和/或比活性。此外，或者可選地，本發(fā)明的淀粉酶能夠降解瘤胃(rumen)、大腸和/或小腸中的淀粉。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及至少一種細菌淀粉酶在牛亞科動物(animalofthesubfamilyBovinae)的飼料中的用途，特別是用于改進乳產(chǎn)量、增重、飼料消化率和/或飼料轉化率(FCR)。本發(fā)明還涉及至少一種細菌淀粉酶在組合物制備中的用途，所述組合物用于牛亞科動物的飼料中。此外，本發(fā)明涉及祠料添加劑組合物，其包含至少一種細菌淀粉酶，連同至少一種選自維生素和/或礦物質的額外組分。最后，本發(fā)明涉及組合物，其包含至少一種細菌淀粉酶，連同至少一種選自干草(hay)、草料(forage)、粗飼料(roughage)和/或飼料濃縮物(feedconcentrate)的額外組分。這種組合物的實例是飼料濃縮物和全混合日糧(totalmixedration)(TMR)。5發(fā)明詳述在本上下文中，淀粉酶是催化淀粉和其它直鏈和支鏈寡糖和多糖的內-水解的酶。在具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶具有a-淀粉酶活性，即，催化寡糖和多糖中1，4-a-糖苷鍵的內水解。a-淀粉酶以隨機方式作用于，例如淀粉、糖原和相關的多糖和寡糖，釋放a-構型中的還原基團。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶是a-淀粉酶(系統(tǒng)名稱1,4-a-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。在其它實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶屬于淀粉酶的EC3.2.1組，如EC3.2.1.1(a-淀粉酶)、EC3.2.1.2(|3-淀粉酶)、EC3.2.1.3(葡聚糖l,4-a-葡糖苷酶、淀粉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶)、EC3丄U0(a-葡糖苷酶)、EC3.2.1.60(葡聚糖1,4畫a-麥芽四糖水解酶(glucan1，4-a-maltotetraohydrolase))、EC3.2.1.68(異淀粉酶)、EC3.2.1.98(葡聚糖1,4-a-麥芽己糖酶)或EC3.2,1.133(葡聚糖1,4-a-麥芽糖水解酶)。在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶可分類為(或者分類為)屬于EC3.2.1.1組。EC號是指來自NC-IUBMB的EnzymeNomenclature(酶命名法)1992,AcademicPress,SanDiego,California,其包4舌分另'J在Eur.J.Biochem.1994,223，1-5;Eur.J.Biochem.1995，232，1-6;Eur.J.Biochem.1996,237，1-5;Eur.J.Biochem.1997，250，1-6;andEur.J.Biochem.1999,264，610-650出版的補遺l-5。命名法定期地補充和更新，參見例如在http:〃www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html的萬維網(wǎng)?？梢杂萌魏魏线m的試驗確定淀粉酶活性。通常，pH試驗和溫度試驗可以適用于所述的酶。pH值試'瞼的實例為pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。溫度試驗的實例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、卯或95。C。優(yōu)選的pH值和溫度在生理范圍內，如3、4、5、6、7或8的pH值，和30、35、37或40。C的溫度。優(yōu)選的試驗方法是本文實施例5中的KNU(S)法。另一個優(yōu)選的試驗方法是本文實施例6中的還原糖法?？蛇x地，可以使用下述淀粉酶試驗方法底物Phadebas片劑(PharmaciaDiagnostics;交耳關的不溶性藍色淀粉聚合物，其與牛血清白蛋白和緩沖物質混合，并制成片劑)。試驗溫度37°C。試驗pH:4.3(或7.0，如果期望的話)。反應時間20分鐘。在懸浮于水中后，用a-淀粉酶水解淀粉，得到可溶的藍色片段。在620nm測定所得的藍色溶液的吸光度，其是a-淀粉酶活性的函數(shù)。一個真菌a-淀粉酶單位(lFAU)是在標準的試驗條件下每小時分解5.26g淀粉的酶量。優(yōu)選的淀粉是Merck,Amylum可溶的Erg.B.6,批號9947275。對試驗更詳細的描述，APTSMYQI-3207，可應要求從NovozymesA/S，Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd,Denmark獲得。在具體的實施方案中，明確定義了淀粉酶，所述淀粉酶以加入到飼料中的形式存在，或者以包括于飼料添加劑中的形式存在。明確定義指，淀粉酶制備物為蛋白質基礎上的至少50%純度。在另外的具體實施方案中，淀粉酶制備物為至少60、70、80、85、88、90、92、94或者至少95%純。可以通過本領域已知的任何方法，例如通過SDS-PAGE,或者通過大小排阻色譜(參見WO01/58275的實施例12)來確定純度。定義明確的淀粉酶制備物具有優(yōu)勢。例如，要劑量正確地(dosecorrectly)將淀粉酶加入祠料就容易得多，所述淀粉酶基本不含干擾或者污染的其它酶。術語劑量正確地具體指目的是獲得一致而恒定的結果，和獲得根據(jù)期望的效果優(yōu)化劑量的能力。具有這種數(shù)量級的純度的淀粉酶制備物可以使用重組的產(chǎn)生方法獲得，但是它們不那么容易獲得，而且當用傳統(tǒng)的發(fā)酵方法產(chǎn)生時，各批次之間的差別要高得多。本發(fā)明的淀粉酶的分離、純化和濃縮可以通過常規(guī)方法進行。例如，可以通過常規(guī)步驟從發(fā)酵液中回收淀粉酶，所述常規(guī)步驟包括，但不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，并通過本領域已知的各種方法進一步純化，所述方法包括，但不限于色譜(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE，或提取(參見，例如，ProteinPurification,J,C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。可如本領域已知的將純化的淀粉酶配制成適用于動物飼料和/或動物飼料添加劑的液體或固體產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明使用的細菌淀粉酶以有效量包括于牛飲食或牛飼料添加劑中。現(xiàn)在期望的是，有效量低于1000mg酶蛋白每kg飲食干物質(ppm)，優(yōu)選低于800、600、500、400，或低于300ppm。在優(yōu)選的實施方案中，淀粉酶的劑量低于200mg酶蛋白每kg飲食干物質，優(yōu)選低于150、100、90、80、70、60或低于50ppm。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，淀粉酶的劑量低于40、35、30、25或低于20ppm。在最優(yōu)選的實施方案中，淀粉酶的劑量低于15、12、10、9、8或低于7mg酶蛋白每kg飲食干物質。另一方面，有效量可以高于0.01mg酶蛋白每kg飲食干物質，優(yōu)選高于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.75、1、2、3或高于4mg酶蛋白每kg飲食干物質(ppm)。因此，優(yōu)選劑量范圍的非限定性實例為0.10-50mg酶蛋白/kg，優(yōu)選0.50-10、1-9、2-8、3-8，或4-7mg酶蛋白/kg。優(yōu)選劑量范圍的其它實例(均以ppm表示)為1-35、1-30、2-25、3-20和4畫15。為了確定每kg伺料的淀粉酶蛋白mg數(shù)，從飼料組合物純化淀粉酶，使用期望的淀粉酶方法確定純化后的淀粉酶的比活性。也可以使用相同的方法同樣地確定飼料組合物的淀粉酶活性，根據(jù)這兩個確定結果，計算以mg淀粉酶蛋白每kg飼料表示的劑量。將同樣的規(guī)則應用于確定飼料添加劑中的淀粉酶蛋白mg數(shù)。當然，如果樣品使用了用于制備添加劑或飼料的淀粉酶，可以由此樣品確定比活性(不需要從飼料組合物或添加劑中純化淀粉酶)。為了對細菌進行分類學上的分類和鑒定，必須參照Bergey'sManualofSystematicBacteriology(1986)，vol2,ISBN0-683-0783?？晒┻x擇地，可以使用為人所熟知的16SrRNA序列分析(參見例如Johansen等，Int.J.Syst.Bacteriol,1999,49,1231-1240，特別是1233頁第二欄的方法部分)；或者可以咨詢分類學專家，例如，來自DSMZ或其它公認的保藏機構的分類學專家。如在本文中使用的，術語細菌指示了淀粉酶源自細菌。術語"源自"包括可以獲得或者獲得自野生型的細菌菌抹，以及它們的變體的酶。變體可以具有至少一個氨基酸殘基的至少一個取代、插入和/或缺失。術語變體還包括重排體(shufflant)、雜合體(hybrid)、嵌合酶和共有酶(consensusenzyme)?？梢杂帽绢I域已知的任何方法產(chǎn)生變體，所述方法如定點突變、隨機突變、共有衍生方法(consensusderivationprocess)(EP897985)和基因重才非(WO95/22625，WO96/00343)等。就本目的而言，當使用至少一種細菌淀粉酶進行變體的設計、衍生或制備時，淀粉酶變體可以稱為(qualifyas)細菌的。術語細菌的指的不是可能的重組產(chǎn)生宿主，而只是指淀粉酶編碼基因的宿主起源。根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶優(yōu)選源自芽孢桿菌屬(Bacillus)的菌抹，如解淀粉芽孑包桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、環(huán)狀芽孑包4干菌(Bacilluscirculans)、Bacillushalmapalus、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、芽孢桿菌屬的菌種(Bacillussp.)、嗜熱脂肪芽孢桿菌8(Bacillusstearothermophilus)和枯草芽孑包桿菌(Bacillussubtilis);優(yōu)選來自解淀粉芽孢桿菌、Bacillushalmapalus、地衣芽孢桿菌、芽孢桿菌屬的菌種和嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌林；更優(yōu)選來自解淀粉芽孢桿菌、Bacillushalmapalus、芽孢桿菌屬的菌種和嗜熱脂肪芽孢桿菌；甚至更優(yōu)選來自解淀粉芽孢桿菌、Bacillushalmapalus、芽孢桿菌屬的菌種和嗜熱脂肪芽孢桿菌；最優(yōu)選來自嗜熱脂肪芽孢桿菌。根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶的非限定性實例是源自下述的那些地衣芽孢桿菌，如Swissprot入口名(entryname)AMY—BACLI，初級登錄號P06278;解淀粉芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY—BACAM，初級登錄號P00692;巨大芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY—BACME，初級登錄號P20845;環(huán)狀芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY—BACCI，初級登錄號P08137;嗜熱脂肪芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY—BACST,初級登錄號P06279。另一個實例源自枯草芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY—BACSU,初級登錄號P00691。就本發(fā)明而言，優(yōu)選的淀粉酶是下述商業(yè)產(chǎn)品中包含的淀粉酶BAN、Stainzyme、TermamylSC、Natalase和Duramyl(全部來自Novozymes)。根據(jù)本發(fā)明使用的更特定的淀粉酶實例是包含于商業(yè)的ValidaseBAA和ValidaseHT產(chǎn)品中(來自ValleyResearch)的淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶的更進一步的具體實例是包含于下述商業(yè)產(chǎn)品中的淀粉酶Clarase、DexLo、GC262SP、G-ZymeG990、G-ZymeG995、G-ZymeG997、G-ZymeG998、HTAA、Optimax7525、PurastarOxAm、PurastarST、SpezymeAA、SpezymeAlpha、SpezymeBBA、SpezymeDeltaAA、SpezymeDBA、SpezymeEthyl、SpezymeFred(GC521)、SpezymeHPA、SpezymeExtra和Ultraphlow(全部來自Genencor);ValidaseHT340L、ValleyThin340L(全部來自ValleyResearch);Avizyme1500、Dextro300L、Kleistase、Maltazyme、Maxamyl、Thermozyme、Thermatex、StarzymeHT120L、StarzymeSuperConc，禾口Ultraphlo。本發(fā)明還涉及淀粉酶在牛亞科動物飼料中的用途，所述淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-481具有至少65%同一性的氨基酸序列；這種淀粉酶在制備組合物中的用途，所述組合物用于牛亞科動物的銅料9中；飼料添加劑組合物，其包含這種淀粉酶，以及選自維生素和/或礦物質的至少一種額夕卜組分(additionalingredient);和組合物(例如飼料組合物)，其包含這種淀粉酶以及選自干草、草料、粗飼料和/或飼料濃縮物的至少一種額外組分。優(yōu)選地，在飼料中的用途是(i)改進乳產(chǎn)量、增重和/或飼料轉化率(FeedConversionRatio);(ii)改進乳產(chǎn)量、表觀消化率和/或使用尼龍袋法的飼料干物質的消失；(iii)與纖維素酶組合。(iii)的用途可以是(iv):改進乳產(chǎn)量和/或背脂厚度(backfatthickness)。優(yōu)選地，飼料添加劑包含纖維素酶。更優(yōu)選地，飼料添加劑是預混物(premix)，如礦物質預混物、維生素預混物，或包括維生素及礦物質的預混物。飼料組合物優(yōu)選還包含纖維素酶。飼料組合物可以是富含淀粉酶的濃縮物(concentrate),富含淀粉酶的全混合日4泉，和/或可以包含玉蜀黍(maize)和/或高粱，優(yōu)選玉蜀黍。本發(fā)明還涉及制備組合物的方法，所述組合物用于牛亞科動物的飼料中，所述方法包括向至少一種飼料成分中加入淀粉酶的步驟，所述淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少65%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述方法還包括加入纖維素酶。本發(fā)明還涉及增加牛亞科動物的乳產(chǎn)量的方法，所述方法包括向動物飼料中加入淀粉酶的步驟，所述淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少65%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述方法還包括向動物飼料中加入纖維素酶。本發(fā)明還涉及增加牛亞科動物的背脂厚度的方法，所述方法包括向動物飼料中加入淀粉酶與纖維素酶組合的步驟，所述淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少65%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及改進表觀消化率、使用尼龍袋法的飼料干物質的消失，增加增重和/或改進牛亞科動物的飼料轉化率的方法，所述方法包括向飼料或飼料添加劑中加入淀粉酶的步驟，所述淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少65%同一性的氨基酸序列。將本發(fā)明的氨基S交序列("發(fā)明序列"；例如，SEQIDNO:2的氨基酸1-481)和不同的氨基S臾序列("外源序列，，)之間的同一性程度計算為兩個序列比對中完全匹配的數(shù)目，除以"發(fā)明序列"的長度或"外源序列，，的長度中最短的。將結果用百分比同一性表示。作為實例，下面是SEQIDNO:2的氨基酸1-481("發(fā)明序列")與SEQIDNO:4("外源序列")的比對的部分SEG2,1-4811AAPFNGTMMGYFEWYIjPDDGTIjWTKVANEANNrjSSrjG工TAIjWIjPPAYKG49....IMIIIIIIIIIMI..I.::.::I:II...IM:I:IIMISE(241HHNGTNGTMMGYFEWYIjPNDGNHWNRIjRSDASNIjKDKGISAVWIPPAWKG50當"發(fā)明序列"和"外源序列"在重疊的相同位置具有同樣的氨基酸殘基時，即發(fā)生了完全匹配(在比對實例中，完全匹配的氨基酸殘基下面用T表示)。實例中完全匹配的數(shù)目是28。序列的長度是序列中氨基酸殘基的數(shù)目(例如，具有SEQIDNO:2的氨基酸1-481的序列的長度是481)。在實例中，發(fā)明序列的長度是49，而外源序列的長度是50。在實例中，重疊是上面序列的氨基酸序列"AAPF—AYKG";或者下面序列的氨基S吏序列"HNGT…AWKG"。在這個實例中沒有缺口(缺口用"-"表示)。因此，上述實例中表示的兩個部分序列的同一性為(28(完全匹配)/49(最短序列的長度》x100%=57.14%。因此，在具體的實施方案中，通過下述方法確定多肽的氨基酸序列與(或對于)SEQIDNO:2的氨基酸1至481的同一性的百分比i)使用具有BLOSUM62取代矩陣，缺口開放罰分為10，而缺口延伸罰分為0.5的Needle程序比對兩個氨基酸序列；ii)計數(shù)比對中完全匹配的數(shù)目；iii)將完全匹配的數(shù)目除以兩個氨基酸序列中最短者的長度，和iv)將iii)中除法的結果轉化成百分比。在優(yōu)選的實施方案中，淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸l-481有至少66、67、68或者至少69%同一性的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少70、75、80或者至少85%同一性的氨基酸序列。在進一步優(yōu)選的實施方案中，淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少90、92、95、97或者至少99%同一性的氨基酸序列。在可供選擇的實施方案中，淀粉酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少60、61、62、63或者至少64%同一性的氨基酸序列。在下文中，與SEQIDNO:2的氨基酸1-481具有特定的°/。同一性(例如，至少65%同一性)的淀粉酶稱為同源淀粉酶(homologousamylase)。同源淀粉酶的非限定性實例是源自解淀粉芽孢桿菌的淀粉酶，如Swissprot入口名AMY—BACAM，初級登錄號P00692(SEQIDNO:7),和以商品名BAN由NovozymesA/S銷售的商業(yè)淀粉酶；源自地衣芽孢桿菌的淀粉酶，如Swissprot入口名AMY—BACLI，初級登錄號P06278(SEQIDNO:8)，和以商品名DURAMYL由NovozymesA/S銷售的商業(yè)淀粉酶；源自芽孢桿菌屬菌種的淀粉酶，如以商品名STAINZYME由NovozymesA/S銷售的商業(yè)淀粉酶；源自Bacillushalmapalus的淀粉酶，如以商品名NATALASE由NovozymesA/S銷售的商業(yè)淀粉酶；和源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的淀粉酶，如Swissprot入口名AMY—BACST,初級登錄號P06279(SEQIDNO:9)，和以商品名TERMAMYLSC由NovozymesA/S銷售的商業(yè)淀粉酶。同源淀粉酶的其它非限定性實例是具有、包含或者由SEQIDNO:2的氨基酸1-481、1-484、1-486或者1-513組成的淀粉酶(其中"1"指成熟多肽的起始氨基酸，Ala,參見序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:4的氨基酸1-483組成的淀粉酶；具有、包含或者由SEQIDNO:5的氨基酸1-483組成的淀粉酶；具有、包含或者由SEQIDNO:6的氨基酸1-481組成的淀粉酶(其中"1"指成熟多肽的起始氨基酸，Val，參見序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:7的氨基酸1-483組成的淀粉酶(其中"1"指成熟多肽的起始氨基酸，Val，參見序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:8的氨基酸1-483組成的淀粉酶(其中'T，指成熟多肽的起始氨基酸，Ala,參見序列表)；和具有、包含或者由SEQIDNO:9的氨基酸1-515組成的淀4分酶(其中"1"指成熟多肽的起始氨基酸，Ala,參見序列表)；以及保持淀粉酶活性的任何上述淀粉酶的片段或變體。片段是從氨基和/或羧基末端缺失一個或幾個(more)氨基酸的多肽。優(yōu)選地，片段包含至少450個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少460個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選至少470個氨基酸殘基，和最優(yōu)選至少480個氨基酸殘基。其它優(yōu)選的片段包含至少481、483、484或至少513個氨基酸殘基。SEQIDNO:2的淀粉酶具有酶活性的片段的實例是具有其中的氨基酸1-481、1-484和1-486的序列。變體可以是包含保守取代、缺失和/或插入一個或幾個氨基酸的保守型變體，例如不顯著影響蛋白質折疊和/或活性的小插入或取代；通常為l至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端曱硫氨酸殘基;多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的'J、延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域。保守取代的實例是在以下組之內堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱石克氨酸)。本發(fā)明的淀粉酶的保守型變體的非限定性實例包括小的氨基末端插入(延伸)，例如1或2個氨基酸殘基，如Ala,或Ala-Ala?？晒┻x擇地，變體可以并入氨基酸改變，所述改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。在任何上述氨基酸序列中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是最多40、38、36、35、32、30、25、20或15個。優(yōu)選地，取代、缺失和/或插入的總數(shù)是最多10,優(yōu)選9,更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選最多6，更優(yōu)選最多5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，和甚至最優(yōu)選l。在具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶是制粒穩(wěn)定的(pelletingstable)和/或熱裙定的。酶的解鏈溫度(meltingtemprature)(Tm)是其熱穩(wěn)定性的量度。本發(fā)明的淀粉酶可以具有至少75。C、76。C、77。C、78°C、79。C、80。C、81。C、82。C、83。C、84。C、85。C、86。C、870C、88。C、89。C、90。C、91。C、92°C、93°C、94。C或者至少95°C的Tm，如通過差示掃描量熱法(DSC)所確定的。在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液，pH7.0中進行DSC。掃描速率恒定，例如1.5。C/min。掃描間隔可為20至100。C?？梢赃x擇另一種緩沖液用于掃描，例如pH5.0、5.5、6.0或pH6.5的緩沖液。在進一步可選的實施方案中，可以使用更高或更低的掃描速率，例如較低的掃描速率1.4。C/min、1.3。C/min、1.2。C/min、1.1。C/min、1.0。C/min或者0.9。C/min。在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶在pH7.0和37。C具有相對于最適pH和37。C時的活性至少35%的活性。更優(yōu)選地，在pH7.0和37。C的活性是最適pH和37。C時活性的至少40、45、50、55、60、65、70或至少75%(參見實施例6的表6)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶在pH7.0和37。C和存在5mM膽汁鹽時具有相對于最適pH和37。C、不存在膽汁鹽時的活性至少25%的活性。更優(yōu)選地，在pH7.0和37。C、存在5mM膽汁鹽時的活性是最適pH和37。C、不存在膽汁鹽時活性的至少30、35、40、45、50、55、60或者至少65%(參見實施例6的表7)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶在pH7.0和37。C時的比活性是相對于淀粉酶TERMAMYLSC在pH5.0和37。C時的比活性的至少10%，更優(yōu)選至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65，或者至少70%(參見實施例6的表8)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶在pH7.0和37。C,存在5mM膽汁鹽時的比活性是相對于淀粉酶TERMAMYLSC在pH5.0和37°C，存在5mM膽汁鹽時的比活性的至少10%,更優(yōu)選至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70，或者至少75%(參見實施例6的表9)?？梢允褂眠€原糖法合適地確定上述優(yōu)選實施方案中提及的活性，例如，如實施例6中所述，使用優(yōu)選的蠟質玉米(waxycorn)作為底物。實施例6中描述了詳細的步驟。在另一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶在存在蛋白酶時是穩(wěn)定的。蛋白酶的實例是消化蛋白酶，和飼料蛋白酶如在例如WO01/58275、WO01/58276、WO2004/111220、2004/111221、WO2004/072221和WO2005/035747中描述的蛋白酶。消化蛋白酶的實例是胰酶(pancreatin)和胃蛋白酶(pepsin)?？梢酝ㄟ^下述方法確定蛋白酶穩(wěn)定性在期望的pH(例如pH3、4或5)在緩沖液中將0.5mg/ml純化的淀粉酶蛋白質在存在蛋白酶(例如胃蛋白酶，70mg/l)時溫育期望的時間(例如30、45、60、90或120分鐘)，然后將pH提高至期望的pH(例如pH4、5、6或7)，并使用例如本文實施例6的還原糖法測定殘余活性。殘余的淀粉酶活性優(yōu)選為相對于對照(未用蛋白酶處理的才羊品)的至少20%,優(yōu)選至少30、40、50、60、70、80或至少90%。本發(fā)明的淀粉酶可以與纖維素酶組合使用。術語"與......組合"具體包括下述情況兩種酶都有活性，并且同時或者在時間上有重疊地發(fā)揮它們的作用，優(yōu)選同時發(fā)揮作用，但也可包括酶逐個作用。在本上下文中，纖維素酶是催化纖維素、地衣淀粉(lichenin)和谷類卩-D-葡聚糖中1,4-P-D-葡糖苷鍵的內水解的酶。其它名稱是，例如，內切-1，4-卩-0-葡聚糖酶、|3-1，4-葡聚糖酶；和(3-1，4-內切葡聚糖水解酶。系統(tǒng)名稱是1,4-(l,3;l,4)-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的纖維素酶分類(或可分類)為EC3.2.1.4(酶命名法1992，見上文)?？梢杂萌魏芜m當?shù)姆椒ù_定纖維素酶活性。通常地，試驗-pH和試驗-溫度可以適合于所研究的酶。試驗-pH值的實例是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。試驗-溫度的實例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95。C。優(yōu)選的pH值和溫度是在生理范圍內，如pH值為3、4、5、6、7，或8，和溫度為30、35、37，或40。C。優(yōu)選的纖維素酶源自木霉屬(Trichoderma)的菌抹，優(yōu)選里氏木霉(Trichodermareseei)，更優(yōu)選CELLUCLAST纖維素酶(或其纖維素酶組分)，其商業(yè)上可從NovozymesA/S獲得。纖維素酶組分的實例是纖維二糖水解酶I和II(CBHI、CBHII)，以及內切葡聚糖酶I和II(EGI、EGII)。術語"源自，，的意思如上面(淀粉酶部分)所述，且包括野生型纖維素酶，以及其變體和片段。在本上下文中，牛亞^f動物(也稱作牛類(bovines)，或牛類動物(bovineanimals))指動對勿界(kingdomofAnimalia)、脊索動4勿門(phylumofChordata)、哺乳動物纟岡(classofMammalia)、4禺^帝動物目(theorderofArtiodactyla)和?？寂?familyofBovidae)的動物。生物學的亞科包括約24種中型到大型的有蹄動物(ungulate)，包括家牛(domesticanimal)、野牛(Bison)、水牛(WaterBuffalo),牦牛(Yak)和四角與螺^走角的/令羊(four-hornedandspiral-hornedantelope)。一4殳特性包4舌偶3帝(cloven-hoof)和通常有真正的角的物種的至少一個性征(sex)。優(yōu)選的屬包括四角羚屬(Tetracerus)、藍牛屬(Boselaphus)、水牛屬(Bubalus)、牛屬(Bos)、中南大羚屬(Pseudoryx)、非洲野牛屬(Syncerus)、美洲野牛屬(Bison)、藪羚屬(Tmgelaphus)和大羚羊屬(Taurotragus)。最優(yōu)選的屬是牛屬，其中包括下述種歐洲野牛(Bosprimigenius(原牛)，滅絕))、白臀野牛(Banteng)(爪哇野牛(Bosjavanicus))、白肢野牛(Gaur)(大額牛(Bosfrontalis)),牦牛(野牦牛(Bosmutus))、家牛(普通牛(Bostaurus)、瘤牛(Bosindicas)(今天經(jīng)常當作原牛)，和林牛(Fouprey)(柬埔寨野牛(Bossauveli))。就本目的而言，家牛是最優(yōu)選的種。就本目的而言，術語包括所有種類的家牛，和所有生產(chǎn)類型的牛，特別是奶牛和肉用牛。牛類l良芻動物,其特征在于與單胃動物相比具有額外的發(fā)酵能力。例如，牛和羊在皺胃(abomasum)前有三個前胃(fore-stomach)。功能上最重要的是瘤胃，其作為飼料儲存和發(fā)酵室。通過大量而復雜的厭氧微生物(細菌、原生動物(protozoa)和真菌)進行發(fā)酵過程。這些能夠降解除了蛋白質和淀粉之外的細胞壁物質，因此使反芻動物吞咽飼料材料并其中受益，所述飼料材料不會在皺胃或小腸中降解。這包括例如干草、其它草料和富含細胞壁物質的青貯。瘤胃中發(fā)酵的產(chǎn)物是短鏈脂肪酸(SCFA)，其作為反芻動物中的初級能量來源，和氣體，如曱烷和二氧化碳。因此在體外瘤胃系統(tǒng)中，經(jīng)常用產(chǎn)生氣體的體積作為對給定飼料的可發(fā)酵性的量度，將體外產(chǎn)生氣體增加作為改進的飼料降解和增加的能源可用性的量度。大多數(shù)體外系統(tǒng)包括使用新鮮采樣的瘤胃流體，通常采自羊(sheep)或牛(cow)。最佳的乳生產(chǎn)需要充足的能量攝入，并且因此優(yōu)選奶牛良好的飼料利用。對于獲得肉用牛的最佳增重同樣如此。期望的是，根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶改進食用淀粉在瘤胃中的降解，特別是降解緩慢的淀粉(如玉蜀黍淀粉，其未進行熱處理和/或包含大顆粒，或馬鈴薯淀粉)，由此向瘤胃微生物及反當動物本身貢獻更多的能量(以短鏈脂肪酸的形式)。還期望的是，根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶促進旁路淀粉(即通過瘤胃而到達小腸的淀粉)在小腸中的降解，和/或增加葡萄糖的吸收，從而通過最小化大腸中的微生物降解和在排泄物中排出淀粉來利用(salvage)能量。期望的是，觀察到的淀粉降解的改進將向牛提供更多的能量，從而增加乳產(chǎn)量或增重。在本發(fā)明的細菌淀粉酶的用途的具體實施方案中，參考本文的實施例2，平均氣體產(chǎn)生量(GP)為至少0.9ml,其使用本文實施例1的修正HFT方法并使用TMR作為底物。無論淀粉酶的劑量如何，優(yōu)選在最優(yōu)劑量，使用同樣的16方法確定。在優(yōu)選的實施方案中，平均氣體產(chǎn)生量(如上述所確定)為至少1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或至少3,5ml。如可從實施例2中所見的，真菌淀粉酶導致充分低于(wellbelow)0.9ml的氣體產(chǎn)生量。這意味著真菌淀粉酶顯然不會使淀粉在瘤胃中消失。這個觀察結果得到了Tricarico等(AnimalScience2005，81:365-374)的證實，他們觀察到在泌乳奶牛中同樣有這種情況，并在瘤胃中插入導管引導補加AMAIZE的飼津牛(andruminallycannulatedsteersthefeedofwhichwassupplementedwithAMAIZE)(參見摘要)。觀察到的本發(fā)明細菌淀粉酶引起的氣體產(chǎn)生量增加實際可以理解為淀粉降解的改進，可從實施例4中見到。因此，在具體的實施方案中，參照實施例4,使用本文實施例1的修正HFT方法以TMR作為底物并培育4小時，與沒有外源淀粉酶的對照相比較，根據(jù)本發(fā)明使用的細菌淀粉酶能減少殘余淀粉的量?？梢匀鐚嵤├?中所述確定殘余淀粉。在另一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的細菌淀粉酶至少部分地降解已經(jīng)存在于牛類動物瘤胃中的淀粉。上面提及的至少0.9ml平均氣體產(chǎn)生量可以理解為存在于底物中的淀粉至少5%的降解。因此，根據(jù)本發(fā)明使用的細菌淀粉酶優(yōu)選降解底物(或飲食，或飼料組合物)中至少5%(w/w)的淀粉，更優(yōu)選至少6、7、8、9、10、11、12、13、14或者至少15%的淀粉，后面的百分比對應于1.8ml的平均氣體產(chǎn)生量。在其它優(yōu)選的實施方案中，淀粉酶降解至少20、22、24、26、28或者至少30%的淀粉。優(yōu)選的底物是TMR,例如，如實施例1中所述。就本目的而言，改進的乳產(chǎn)量指下述之一:(i)每日乳產(chǎn)生量增加的體積(1/天)；(ii)每日乳產(chǎn)生量增加的重量(kg/天)；(iii)每日產(chǎn)生的kg乳相對于以kg表示的干物質攝入的增加的比例(kg乳/kgDMI);(iv)每日產(chǎn)生的乳脂肪的增加的重量(kg/天)；(v)每日產(chǎn)生的乳蛋白質的增加的重量(kg/天)；(vi)每日3.5%脂肪修正的乳(fatcorrectedmilk)的增加的產(chǎn)生量(kg/天)；和/或(vii)每日乳固體增加的產(chǎn)生量，其中術語"乳固體，，包括乳糖、脂肪、蛋白質和乳糖的總量。增加的乳產(chǎn)量還可以表示為(viii)每日產(chǎn)生的乳糖的增加的重量(kg/天)，或者(ix)每日增加的4。/。脂肪修正的乳(kg/天)，例如，計算如下(0.4xkg乳產(chǎn)量)+(15xkg乳脂肪)。當下述情況時可以獲得增加的乳產(chǎn)量，例如，乳的干物質含量增加(例如更多的脂肪或蛋白質)而無伴隨的體積增加，體積增加而無干物質的增加，和體積以及乳的干物質含量都增加。在具體的實施方案中，參照本文實施例7，(a)相對于未添加淀粉酶的對照，每日乳產(chǎn)生量(kg/天)增加至少1%,優(yōu)選2、3、4、5、6、7、8或至少9%;(b)相對于未添加淀粉酶的對照，每日乳產(chǎn)生量(kg/天)相對于干物質攝入量(DMI)(kg/天)的比例(kg乳/kgDMI)改進至少1%，優(yōu)選至少2、3或者至少4%;(c)相對于未加淀粉酶的對照，每日產(chǎn)生的乳脂肪的重量(kg/天)改進至少1%,優(yōu)選至少2、3、4、5、6、7或者至少8%;(d)相對于未加淀粉酶的對照，每日產(chǎn)生的乳蛋白質的重量(kg/天)改進至少1%，優(yōu)選至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%;(e)相對于未加淀粉酶的對照，每日3.5%(或者4%)脂肪修正的乳產(chǎn)生量(kg/天)改進至少1%，優(yōu)選至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%;和/或(f)相對于未加淀粉酶的對照，3.5%(或者4。/。)脂肪修正的乳產(chǎn)生量(kg/天)4是高至少1%，優(yōu)選至少2、3、4或者至少5%。實施方案(a)-(f)優(yōu)選指如下面FCR段落中所述的牛試驗(cow-trial)。飼料轉化率(FCR)說明如何有效地利用飼料。FCR越低，飼料利用得越好?？梢愿鶕?jù)牛試驗確定FCR，所述試驗包括第一處理，其中將根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶以期望濃度(例如，6或30mg酶蛋白質每kg祠料，優(yōu)選每kg銅料干物質(DM))加入動物祠料，和未向動物飼料中加入淀粉酶的第二處理(對照)，每個處理由四頭或七頭牛(優(yōu)選奶牛)組成，牛在畜舍(bam)(優(yōu)選具有散養(yǎng)畜欄(freestall))中圈養(yǎng)，配備Calan門(Calangate)用于測定個體的銅料攝入，用TMR飲食飼養(yǎng)牛，其中優(yōu)選包含SO。/。濃縮物(主要由玉米粉(cornmeal)、并且小麥4分(wheatmiddling)、含可〉容物的干酒糟(distiller，sdriedgrainwithsolubles)和大豆粉(SBM)組成)、37%玉米青貯、7%苜蓿半干青貯(alfalfahaylage)和6%苜蓿干草，將FCR計算為相對于以kg每天每只牛(可選地，對于增重為kg每只牛)表示的乳產(chǎn)量(或者可選地，增重)的以kg/牛(優(yōu)選kgDM/牛)表示的進行期望時間的試驗(例如第一、第二、第三或第四個21天時間，或者全部84天時間)的飼料攝入，相對于第二處理的FCR，第一處理的FCR得到改進。為了解詳情，參見實施例7。在具體的實施方案中，同對照相比，F(xiàn)CR改進(即，減少)至少1.0%,優(yōu)選至少1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%或者至少2.5%。在進一步具體的實施方案中，同對照相比，F(xiàn)CR改進(即減少)至少2.6%、2.7%、2.8%、2.9%或者至少3.0%。在更進一步的具體實施方案中，同對照相比，F(xiàn)CR改進(即減少)至少3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%或者至少3.8%?？晒┻x擇地，改進是相對于對照組而言，對照組4妻受劑量為240DU/kgTMR干物質的AMAIZE淀粉酶。改進的增重指相對于未加淀粉酶的對照，改進的每日、每周、每兩周或每月的增重(用g或kg每個相對時間段表示)。這優(yōu)選在如上面FCR段落中所述的試驗中確定。在具體的實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶改進飼料的表觀消化率(例如，與未加淀粉酶的對照相比)。特別地，本發(fā)明的淀粉酶可以改進干物質消化率、中性洗滌劑纖維消化率和/或有機物消化率。此外，本發(fā)明的淀粉酶可以改進淀粉消化率和/或粗蛋白質消化率。例如，本發(fā)明的淀粉酶將(i)干物質消化率改進至少1%,更優(yōu)選至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%;(ii)中性洗滌劑纖維消化率改進至少2%,更優(yōu)選至少4、5、10或者至少20%，甚至更優(yōu)選至少25、30或者至少35%;(iii)有機物消化率改進至少1%，更優(yōu)選至少2、3或者至少4%，甚至更優(yōu)選至少5、6或者至少7%;(iv)淀粉消化率改進至少1%,更優(yōu)選至少2%;和/或(v)粗蛋白質消化率改進至少1%,更優(yōu)選至少2、3、4、5或者至少6%。可以根據(jù)牛試驗確定如上概述的表觀消化率，所述試驗包括第一處理，其中將根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶以期望濃度(例如，6或30mg酶蛋白質每kg飼料)加入動物飼料，和未向動物銅料中加入淀粉酶的第二處理(對照)，每個處理由六頭牛，例如公?；蚰概?，優(yōu)選奶牛組成，牛在畜舍(優(yōu)選具有散養(yǎng)畜欄)中圈養(yǎng)，配備Calan門用于測定個體的飼料攝入，用TMR飲食飼養(yǎng)牛，其中優(yōu)選包含50。/。濃縮物(主要由玉米粉、粗小麥粉、含可溶物的干酒糟和大豆粉(SBM)組成)、37%玉米青貯、7%苜蓿半干青貯和6%苜蓿干草，用對應于階段4(四個21天時間)的最后一周中的平均每天攝入的量再飼養(yǎng)8天，從第5天至第8天通過直腸觸診(rectalpalpation),每8小時(優(yōu)選每天取樣點間隔增加1小時)收集排泄物定時采集樣本(grabsample)(約300g),直至每頭牛收集到總共12個樣本，取TMR的樣本(來自每組)和每天的祠料殘渣(ort)(對每頭牛)，將所有的排泄物、TMR和飼料殘渣樣本匯集到一起(分別針對每頭牛)，在60。C強迫通風烘箱中干燥48小時，碾磨樣本通過l-mm篩子，分析干物質(DM)、酸性洗滌劑纖維(ADF)和中性洗滌劑纖維(NDF)，例如，如Goering,H.K.，VanSoest，RJ.,1970在AgricultureHandbookNo.379中所述，分析樣本的氮(N)(例如，使用ElementorVarioMaxCNAnalyzer),和灰分含量(在馬弗爐(mufflefurnace)中600°C5小時)，使用不可消化的NDF作為標記，計算總消化道的表觀消化率。優(yōu)選地，在使用Daisy-II溫育箱(AnkomTechnology,Macedon,NY，US)體外瘤胃培育120小時后，確定不可消化的NDF(Goering和VanSoest，1970),瘤胃流體來自用對照飲食飼養(yǎng)的牛。更多細節(jié)參見實施例8和表11。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶可以改進粗纖維、粗蛋白質、有機物和/或粗脂肪的總消化道表觀消化率〖例如，與未加淀粉酶的對照相比較)。例如，本發(fā)明的淀粉酶可以改進下述的表觀消化率(i)將粗纖維的表觀消化率改進至少1%，更優(yōu)選至少2，或者至少3%;(ii)將粗蛋白的表觀消化率改進至少1%;(iii)將有機物的表觀消化率改進至少1%,更優(yōu)選至少2或至少3%;和/或(iv)將粗脂肪的表觀消化率改進至少1%，更優(yōu)選至少2、3、4或者至少5%?？梢愿鶕?jù)體內牛研究確定總消化道表觀消化率，所述研究使用三頭未泌乳的牛(GermanHolstein),和兩個處理，即加入50mg酶蛋白質(EP)每kg干物質(DM),和未加酶的對照。向每日日糧(例如，由44%玉米青貯、18%草青貯、9%干草和29%基于玉米的濃縮物組成的TMR)中加入酶。優(yōu)選在連接有空調的畜舍(20。C)中在橡膠墊上安置牛，單獨飼養(yǎng)，可自由取水。實驗可以持續(xù)2個階段，每階段25天(共50天)；在每個階段中，前14天用于適應，而后11天用于采樣。每頭牛優(yōu)選每天在100h和l&00h喂5.5kg(DM)TMR,并在早晨喂食后2小時喂0.5kg(DM)干草。此外，優(yōu)選施用100g/d礦物質預混物。從第22天至第25天，在8:30通過直腸觸診對每頭牛收集排泄物定時采集樣本(約200g)?？蓪i02用作標記以計算總消化道的表觀消化率。如本領域通常的情況，可通過在105。C干燥直至無進一步的重量損失(通常為24小時)來確定DM。要了解更多詳細內容，參見實施例9和表16。說明書第18/38頁在進一步的實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶改進在尼龍袋中培育過程中飼料中干物質(DM)的消失,例如從下述祠料中消失，如玉米粒(corngrain)、大麥、玉米青貯和/或TMR。例如，在培育時間2小時后，玉米粒、大麥、玉米青貝i和TMR中DM消失分別為至少1%(優(yōu)選至少5、10、15、20、25、30或者至少35%)、至少1%(優(yōu)選至少2、4、6、8或者至少10%)、至少1%(優(yōu)選至少2或者至少3%),和至少1%(優(yōu)選至少2或者至少3%)。作為另一個實例，在培育時間4小時后，玉米粒、大麥、玉米青貯和TMR中DM消失分別為至少1%(優(yōu)選至少5、10、15、20、25或者至少26%)、至少1%(優(yōu)選至少2、4或者至少6%)、至少1%(優(yōu)選至少2或者至少3%),和至少1%(優(yōu)選至少2或者至少3%)。作為進一步的實例，在培育時間8小時后，玉米粒和大麥中DM消失分別為至少1%(優(yōu)選至少5、10、15、20、25、30或者至少33%)，至少1%(優(yōu)選至少2%)?？梢栽谏鲜鲶w內試驗(在總消化道表觀消化率的情況)中，使用為人所熟知的尼龍袋技術確定伺料干物質的消失，所述尼龍袋技術可以參考實施例9，并在實施例9中詳細描述。要獲得更進一步的詳細內容，參見實施例9和表12-15。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的淀粉酶與纖維素酶組合(i)改進乳產(chǎn)量(kg/d)，優(yōu)選在泌乳早期(earlylactationstage)(例如，在分娩后第1天至14天)，更優(yōu)選不改變乳組成；和/或(ii)改進背脂厚度，優(yōu)選在分娩后140天或140天之后?？梢允褂脙山M，在體內飼養(yǎng)試驗中在9個月內確定乳產(chǎn)量和背脂厚度，其中每組由例如220頭奶牛(GermanHolstein)組成。優(yōu)選將奶牛安置在具有條縫地板(slottedfloor)的小(cubical)畜舍中。實驗階段優(yōu)選包括分娩前的三周和分娩后的20周。用全混合日糧(TMR)飼養(yǎng)牛(優(yōu)選一天八次)，所述TMR未補加酶(對照)，或者補加了合適劑量的酶(例如對應于25mg酶蛋白質(EP)/kgTMR干物質(DM)的淀粉酶，和1.4ml/kgTMR纖維素酶，或者與淀粉酶相似的量(EP/kg))?？梢栽谖故城傲⒓磳⒚竾姙⒃赥MR上。TMR的主要組分是玉米青貯、草青貯和濃縮物(可以在農場上混合)，而且干物質含量可為約50%。優(yōu)選每天在旋轉式擠奶間(milkingparlour)中對牛擠3次奶。定期在試驗中評估個體乳產(chǎn)量和組成，以及背脂厚度。要獲得更詳細的內容，參見實施例10和圖1和2。就本目的而言，認為術語飼養(yǎng)(feed)和喂養(yǎng)(fodder)同義。關于牛類如牛的21飼料組成，以及其組分，牛類飲食通常由易降解的部分(稱作濃縮物)和富含纖維較不容易降解的部分(稱作干草、草料或粗飼料)組成。干草由干燥的草、豆類或全谷類組成。草其中包括梯牧草屬(timothy)、黑麥草屬(ryegrass)、羊茅屬(fescue)。豆類其中包括三葉草(dover)、紫花苜蓿(luceme)或苜蓿、豌豆(pea)、豆(bean)和野豌豆屬(vetch)。全谷類其中包括大麥、玉蜀黍、燕麥、高粱。全谷類的其它實例是小麥和黑麥。就本目的而言，認為術語玉蜀黍和玉米同義。其它飼料作物(foragecrop)包括甘蔗(sugarcane)、習習衣甘藍(kale)、油菜(rape)和甘藍(cabbage)。塊才艮作物(rootcrop),如完菁(turnip)、蕉青甘藍(swede)、飼用甜菜(mangel)、飼料甜菜(fodderbeet)和糖用甜菜(sugarbeet)(包括糖用甜菜漿和甜菜糖蜜)也用來飼養(yǎng)反芻動物。更進一步的作物是塊莖，如馬鈴薯、木薯和甘薯。青貯是富含纖維部分(例如來自草、豆類或全谷類，全植物或其部分，例如玉蜀黍)的窖存形式(ensiledversion),用受控的厭氧發(fā)酵方法(天然發(fā)酵或添加劑處理)處理具有高含水量的物質。濃縮物主要由谷類(如包括啤酒麥芽糟(brewer，sgmin)和酒糟的大麥、玉蜀黍、小麥、高粱、燕麥和/或黑麥)，但是也經(jīng)常包含富含蛋白質的飼料組分，如大豆(優(yōu)選大豆粉)、油菜籽、棕櫚仁、棉籽和向日葵。還可以用全混合日糧(TMR)飼養(yǎng)牛，其中將所有的飲食組分，例如草料、青貯濃縮物和預混物(例如礦物質、維生素)在提供之前混合。參照實施例3，在具體的實施方案中，本發(fā)明的祠料組合物包括TMR、濃縮物、玉蜀黍、大麥、黑麥、小麥、燕麥和/或馬鈴薯。在優(yōu)選的實施方案中，飼料組合物包含玉蜀黍和高粱中的至少一種(或者包括玉蜀黍和/或高粱)，最優(yōu)選玉蜀黍。術語如"玉蜀黍"、"大麥"、"馬鈴薯"等，包括全植物或其部分，以及各種源自其中的制備物和物質，其中包括葉、花、莖(stalk)、根、果實、核(kernel)、谷粒、粗粉和淀粉。此外，這些植物部分可按原樣(以天然形式)使用，干燥、壓碎、浸泡，或者作為青貯(非限定性列表)。在進一步特定的實施方案中，本發(fā)明的飼料組合物是富含淀粉酶的濃縮物或者富含淀粉酶的全混合日糧(TMR)，其中淀粉酶是根據(jù)本發(fā)明使用的細菌淀粉酶，如上文所述?？蓪饪s物制粒，并且在制粒前或制粒后加入淀粉酶。濃縮物還可以是醪濃縮物(mash-concentrate)。此外，可將根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶添加至任何其它飼料組分或組合物，例如混合的，或者作為表面飾料(top-dressing),或者可將其包括在飼料添加劑中，例如通過如下所述的預混物。除了如上所述根據(jù)本發(fā)明使用的淀粉酶之外，本發(fā)明的飼料添加劑組合物包含選自維生素和礦物質的至少一種額外組分。例如，本發(fā)明的伺料添加劑可以包括(i)至少一種維生素，(ii)至少一種礦物質，或者(iii)至少一種維生素和至少一種礦物質。至少一種維生素可以是脂溶性或者水溶性。脂溶性維生素的實例是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的實例是維生素B12、生物素和膽堿(choline)、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸(panthothenate)，例如D-泛酸鈞。至少一種礦物質可以是常量(macro)礦物質和/或痕量礦物質。痕量礦物質的實例是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。常量礦物質的實例是鈣、磷和鈉。預混物是本領域中公認的術語用于某些飼料添加劑。它們可以是固體或液體的。礦物質預混物是意欲向動物飼料添加的組合物,且其包含期望種類和量的礦物質，特別是痕量礦物質。維生素預混物是意;&欠向動物飼料添加的組合物，其包含期望種類和量的維生素。一些預混物包括維生素和礦物質。本文實施例12中包括了用于牛的這種組合的預混物的實例。本發(fā)明還涉及要求保護的用途、方法和組合物，其中本發(fā)明的細菌淀粉酶與下述組合使用(i)用于反芻動物的其它酶，如蛋白酶、肌醇六磷酸酶、細胞壁降解酶，如木聚糖酶、纖維素酶，和/或內切葡聚糖酶；(ii)瘤胃素(Rumensin)(莫能菌酸鈉(monensinsodium));和/或(iii)泰樂菌素(Tylan)(泰樂菌素(tylosin))。本發(fā)明進一步通過如下實施例描述，不應將所述實施例看作為對本發(fā)明范圍的限制。實施例用作緩沖劑和底物的化學物質是至少試劑級的商業(yè)產(chǎn)品。實施例1:修正的HohenheimForage值測試(HFT)HohenheimForage值測試(HFT)由Menke等(1979),J.Agric.Sci.Camb.93:217-222:"當在體外用瘤胃液體培育反芻動物飼料時，根據(jù)氣體產(chǎn)生量估計反芻動物飼料的消化率和可代謝的能量含量(Theestimationofthedigestibilityandmetabolizableenergycontentofruminantfeedingstuffsfromthegas23productionwhentheyareincubatedwithrumenliquorinvitro)"，由Steingass,H.(1983):"BestimmungdesenergetischenFutterwertesvonwirtschaftseigenenFuttermittelnausderGasbildungbeiderPansensaftfermentationinvitro"，HohenheimUniversi您，F(xiàn)ak.Agrarwiss.Dissertation,和由Steingass等，于Tieremahmng14;pp251-270(1986):"SchatzungdesenergetischenFutterwertesausderinvitromitPansensaftbestimmtenGasbildungundderchemischenAnalyse.1.UntersuchungenzurMethodeijbers"描述。它的目的主要是才艮據(jù)氣體產(chǎn)生量估計用于乳產(chǎn)生時銅料中用于泌乳的凈能量。這個測試的本修正版本用于測試瘤胃體外系統(tǒng)中外源酶的效果。簡言之，在玻璃注射器中將飼料底物與瘤胃液體和適當?shù)木彌_液混合物的組合物一起稱重。用緊密配合但可移動的活塞將玻璃注射器封閉，使產(chǎn)生的氣體的體積增加。將注射器在39。C溫育4小時。測定產(chǎn)生氣體的量并用于轉換公式中(參見實施例2中的公式)。試劑大量元素溶液(masselementsolution):6.2g磷酸二氫鉀(KH2P04)0.6g七水合硫酸鎂(MgS04*7H20)9ml濃磷酸(lmol/1)溶于蒸餾水中，加至1L(pH約1.6)緩沖溶液35.0g碳酸氫鈉(NaHC03)4.0g碳酸氫銨((麗4)恥03)溶于蒸餾水中，加至lL。痕量元素溶液13.2g二水合氯化鈞(CaCl2*2H20)10.0g四水合氯化錳(II)(MnCl2*4H20)1,0g六水合氯化鈷(II)(CoCl2*6H20)8.0g氯化鐵(III)(FeCl3*6H20)溶于蒸餾水中，加至100ml鈉鹽溶液100mg鈉鹽溶于蒸餾水中，加至100ml還原〉容液先將3ml氫氧化鈉(c-lmol/l)，然后將427.5mg水合硫化鈉(Na2S*H20)加入71.25mlH20中。在將溶液加至培養(yǎng)基溶液之前不久(shortlybefore)制備溶液酶緩沖液10.88g三水合乙酸鈉(CH3COONa*3H20)5.88g二水合氯化釣(CaCl2*2H20)0.1gBSA(牛血清白蛋白)溶于蒸餾水中，加至21，用乙酸調節(jié)至p1^5.8設備注射器(玻璃注射器，100ml,1/1用毛細管基底表示刻度(gmduatedwkhcapillarybase》硅試管(用于每個注射器，約50mm)，將其拖至(pullover)毛細管底部并用夾子(clamp)封閉用于65個注射器的帶有能量單元的轉子，約1轉每分鐘具有通風設備的培養(yǎng)箱(精度+O.S。C，內部最小尺寸70cm*70cm"Ocm)精密天平或分析天平抽吸泵(例如手動的、適用于摩托車的氣泵)，用于去除瘤胃中的物質，回流閥(returnvalve)、洗滌瓶(washingflask)具有塞子的進料瓶(2L)，用于收集瘤胃液體裝有工藝(technical)二氧化碳、具有減壓閥的氣瓶注滿瘤胃液體的設備，其由半自動吸液管(50ml)、Woulff瓶(2L)、磁力攪拌器、具有循環(huán)泵的恒溫器和PVC盆(bowl)(10L)組成越底物底物(飼料)是全混合日糧，其由44%標準濃縮物(商業(yè)上可從theUniversityofHohenheim,InstitutftirTierernShrung獲得)、6%標準干草(商業(yè)上可從theUniversityofHohenheim,InstitutfUrTierernahrung獲得)、37%玉蜀泰青貯和13%草青貯，均在65。C干燥(兩種青貯都來自Village-Neuf，St.LouisCedex,France的農場)。用實驗室用壓榨機將所有組分碾碎通過1.5mm篩子，然后混合形成TMR。樣品稱重將干物質含量為400mg的飼料準確稱重至36個注射器的每個注射器中。這些注射器中的15個是底物對照，顯示沒有酶作用時的氣體產(chǎn)生量。其余21個注射器用于酶樣品(7個注射器用于1個酶樣品)。然后向注射器插入先用凡士林涂抹的活塞。也對其它28個注射器進行這種處理，這28個注射器包含具有瘤胃液體的24ml培養(yǎng)基溶液，但是沒有任何底物樣品。7個注射器的氣體產(chǎn)生量代表僅來自瘤胃液體的氣體產(chǎn)生量的平均值。其余21個注射器是不加任何底物的酶對照。當用凡士林涂抹活塞時，注射器的摩擦阻力降低。此外，注射器是防水而且氣密的。在充滿瘤胃液體之前，所有注射器都保留于39。C培養(yǎng)箱中。鈉溶液的制備以下述順序將組分在Woulff瓶中混合711ml水0.18ml痕量元素溶液355.5ml緩沖溶液355.5ml大量元素溶液將成品溶液(completedsolution)加溫至39。C(水浴或具有恒溫器的PVC盒)，并通過;茲力攪拌器保持均一。首先，加入1.83ml鈉鹽溶液。始終通過浸沒的軟管(submergedhose)向培養(yǎng)基溶液中熏(fiimigate)C02。在36°C,加入全部還原溶液。指示劑從藍色變成紅色，再變成無色。當指示劑變成無色時加入瘤胃液體。首先用浸沒的軟管將C02通氣繼續(xù)15分鐘，在注入注射器的過程中，抬升軟管使液體保持以C02飽和。瘤胃液體的提取在早晨飼喂測試動物(主要是安置瘺管的(fistulated)羊，有時是牛)之前，將瘤胃液體提取至預熱的2l進料瓶中，將進料瓶用作收集容器。使用松散編織的亞麻袋過濾瘤胃流體，輕柔地轉移至保溫瓶中，并在運送至實驗室過程中小心地阻止進入空氣。在持續(xù)攪拌和通入C02的情況下，向約1400ml培養(yǎng)基溶液加入750ml瘤胃液體。注入注射器以相對于酶緩沖液的一定比例稀釋待測試的酶。將酶加入相應的注射器中準確的0.4ml溶液中，由此使酶溶液必須完全覆蓋底物。在將培養(yǎng)基溶液和瘤胃液體的混合物均質化后，用半自動吸液管將24ml置于每個注射器中，之前在培養(yǎng)箱中將注射器加溫高至39。C。這代表18ml培養(yǎng)基溶液和6ml瘤胃液體的體積。然后，通過小心振蕩去除所有氣泡。同時，用這種方式打碎所有飼料塊。在蓋上夾子后，在活塞的水平面，加入(register)不含任何氣體相的準確體積的液體。將注射器直接置于預熱培養(yǎng)箱(39。C)的轉子中。溫育和確定氣體體積在溫育過程中，注射器必須在轉子中保持水平位置。應將傳遞調至一轉每分鐘。在溫育過程中，培養(yǎng)箱中的溫度應該保持在39。C+0.5。C。四個小時后，完成溫育。通過仔細讀出活塞在校準標度(calibrationscale)的位置來測定氣體形成。此外，通過小心地旋轉，檢查活塞未卡住。通過兩個標度線之間的插值，可以達到高達+0.5ml的讀數(shù)精度。實施例2:體外的淀粉酶測試在實施例1的體外反芻動物模型中，測試了幾種細菌淀粉酶，并用于與三種真菌淀粉酶比較。每個實驗重復多次("n")。從NovozymesA/S,Krogshoejvej36，2880Bagsvaerd,Denmark獲得下述淀粉酶BAN240L、STAINZYME12L、TERMAMYLSCL、NATALASE200L、DURAMYL300LDX和FUNGAMYL800L。從ValleyResearchInc.,3502NorthOliveRoad,SouthBend,IN46628，US獲得VALIDASEBAA和VALIDASEFAA淀粉酶。從Alltech(AlltechInternationalHeadquarters,3031CatnipHillPike,Nicholasville，KY40356，US)獲得AMAIZE淀粉酶。結果示于下面的表1中，作為平均氣體產(chǎn)生量(GP)。與未加外源酶(m1/0/。)的對照相比較，以絕對數(shù)值以及以％給出GP。為了修正用于由酶制備物中可用的底物(例如蛋白質和配制物質，如葡萄糖和蔗糖)產(chǎn)生的氣體，在HFT系統(tǒng)中溫育包含酶和瘤胃流體的酶對照樣品，而不是飼料底物。如下計算酶對飼料底物(Delta-G)的作用，基本上按照Wallace等在J.Anim.Sci.2001,79:1905-1916中所建議的:Delta-G=(SE-SC)-(RFE-RFC),其中SE-瘤胃流體、伺料底物和酶，SC-瘤胃流體和飼料底物，RFE-瘤胃流體和酶，和27RFC-瘤胃流體。在表1中，每種淀粉酶的劑量表示為以mg每kg底物表示的粗蛋白(CP),和以mg每kg底物表示的酶蛋白(EP)。用燃燒法測量粗蛋白(CP),其中大體上C02、H20、NOx和N2通過不同拙襲"；+':老夢苕土u^翁夕々kAA^"古《/f太缺^rffii丸旦':A.7!i:Jr教汰中';piil音教為此根據(jù)制造商的說明使用LECOFP-528氮分析儀。將粗蛋白計算為氮(N)乘以因子625，即粗蛋白(g/kg)二N(g/kg)x6.25。還可以用凱氏定氮法(Kjeldahlmethod)(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis第14版,AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)確定氮含量。根據(jù)所研究酶的酶活性和比活性確定酶蛋白(EP),參照實施例5的a-淀粉酶方法。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>DURAMYL300LDX地衣芽孢桿菌1863160043,7/14.5VALIDASEBAA枯草芽孢桿菌1000-41.9/6.2VALIDASEHT枯草芽孢桿菌1000-42.3/7.5真菌淀粉酶FUNGAMYL800L米曲霉81467020/0VALIDASEFAA米曲霉1000-20.2/0.7VALIDASEFAA米曲霉10000-20/0VALIDASEFAA米曲霉100000-20/0AMAIZE米曲霉472-20.1/0.2AMAIZE米曲霉945-20.1/0.4AMAIZE米曲霉1889-40.1/0,3AMAIZE米曲霉10000-0/0AMAIZE米曲霉126349-10/0表1的結果清楚地顯示，細菌淀粉酶的性能好于真菌淀粉酶，后者通常產(chǎn)生非常少量的氣體。在這個模型中還顯示出清晰的劑量響應作用(dose-responseeffect),參見例如STAINZYME12L和DURAMYL300LDX氣體產(chǎn)生量相對于淀粉酶活性的數(shù)據(jù)。對于TERMAMYLSCL和NATALASE200L淀粉酶，也可以看到清晰的劑量響應作用，但是僅存在于劑量范圍的較低端一在非常高的劑量觀察到氣體產(chǎn)生量變水平(levelout)或者甚至有輕微的下降。不希望受到任何理論的限制，這可以歸因于商業(yè)酶制劑中包括的配制物化學品過量。如上所述，測試具有下述氨基酸序列的純化的淀粉酶SEQIDNO:2的氨基酸1-486，SEQIDNO:4的1-483,SEQIDNO:5的1-483，SEQIDNO:6的1-481，和SEQIDNO:7的1-483,得到了相同的結果。實施例3:對各種淀粉底物的體外活性在實施例1的體外模型中測試實施例2中所述的淀粉酶中的四種，但是使用一定范圍的不同的含淀粉底物代替TMR底物，即，使用濃縮物(標準濃縮物，商業(yè)可由theUniversityofHohenheim，InstitutflirTierernahrung獲得)、玉米粉、玉米青貯(如實施例1中所述制備)、大麥粉、黑麥粉、小麥粉、燕麥粉(詞料級)和馬鈴薯淀粉(食品級)。結果示于下面的表2中。在每一部分，三種首先提及的淀粉酶是細菌淀粉酶，而后面提及的淀粉酶是真菌淀粉酶。在實施例2中更詳細地描述了這些淀粉酶，其中還描述了如何計算酶蛋白質劑量(CP、EP)和平均GP。類7z扒、一酶酶劑量每kg底物平均GPmg蛋白質(CP)mg酶蛋白(EP)n(%)TMRSTAINZYME12L3108114911.2TERMAMYLSCL10002751011.2DURAMYL300LDX18631600414.5AMAIZE1889-40,3濃縮物STAINZYME12L3108114925.3TERMAMYLSCL-一--DURAMYL300LDX1863160027.3AMAIZE1889-20玉米粉STAINZYME12L3108114935.9TERMAMYLSCL1000275273.6DURAMYL300LDX1863160031.8AMAIZE1889-0.4玉米青貯STAINZYME12L31081149228.8TERMAMYLSCL----DURAMYL300LDX18631600224.0AMAIZE1889-20大麥粉STAINZYME12L3108114929.1TERMAMYLSCL1000275116.2DURAMYL300LDX----AMAIZE1889-10黑麥粉STAINZYME12L3108114928.8TERMAMYLSCL100027525.9DURAMYL300LDX----AMAIZE1000-22.130<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表2的結果表明細菌淀粉酶對所有底物都有作用，而對玉米青貯和玉米粉的作用最顯著。TERMAMYLSC淀粉酶看起來是對所有底物最有效的細菌淀粉酶。如上所述，測試具有SEQIDNO:2的氨基酸1-486、SEQIDNO:4的1-483,和SEQIDNO:6的1-481的氨基酸序列的純化的淀粉酶，得到相同的結果。真菌淀粉酶對所有底物的作用通常是小的。實施例4:體外淀粉降解使用實施例1中所述的體外瘤胃系統(tǒng)，通過與沒有外源淀粉酶的對照樣品比較，確定細菌淀粉酶TERMAMYLSCL在4小時體外瘤胃培養(yǎng)中降解的淀粉量。底物是TMR,酶劑量為lOOOmg粗蛋白每kg飼料。通過加入99.9%乙醇至終濃度為80%乙醇，終止HFT反應并沉淀淀粉。離心樣品(2500xg,4°C，lOin.)并棄去上清。為了將殘余的淀粉定量，再次用80%乙醇沉淀樣品，并在離心后向殘余物中加入乙酸緩沖液(pH5)，然后在40。C溫育15分鐘，接著加入200微升Termamyl300LDX(NovozymesA/S)并繼續(xù)在90。C以上溫育30分鐘。隨后，將溫度降低至60。C,加入500微升Amyloglucosidase(淀粉葡萄糖苦酶)(320U/ml;MegazymeInternational),并將樣品溫育16小時。使用GOPOD試劑將得到的葡萄糖定量，所述試劑是使用葡萄糖氧化酶和過氧化物酶的比色試劑盒，可由MEGAZYMEInternational獲得。如表4中所示，與同樣溫育4小時的對照樣品相比，細菌淀粉酶降低了殘余淀粉量。由淀粉酶降解的淀粉量是18.7mg/管，相當于對照樣品中殘余淀粉的30%。如上所述測試了具有SEQIDNO:2的氨基酸1-486的氨基酸序列的純化的淀粉酶，得到了相同的結果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>重復上述實驗，但是用真菌AMAIZE淀粉酶替換細菌淀粉酶。如表5中所示，與同樣溫育4小時的對照樣品相比，真菌淀粉酶不能夠減少殘余淀粉。這與這種淀粉酶在HFT中產(chǎn)生非常少量的氣體是一致的(參見實施例2)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例5:a-淀粉酶活性使用商業(yè)上可由RocheDiagnostics獲得的目錄號為11876473的AMYK-試劑盒測定a-淀粉酶活性。底物是4，6-亞乙基(G》-對-硝基苯基(G,)-a,D-麥芽庚并唐香(4,6-ethylidene(G7)-p-nitrophenyl(G,)-a,D-maltoheptaoside)(亞乙基-G7PNP)。a-淀粉酶分裂(splitoff)亞乙基-Gn，然后由酶a-葡糖苦酶(試劑盒的部分)在形成葡萄糖和黃色對-硝基酚的情況下，將得到的Gn-p-硝基苯基切割。在405nm,例i口用Konelab30Analyzer(商業(yè)上可由ThermoElectronCorporation獲得)，例如使用2分鐘的測定時間觀察形成對-硝基酚的速率(其為反應速率的量度，從而也是a-淀粉酶活性的量度)。反應條件是溫度37。C,pH:7.15，反應時間5分鐘。優(yōu)選使用含有Brij0.0025%(SigmaB4184)的氯化4丐0.03M作為穩(wěn)定劑?？梢韵鄬τ跇藴式o出a-淀粉酶活性，例如以KNU(S)的單位表示，其按照相對于公知KNU(S)活性的a-淀粉酶標準物確定。更詳細的方法描述(EB-SM-02^.(n)以及KNU(S)TERMAMYLSC標準物可從NovozymesA/S，Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd應要求獲得。實施例6:淀粉酶pH曲線，具有和沒有膽汁鹽這個實驗用于確定三種a-淀粉酶在加入和未加入膽汁鹽時的pH曲線，所述淀粉酶為兩種本發(fā)明的細菌淀粉酶和現(xiàn)有技術的真菌米曲霉淀粉酶。使用的淀粉酶是純化的芽孢桿菌屬淀粉酶(TERMAMYLSC和STAINZYME)，和，用于比較的，純化的米曲霉淀粉酶(來自FUNGAMYL)。這些酶制劑全部在商業(yè)上可由NovozymesA/S，Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd,Denmark獲得。還原糖法酶緩沖液50mM乙酸鹽、50mM咪唑、50mM丙二酸、lmMCaCl2、0.01%TritonX-100。用HCl/NaOH調節(jié)至pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0或7.0。底物緩沖液1.5mg/ml支鏈淀粉(蠟質玉米，例如來自Cerestar的蠟質玉米04201，批號WM5671),50mM乙酸鹽，50mM口米峻，50mM丙二酸，1mMCaCl2。用HCl/NaOH調至理想pH(如上)。在100。C溫育5分鐘。加入或者不力口5mM膽汁鹽(即商業(yè)上可由例如LGCpromochem獲得的?；悄懰徕c(Sodiumtaurocholate),500g/mol)來制備底物緩沖液。用還原糖法檢測淀粉酶活性。簡而言之，在PCR-MTP(Thermo-Fast96，ABgene,目錄號AB-0600)中將50fil酶(在酶緩沖液中稀釋，使其落入方法的線性范圍內)與lOO(il底物緩沖液混合。將MTP，s在37。C溫育15分鐘，然后加入75(J終止溶液(100mM對-羥基苯甲酸酰阱(p-hydroxybenzoicacidhydrazide)，180mM酒石酸鉀鈉，2%NaOH),將板在95。C溫育10分鐘。然后從每個孔中轉移150jil至96孔MTP,監(jiān)測410nm處的吸光度作為淀粉酶活性的量度。結果(兩次測定的平均值)示于下面的表6-9中。表6顯示在沒有膽汁鹽時，在所示pH的每種酶的活性。對于每種酶，最大活性設為100%。表7顯示的與表6相同，但其為存在5mM膽汁鹽的情況。表8表示在沒有膽汁鹽時在所示pH，相對于這個實驗中測定的最大酶活性，每種酶每mg酶蛋白的活性，所述最大酶活性為TERMAMYLSC酶在pH5.0的活性(100%)。因此，相對于這個活性，將每種酶的活性歸一化(normalize)。根據(jù)比活性確定每種酶的酶蛋白的量。表9顯示的與表8相同，但其為存在5mM膽汁鹽的情況。在這里，在存在5mM膽汁鹽時TERMAMYLSC酶在pH5.0時的活性是參照值(100%)。表6:無膽汁鹽時的相對活性<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>這些結果顯示，盡管膽汁鹽似乎輕微地p爭低了淀粉酶活性，但是在存在5mM膽汁鹽時，活性仍然令人滿意。結果還顯示，膽汁鹽不會導致最適pH的改變。結果還顯示，本發(fā)明的每種芽孢桿菌屬淀粉酶在pH7時都具有高于50%的相對活性，對于比較的真菌淀粉酶則并非如此。最后，表8和9表明，至少在這些條件下，來自TERMAMYLSC的淀粉酶具有比其它兩種測試的淀粉酶明顯更高的活性每mg酶。實施例7:在奶牛中的體內試驗一乳產(chǎn)量用28頭奶牛(Holstein)進行了體內試驗，所述奶牛在具有散養(yǎng)畜欄的配備Calan門的畜舍中圏養(yǎng)(AmericanCalan，Northwood,NH),用于測定個體的伺料攝入量。允許奶牛用三周時間適應上述的門。然后根據(jù)預試驗的乳產(chǎn)量將奶牛分群，并隨機指定進行四種處理中的一種。以4x4^立丁方(Latinsquare)設計進行研究。在四個21天階段里測試四種處理，并在每個階段的后7天收集數(shù)據(jù)。以兩個劑量(低劑量=6mg酶蛋白(EP)每kg全混合日糧(TMR)干物質(DM);高劑量=30mgEP/kgTMR干物質)測試細菌TERMAMYLSC淀粉酶(商業(yè)上可由NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd，Denmark獲得)，與未加外源淀粉酶的對照相比較，并與包含真菌淀粉酶的產(chǎn)品AMAIZE(AllTechInc.,Nicholasville，Kentucky,US)比較。AMAIZE的劑量(240DU/kgTMR干物質)基于已公開的試驗(Tricarico等，AnimalScience2005，81:365-374)，所述試驗顯示這是三組測試(240、480和720DU/kgTMR干物質)中最有效的劑量。飲食由TMR組成，所述TMR中包含50%濃縮物、37%玉米青貯、7%苜蓿半干青貯草，和6%苜蓿干草。濃縮物主要由玉米粉、粗小麥粉、含可溶物的干酒糟和大豆粉(SBM)組成。每天隨意(adlibitum)喂奶牛一次TMR，并且每天測量個體的飼料拒食情況(feedrefusal)。奶牛每天擠兩次奶，并通過計算機自動記錄乳產(chǎn)量。在每個階段的第19天和第21天，每天取兩次乳樣品。用近紅外分析(DairyOneLaboratories,UniversityPark,PA,US)分析乳樣品的蛋白質和乳脂肪。如下計算脂肪^f務正的乳(FCM):FCM3.5%=[(0.434xkg乳產(chǎn)量)+(16.216xkg乳脂肪)]。作為實例，對于30kg乳產(chǎn)量和5。/。脂肪/kg的澤西種乳牛(Jerseycow)，F(xiàn)CM3.5%是(0.434x30)+(16.216x1.5)=37.34。使用SAS(1999)的MIXED程序分析所有數(shù)據(jù)，公認的顯著性為P<0.05。用最小二乘法確定不同處理之間的差異。以測定的不同參數(shù)的平均值的形式表示的結果示于表10中，并且也顯示了均值的標準誤差(SEM)值。表10性能參數(shù)對照細菌淀粉酶真菌淀SEM低劑量高劑量粉酶千物質攝入量(DMI)(kg/天)27.0b28.1a'b29.0a28.5a0.45乳(kg/天)43.2b47.1a44.2b45.2ab0.74享L/DMI(kg乳/kgDMI)1.601.681.521.59-乳脂肪(％)2.982.993.093.080,07乳脂肪(kg/天)1.28b1.39a1.35ab1.40a0.0435<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>各行中上標不同的平均值是統(tǒng)計學上有差異的(p<0.05)如表10中所示，低劑量的細菌淀粉酶顯著改進乳產(chǎn)量(kg/天)以及FCM/DMI,報道的最適劑量的真菌淀粉酶則相反。乳脂肪(kg/天)、乳蛋白質(kg/天)，以及3.5。/o脂肪修正的乳(FCMkg/天)都由真菌淀粉酶以及低劑量的細菌淀粉酶顯著改進。實施例8,奶牛的體內試驗一飼料表觀消化率在實施例7中所述體內試驗的階段4結束(conclusion)時，每組中產(chǎn)量最高的六頭牛繼續(xù)食用它們的實驗飲食。使用階段4最后一周的數(shù)據(jù)確定平均每曰攝入量，用同樣的每日量再喂牛8天。從第5天到第8天，每8小時(每天取樣點的時間間隔增加1小時)通過直腸觸診收集排泄物定時采集樣本(300g)，直至每頭牛共收集到12個樣本。在排泄物收集期間，每天取TMR(從每組)和殘渣(從每頭牛)。將所有排泄物、TMR和殘渣樣本(對于每頭牛)匯集到一起，并在60。C強迫通風烘箱里干燥48小時。通過l-mm篩子研磨樣本，并長口Goering,H.K.，VanSoest，P丄,1970,在Foragefibreanalyses(apparatus,reagents,procedures,andsomeapplications),AgricultureHandbookNo.379,Agric.Res.Serv.,USDA,Washington,DC,USA所述分析干物質(DM)、酸性洗滌劑纖維(ADF)和中性洗滌劑纖維(NDF)。還分析樣本的氮(N)(ElementorVarioMaxCNAnalyzer,ElementorAmericasInc.,Mt.Laurel,NJ,US)、淀粉(CumberlandValleyAnalyticalLaboratory),和灰分含量(在馬弗爐中600°C5小時)。使用不可消化的NDF作為標記計算總消化道(totaltract)的表觀消化率。在使用Daisy-II培養(yǎng)箱(AnkomTechnology,Macedon，NY,US)和用對照飲食飼養(yǎng)的牛的瘤胃流體，體外瘤胃培育(Goering和VanSoest，1970)120小時后確定不可消化的NDF。使用SAS(1999)的MIXED程序分析所有數(shù)據(jù)，公認的顯著性為P0.05。用表ll中的最小二乘法連同均值的標準差(SEM)表示消化率數(shù)據(jù)。表1136<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>各行中上標不同的平均值是統(tǒng)計學上有差異的(p<0.05)如表11中所示，與對照樣品相比，低劑量的細菌淀粉酶顯著改進干物質、中性洗滌劑纖維和有機物質的消化率，報道的最適劑量的真菌淀粉酶則相反。對于低劑量的細菌淀粉酶，淀粉和粗蛋白的消化率在數(shù)值上也是最高的，但是與對照組相比，差異不是統(tǒng)計學上顯著的。實施例9:總消化道消化率一使用尼龍袋技術的飼料的瘤胃降解在本研究中使用的酶是細菌TERMAMYLSC淀粉酶(商業(yè)上可由NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd,Denmark獲得)。通過尼龍袋法(Flachowsky，G.,M.Schneider,W.I.Ochrimenko,G.H.Richter,和H.-J.L6hnert，MethodischeHinweisezurA而endungderNylonbeutel-TechnikbeimWiederkauer.SchriftenreihederLehrgangseinrichtungfiirFiitterungsberatungJena-Jemderoda1988，11:20-26;Kurtz,H.,和F.J.Schwarz,Insitu-AbbaubarkeitvonRestpflanzenverschiedenerMaishybridenimReifeverlauf.iJbers.TieremShg.2005,33:111-120;Madsen，J,，和T.Hvelplund，Predictionofinsituproteindegradabilityintherumen.ResultsofaEuropeanringtest.ActaAgric.Scand.，1994，Suppl.25:103-124)確定8種不同飼料(玉米粒、大麥(粗大麥粉)、啤酒麥芽糟、干的糖用甜菜果肉(driedsugarbeetpulp)、玉米青貯、草青貯、干草和全混合日糧(TMR))的瘤胃消失。由基于大麥的啤酒生產(chǎn)中的新鮮德國啤酒麥芽糟冷凍干燥啤酒麥芽糟。如下所述使用同樣的TMR。研磨飼料以模擬牛的咀嚼，并增加樣品均一度。使用3mm篩子研磨玉米粒、大麥和糖用甜菜果肉樣品。將干草、TMR和青貯樣品先切成較小的塊，然后在研磨(5mm篩子)之前凍干(干草除外)。相似地，將啤酒麥芽糟冷凍干燥并用這種方式研磨(5mm篩子)。研究基本由兩個處理組成，即加入50mg酶蛋白(EP)每kg干物質(DM)，和無酶的對照。然而每個處理是雙重的(two-fold),即，在尼龍袋中和在日糧中。將酶溶于蒸餾水(總體積100ml/kgDM)中，并噴灑在日糧(TMR,其由44%玉米青貯、18%草青貯、9%千草和29%基于玉米的濃縮物組成)上以及要在8個尼龍袋系列中的每個進行測試的飼料上。將同樣量的蒸餾水噴灑在對照飼料和對照尼龍袋上。每天向日糧加入酶/水，但是在試驗前向尼龍袋中的飼料加入酶/水，并深度冷凍(-20。C)直至使用。將這些飼料(即日糧以及尼龍袋)分配給三頭未泌乳的牛(GermanHolstein)，每頭在背部瘤胃中裝備瘤胃導管，進行兩個實驗系列，每個系列中每個處理為3頭牛，得到不完全的3x3拉丁方設計。實驗組接受含酶的曰糧以及含酶的尼龍袋，對照組接受未加入酶的日糧和尼龍袋。對于尼龍袋，在每個處理的三頭牛瘤胃中，每次溫育時間放置重復的袋(duplicatebags),其中包含5g不同的飼料，跟蹤DM的消失多至72小時。保持牛處于有空調的關閉畜舍(20。C)內在橡皮墊上，單獨飼養(yǎng)并可以自由取水。實驗持續(xù)2個階段，每階段25天(共50天)；在每個階段中，用前14天進行適應，后ll天使用尼龍袋取樣。每天在7:00h和16:00h喂每頭牛5.5kg(DM)TMR,早晨喂食后2小時喂0.5kg(DM)干草。另外施加100g/d的礦物質預混物。從第22天至第25天，在8:30h從每頭牛通過直腸觸診收集排泄物定時采集樣本(200g)。使用Ti02作為標記以計算總消化道的表觀消化率。作為實例，如果你在飼料中使用l%Ti02，飼料DM攝入量為10kg，并在排泄物中發(fā)現(xiàn)4%Ti02，這對應于2.5kgDM的排泄物量(按照Ti02質量衡算，入=出)，也就是說，飼料的粗消化率為75%(10中消化7.5kg)。結果示于下面的表12-15中，顯示了在溫育時間長達8小時后，來自尼龍袋的玉米粒、大麥、玉米青貯和TMR各自的DM-消失(。/。)。如同本領域通常所見，通過在105。C干燥直至無進一步重量損失(通常為24小時)來確定DM。表16顯示淀粉酶處理對體內營養(yǎng)物表觀消化率(％干物質)的作用。表12(玉米粒)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>各行中上標不同的平均值是統(tǒng)計學上有差異的(p<0.05)表13(大麥)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如表12-15中所明顯表示，在含有較高量淀粉的飼料的溫育中，補加淀粉酶改進了DM消失對于玉米粒(淀粉含量71.9。/。)是顯著的(p0.05)，對于在最初8小時的溫育中大麥(淀粉含量57.6%)和玉米青貯(淀粉含量33.1%)數(shù)值上提高，而對于在最初4小時的溫育的TMR(淀粉含量33.0%)數(shù)值上提高。如可預期的，淀粉酶對不含或者含可忽略量淀粉的四種飼料沒有作用，所述飼料即草青貯、干草、糖用甜菜果肉和哞酒麥芽糟(數(shù)據(jù)未給出)。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如表16中所明顯表示，淀粉酶使TMR中的粗纖維、粗蛋白、有機物和粗脂肪的總消化道(從口到排泄物)表觀消化率在數(shù)值上增加，但是差異不是在統(tǒng)計學上顯著的。不希望受到任何理論的限制，這可以歸因于下述機制中的一種或多種淀粉酶影響瘤胃中的微生物群落，其能夠影響這些其它(非淀粉)組分的降解；淀粉酶可以提供微生物群落生長的能量，使微生物的數(shù)量增加，從而降解其它組分；去除淀粉可以更易于接近其它組分(籠蔽效應(cageeffect))。使用SAS(1999)的MIXED程序分析數(shù)據(jù)，公認的顯著性為P<0.05。用最小二乘法確定不同處理之間的差異。實施例10:奶牛中的體內試驗一細菌淀粉酶和纖維素酶在9個月的飼養(yǎng)試驗中包括兩組(2x220)奶牛(GermanHolstein)，以測試向飼料中加入細菌淀粉酶和纖維素酶組合物的作用。使用的酶是細菌TERMAMYLSC淀粉酶和CELLUCLAST纖維素酶，兩者商業(yè)上均可由NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd，Denmark獲得。CELLUCLAST纖維素酶源自里氏木霉。將牛在具有條縫地板的小畜舍中圈養(yǎng)。實驗階段包括分娩前的三周和分娩后的20周。用全混合日糧(TMR)飼養(yǎng)牛(一天八次)，所述TMR中未補加酶(對照)或者補加淀粉酶(l.6ml/kgTMR，對應于25mg酶蛋白(EP)/kgTMR干物質(DM))和纖維素酶(1.4ml/kgTMR)。在喂養(yǎng)前立即將酶噴灑在TMR上。TMR的主要成分是草青貯、玉米青貯和濃縮物(在農場上混合)，而干物質含量為約50%。將動物分成兩組，對照組和處理組。我們試圖通過將具有相似的期望性能的個體牛分配到一個組中，來相似地構成兩個組。這可以根據(jù)下述原則完成初次分娩依據(jù)(after)父親(father)(屬于牛的正常飼養(yǎng)程序)預計的乳產(chǎn)量，而多次分娩依據(jù)哺乳次數(shù)和先前的哺乳量預計的乳產(chǎn)量。每天在旋轉式擠奶間中對牛擠3次奶。在試驗中定期評價個體的乳產(chǎn)量和組成以及背脂厚度。酶處理對乳產(chǎn)量的影響在圖1中顯示為處理組和對照組之間乳產(chǎn)量(kg/d)的差異作為分娩后天數(shù)的函數(shù)。在早期泌乳階段，組合使用淀粉酶和纖維素酶導致乳產(chǎn)量增加(而乳組成沒有任何變化；數(shù)據(jù)未顯示)。從第1天至第14天的差異是顯著的，而在泌乳晚期，作用不再顯著。兩組的背脂厚度在圖2中顯示為分娩后天數(shù)的函數(shù)(經(jīng)過歸一化，將分娩前第28天的背脂厚度水平設為100%)。在試驗期間，與對照O)相比，酶處理組(o)具有更高水平的背脂厚度，而在分娩后第140天，作用在統(tǒng)計學上是顯著的(p二0.02)。實施例11:奶牛的體內試驗乳產(chǎn)量、消化率、尼龍袋實驗如實施例7-10中所述，在奶牛體內對具有SEQIDNO:2的氨基酸1-486的氨基酸序列的純化的細菌淀粉酶進行了體內測試。獲得了相同的結果。實施例12:飼料添加劑組合物將TERMAMYLSC淀粉酶與每kg具有下述組成的維生素和礦物質預混物(也稱作礦物質飼料)混合14%鈣、9.5%鈉、6%磷、5%鎂、800,000IU維生素A、120,000IU維生素D3、3000mg維生素E、130mg維生素Bl、78mg維生素B2、70mg維生素B6、525昭維生素B12、21mg葉酸、260mgD-泛酸釣、2500mg煙酸、130000嗎生物素、8500mg鋅、4000mg錳、1200mg銅、100mg碘、21mg鈷、50mg硒。提到的百分比為w/w。包括的TERMAMYLSC淀粉酶的量對應于1.8g酶蛋白/kg預混物。以每個動物每天100g的速率喂預混物。假定每天的飼料消耗量是30kg(DM)。內，因為這些方面意欲作為本發(fā)明幾個方面的說明。任何等同的方面意欲在本發(fā)明的范圍之內。實際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的那些之外，本發(fā)明的多種修改對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附的權利要求的范圍內。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準。本文引用了多篇參考文獻，其公開的內容通過引用整體并入。權利要求1.細菌淀粉酶在牛亞科動物的飼料中的用途。2.權利要求l的用途，用于改進乳產(chǎn)量、體重增加和/或詞料轉化率。3.權利要求l的用途，用于改進乳產(chǎn)量、表觀消化率，和/或使用尼龍袋法的飼料干物質消失。4.權利要求1的用途，其與纖維素酶組合使用。5.權利要求4的用途，用于改進乳產(chǎn)量和/或背脂厚度。6.細菌淀粉酶在用于牛亞科動物飼料的組合物的制備中的用途。7.制備用于牛亞科動物的飼料中的組合物的方^，所述方法包括向至少一種飼料組分中添加細菌淀粉酶的步驟。8.權利要求7的方法，所述方法還包括添加纖維素酶。9.增加牛亞科動物乳產(chǎn)量的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌淀粉酶的步驟。10.權利要求9的方法，其還包括向動物飼料中添加纖維素酶。11.增加牛亞科動物的背脂厚度的方法，所述方法包括向動物飼料中添加與纖維素酶組合的細菌淀粉酶的步驟。12.增加牛亞科動物的體重增加和/或飼料轉化率的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌淀粉酶的步驟。13.改進牛亞科動物的飼料干物質的消失和/或表觀消化率的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌淀粉酶的步驟。14.飼料添加劑組合物，其包含細菌淀并分酶，連同選自維生素和礦物質的至少一種額外組分。15.權利要求14的飼料添加劑，其還包含纖維素酶。16.權利要求15的組合物，其為礦物質預混物、維生素預混物，或包括維生素和礦物質的預混物。17.組合物，其包含細菌淀粉酶，以及至少一種選自干草、草料、粗詞料和/或濃縮物的額外的組分。18.權利要求17的組合物，其還包含纖維素酶。19.權利要求17的組合物，其為富含淀粉酶的濃縮物。20.權利要求17的組合物，其為富含淀粉酶的全混合日糧。21.權利要求17-20中任一項的組合物，其包含玉蜀黍和/或高粱。22.權利要求21的組合物，其包含玉蜀黍。全文摘要本發(fā)明涉及至少一種細菌淀粉酶在牛亞科反芻動物的飼料中的用途，特別是用于改進乳產(chǎn)量，所喂飲食的表觀消化率、飼料干物質的消失、體重增加，和/或飼料轉化率(FCR)。牛類動物的實例是奶牛和肉用牛。本發(fā)明還涉及這些淀粉酶在飼料和飼料添加劑如預混物、濃縮物和全混合日糧(TMR)中的用途。淀粉酶可以與纖維素酶組合使用，以改進乳產(chǎn)量和/或背脂厚度。優(yōu)選的淀粉酶源自Bacillushalmapalus、地衣芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌，并且優(yōu)選與嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶同源。文檔編號A23K1/18GK101489412SQ200780026592公開日2009年7月22日申請日期2007年7月12日優(yōu)先權日2006年7月13日發(fā)明者威比·格里特索,沃爾夫岡·斯坦伯格,艾爾姆加德·艾米格,莫滕·費希爾申請人:諾維信公司;DsmIp資產(chǎn)公司