紅王子錦帶單倍體植株再生的方法
【專利摘要】紅王子錦帶單倍體植株再生的方法，本發(fā)明涉及一種花藥單倍體植株再生方法。本發(fā)明是要解決目前紅王子錦帶繁殖培育周期長、育苗率低、再生植株的遺傳穩(wěn)定性差的技術(shù)問題。方法：采集紅王子錦帶花蕾低溫預(yù)處理后，接種到第一改良MS培養(yǎng)中暗培養(yǎng)，得到愈傷組織或花粉胚，再在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)誘芽，得到分化芽，分化芽轉(zhuǎn)入第三改良MS培養(yǎng)基培養(yǎng)得到分化苗，分化苗接入到第四改良MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到單倍體再生植株；本發(fā)明的誘導(dǎo)分化率達57%以上，育種周期為90～130天，可用于苗木的自動化生產(chǎn)。
【專利說明】紅王子錦帶單倍體植株再生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種花藥單倍體植株再生方法。
技術(shù)背景
[0002]紅王子錦帶(Weigela florida cv.’ Red Prince’)系錦帶花的一個園藝變種，為忍冬科錦帶花屬落葉開張性灌木，為優(yōu)良的夏初開花樹種，觀賞價值較高，具有生長快、花期長、抗逆性強等優(yōu)良性狀，并且對氯化氫氣體具有極強的吸收作用，是極具潛力的抗污染綠化樹種。尤其是在冬季漫長的北方城市，像紅王子錦帶這樣能夠度過寒冬期的國外引種極其少見，因此對其育種方面進行深入的研究極為必要。木本植物由于長期異花授粉，植株雜合性高，影響了其優(yōu)良性狀的延續(xù)，若采用種子繁殖不能保持植株優(yōu)良性狀，后代會產(chǎn)生性狀分離。采用常規(guī)方法進行遺傳改良，要經(jīng)五至六代自交才能獲得純系，耗費時間很長，并且受季節(jié)限制，育苗率低；另外，自然界產(chǎn)生的單倍體頻率很低，一般在0.002%~
0.02%，故利用自然產(chǎn)生的單倍體，經(jīng)人工加倍獲得純系的方法也不能滿足其在育種實踐中的廣泛應(yīng)用，再生植株的遺傳穩(wěn)定性差，嚴重阻礙這一優(yōu)良樹種的推廣發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是為了解決目前紅王子錦帶繁殖培育周期長、育苗率低、再生植株的遺傳穩(wěn)定性差的技術(shù)問題，而提供紅王子錦帶單倍體植株再生的方法。
[0004]本發(fā)明的紅王子錦帶單倍體植株再生的方法按以下步驟進行:
[0005]一、采集紅王子錦帶花蕾，裝入封口袋中，放在溫度為IO~15 °C的冰箱內(nèi)保持I~2小時；
[0006]二、將經(jīng)步驟一處理的花蕾用75%的酒精滅菌15~30s，然后用濾紙吸干，取出花藥接種到第一改良MS培養(yǎng)基中，在溫度為27~29°C的條件下暗培養(yǎng)25~30天，得到愈傷組織或花粉胚；其中第一改良MS培養(yǎng)基是在1/3~IMS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基中加入
0.5~2.0mg的6-ΒΑ、0.5~2.0mg的NAA、20g的鹿糖和6g的瓊脂制成的，該第一改良MS培養(yǎng)基的pH為5.8~5.9 ;
[0007]三、將步驟二得到的愈傷組織或花粉胚轉(zhuǎn)移到溫度為24~26°C的光照培養(yǎng)箱中，光照培養(yǎng)7~8天；其中光照培養(yǎng)時，采用日光燈做光源，每天光照12~14h，光照強度為15001x ~20001x ；
[0008]四、將經(jīng)步驟三處理的愈傷組織或花粉胚接入第二改良MS培養(yǎng)基中，再放入溫度為28~31°C的光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)20~30天，采用日光燈作光源，光照強度為15001x~20001x，每天光照10h，黑暗14h，得到分化芽；其中第二改良MS培養(yǎng)基是在大量元素均減半的MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入0.5~1.5mg/L的2，4_D、0.5mg/L6_BA、20g的蔗糖和6g的瓊脂制成的；
[0009]五、將步驟四得到的分化芽轉(zhuǎn)入第三改良MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~25天，得到分化苗；其中第三改良MS培養(yǎng)基是在大量元素均減半的MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入1.5mg/L的2，4-D、0.5mg/L6-BA、20g的鹿糖和6g的瓊脂制成的；
[0010]六、將步驟五得到的分化苗接入到第四改良MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~5周，得到單倍體再生植株；其中第四改良MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入1.0mg6-BA、2.0mg的NAA、20g的鹿糖和6g的瓊脂制成的。
[0011]上述的紅王子錦帶單倍體植株再生的方法還可以將步驟一用以下操作代替:一、采集紅王子錦帶花蕾，用醋酸洋紅染色法進行細胞學(xué)觀察，確定小孢子發(fā)育時期，選擇處于單核期的花蕾，裝入封口袋中，放在溫度為10~15°C的冰箱內(nèi)保持I~2小時。
[0012]本發(fā)明以紅王子錦帶花藥作為外植體進行誘導(dǎo)，產(chǎn)生愈傷組織及花粉胚，然后經(jīng)光下再分化的繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根、不定芽，進而形成根、莖、葉的完整單倍體結(jié)構(gòu)，此過程開創(chuàng)了紅王子錦帶花藥誘導(dǎo)單倍體的先河。不同的植物種類在不同的生長發(fā)育階段對培養(yǎng)基的要求不同。本發(fā)明在紅王子錦帶的誘芽階段，對MS培養(yǎng)基進行了改良，采用在濃度較低的MS培養(yǎng)基中加入6-BA和2，4-D，誘導(dǎo)愈傷組織再分化，獲得較好的分裂效果。獲得了高效的誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)分化率達57%以上，更利于實現(xiàn)苗木的自動化生產(chǎn)。
[0013]同時這種經(jīng)花藥愈傷組織及胚狀體培育而成的具有根、莖、葉的完整單倍體植株，育種周期為90~130天，周期短，遺傳性狀穩(wěn)定，經(jīng)染色體加倍后可直接得到純合二倍體，這種純合二倍體在遺傳上非常穩(wěn)定，不發(fā)生性狀分離，這樣不僅能大大縮短周期，加快育種進程，還能快速、高效的選育出新品種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是試驗I的步驟二得到的愈傷組織照片；
[0015]圖2是試驗I的步驟二得到的的花粉胚照片；
[0016]圖3是試驗I得到的單倍體再生植株照片。
`[0017]圖4是試驗2得到的再生植株根尖細胞染色照片。
【具體實施方式】
[0018]【具體實施方式】一:本實施方式的紅王子錦帶單倍體植株再生的方法按以下步驟進行:
[0019]一、采集紅王子錦帶花蕾，裝入封口袋中，放在溫度為IO~15 °C的冰箱內(nèi)保持I~2小時；
[0020]二、將經(jīng)步驟一處理的花蕾用75%的酒精滅菌15~30s，然后用濾紙吸干，取出花藥接種到第一改良MS培養(yǎng)基中，在溫度為27~29°C的條件下暗培養(yǎng)25~30天，得到愈傷組織或花粉胚；其中第一改良MS培養(yǎng)基是在1/3~IMS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基中加入
0.5~2.0mg的6-ΒΑ、0.5~2.0mg的NAA、20g的鹿糖和6g的瓊脂制成的，該第一改良MS培養(yǎng)基的pH為5.8~5.9 ;
[0021]三、將步驟二得到的愈傷組織或花粉胚轉(zhuǎn)移到溫度為24~26°C的光照培養(yǎng)箱中，光照培養(yǎng)7~8天；其中光照培養(yǎng)時，采用日光燈做光源，每天光照12~14h，光照強度為15001x ~20001x ；
[0022]四、將經(jīng)步驟三處理的愈傷組織或花粉胚接入第二改良MS培養(yǎng)基中，再放入溫度為28~31°C的光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)20~30天，采用日光燈作光源，光照強度為15001x~20001x，每天光照10h，黑暗14h，得到分化芽；其中第二改良MS培養(yǎng)基是在大量元素均減半的MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入0.5~1.5mg/L的2，4_D、0.5mg/L6_BA、20g的蔗糖和6g的瓊脂制成的；
[0023]五、將步驟四得到的分化芽轉(zhuǎn)入第三改良MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~25天，得到分化苗；其中第三改良MS培養(yǎng)基是在大量元素均減半的MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入1.5mg/L的2，4-D、0.5mg/L6-BA、20g的鹿糖和6g的瓊脂制成的；
[0024]六、將步驟五得到的分化苗接入到第四改良MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~5周，得到單倍體再生植株；其中第四改良MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入1.0mg6-BA、
2.0mg的NAA、20g的鹿糖和6g的瓊脂制成的。
[0025]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是步驟二中所述的第一改良MS培養(yǎng)基的成分及含量如表1所不；其它與【具體實施方式】一相同。
[0026]表1第一改良MS培養(yǎng)基的成分
【權(quán)利要求】
1.紅王子錦帶單倍體植株再生的方法，其特征在于該方法按以下步驟進行: 一、采集紅王子錦帶花蕾，裝入封口袋中，放在溫度為10~15°C的冰箱內(nèi)保持I~2小時； 二、將經(jīng)步驟一處理的花蕾用75%的酒精滅菌15~30s，然后用濾紙吸干，取出花藥接種到第一改良MS培養(yǎng)基中，在溫度為27~29°C的條件下暗培養(yǎng)25~30天，得到愈傷組織或花粉胚；其中第一改良MS培養(yǎng)基是在1/3~IMS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基中加入0.5~2.0mg的6-ΒΑ、0.5~2.0mg的NAA、20g的蔗糖和6g的瓊脂制成的，該第一改良MS培養(yǎng)基的pH為5.8~5.9 ; 三、將步驟二得到的愈傷組織或花粉胚轉(zhuǎn)移到溫度為24~26°C的光照培養(yǎng)箱中，光照培養(yǎng)7~8天；其中光照培養(yǎng)時，采用日光燈做光源，每天光照12~14h， 光照強度為15001x ~20001x ； 四、將經(jīng)步驟三處理的愈傷組織或花粉胚接入第二改良MS培養(yǎng)基中，再放入溫度為28~31°C的光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)20~30天，采用日光燈作光源，光照強度為15001x~20001x，每天光照10h，黑暗14h，得到分化芽；其中第二改良MS培養(yǎng)基是在大量元素均減半的MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入0.5~1.5mg/L的2，4_D、0.5mg/L6_BA、20g的蔗糖和6g的瓊脂制成的； 五、將步驟四得到的分化芽轉(zhuǎn)入第三改良MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~25天，得到分化苗；其中第三改良MS培養(yǎng)基是在大量元素均減半的MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入1.5mg/L的2，4-D、0.5mg/L6-BA、20g的鹿糖和6g的瓊脂制成的； 六、將步驟五得到的分化苗接入到第四改良MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~5周，得到單倍體再生植株；其中第四改良MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)基加入1.0mg6-BA、2.0mg的NAA、20g的蔗糖和6g的瓊脂制成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的步驟一紅王子錦帶單倍體植株再生的方法，其特征在于步驟一中在溫度為12~14°C的冰箱內(nèi)保持1.1~1.8小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的步驟一紅王子錦帶單倍體植株再生的方法，其特征在于步驟二中在暗培養(yǎng)的溫度為27.5~28°C，暗培養(yǎng)的時間為28~29天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的步驟一紅王子錦帶單倍體植株再生的方法，其特征在于步驟三中光照培養(yǎng)箱的溫度為25~25.5°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的步驟一紅王子錦帶單倍體植株再生的方法，其特征在于步驟四中光照培養(yǎng)箱的溫度為29~30°C，培養(yǎng)時間為25~28天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的步驟一紅王子錦帶單倍體植株再生的方法，其特征在于步驟五中培養(yǎng)時間為23~24天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的步驟一紅王子錦帶單倍體植株再生的方法，其特征在于步驟一用以下操作代替:采集紅王子錦帶花蕾，用醋酸洋紅染色法進行細胞學(xué)觀察，確定小孢子發(fā)育時期，選擇處于單核期的花蕾，裝入封口袋中，放在溫度為10~15°C的冰箱內(nèi)保持I~2小時。
【文檔編號】A01H4/00GK103749308SQ201410041020
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】王丹, 李晶, 舒鈺, 王承義, 孫海濱, 蒙寬宏, 孫一萌, 崔松, 劉彥斌, 張玲 申請人:黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所