一種一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于煙草育種和植物組培【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法。該方法包括以下步驟：（1）低溫預(yù)處理花蕾、（2）消毒滅菌、（3）接種于改良MS培養(yǎng)基培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明誘導(dǎo)獲得煙草單倍體的技術(shù)思路是：花藥脫分化→形成胚狀體→直接形成完整花粉植株。由于這種培養(yǎng)方式更接近于植物體的發(fā)育過(guò)程，因而誘導(dǎo)單倍體植株的頻率較高，從一個(gè)花藥上可以誘導(dǎo)出多個(gè)花粉植株；同時(shí)采用本發(fā)明獲得單倍體植株所需誘導(dǎo)時(shí)間較短，可以在一個(gè)月的時(shí)間里得到單倍體植株，整體的培養(yǎng)步驟操作也較為簡(jiǎn)便，因而在煙草雜交培育育種方面具有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于煙草育種和植物組培【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種一步法誘導(dǎo)煙草單倍體 植株的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 花藥培養(yǎng)是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生單倍體植株的育種手段之一，一直受到遺傳育種界的重 視。該方法起源于20世紀(jì)60年代，是指將未成熟的花藥接種在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)、 經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化形成為單倍體植株的過(guò)程。通過(guò)花藥培養(yǎng)技術(shù)可以獲得單倍體植株，單倍體 植株的隱性性狀能在早代就表現(xiàn)出來(lái)，因此可以及早對(duì)基因進(jìn)行篩選和淘汰，通過(guò)對(duì)單倍 體進(jìn)行染色體加倍，可以獲得性狀十分穩(wěn)定的純合的二倍體，與常規(guī)的雜交育種相比，能夠 擴(kuò)大變異范圍、加速優(yōu)異性狀的轉(zhuǎn)移與穩(wěn)定、快速獲得基因純合的種質(zhì)、提高育種工作的選 擇效率、明顯縮短育種年限?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在禾本科、茄科、十字花科作物以及許多藥 用植物的育種中得到了廣泛的應(yīng)用。目前，已經(jīng)有三百余種植物花藥培養(yǎng)獲得成功，包括小 麥、大麥、玉米、水稻、高粱、大豆、煙草、油菜、辣椒、黃瓜、蘋(píng)果、葡萄、人參、地黃、枸杞等。早 在1974年，我國(guó)科學(xué)家就利用單倍體技術(shù)培育出了世界上第一個(gè)單倍體作物新品種一一 煙草單育1號(hào)。
[0003] 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，育種技術(shù)也不斷推陳出新，誘變技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記輔助選擇、種質(zhì)抗病性的快速鑒定、重要基因的克隆與驗(yàn)證等多項(xiàng)技 術(shù)都已經(jīng)廣泛用于種質(zhì)資源創(chuàng)新、雜交優(yōu)勢(shì)利用、品種選育等工作中。而近三十年，花藥培 養(yǎng)技術(shù)卻未能在煙草育種中得到廣泛的應(yīng)用。宄其原因，可能與花藥培養(yǎng)過(guò)程操作復(fù)雜、對(duì) 研宄人員的無(wú)菌操作技術(shù)要求較高有一定關(guān)系。為了便于充分發(fā)揮花藥培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)， 將其廣泛運(yùn)用于作物遺傳分析、功能基因分析等育種實(shí)踐中，有必要簡(jiǎn)化花藥培養(yǎng)創(chuàng)制單 倍體、雙單倍體群體等特殊種質(zhì)的方法體系過(guò)程，以便花藥培養(yǎng)技術(shù)能夠和其他各項(xiàng)技術(shù) 相結(jié)合，廣泛應(yīng)用于育種實(shí)踐中。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法，相較于現(xiàn)有的花藥 培養(yǎng)技術(shù)，能夠簡(jiǎn)化花藥培養(yǎng)技術(shù)操作的復(fù)雜程度，較為快速的培養(yǎng)出煙草單倍體植株，較 好的應(yīng)用到煙草的育種實(shí)踐中。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0006] 一種一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法，包括以下步驟： (1)從煙草花序上選取無(wú)病蟲(chóng)、生長(zhǎng)良好、花冠剛剛伸出花萼的花蕾，花萼長(zhǎng)度不超過(guò) lcm，將取好的花蕾迅速封裝、編號(hào)，低溫預(yù)處理，備用；一般而言，為獲得合適的煙草花序， 需要提前3~4個(gè)月時(shí)間播種所需的煙草品種； 所述低溫處理是指將花蕾置于〇°C ~4°C條件下低溫預(yù)處理2~3天；優(yōu)選4°C低溫預(yù)處 理2天； 本發(fā)明中具體以煙草品種NC1071、中煙100與云煙87的雜交Fl的兩個(gè)煙草材料進(jìn)行 了實(shí)驗(yàn)； (2) 將步驟（1)中低溫預(yù)處理后花蕾，在超凈工作臺(tái)內(nèi)消毒滅菌，獲得無(wú)菌花藥，具體順 序?yàn)?，向花蕾表面噴灑體積分?jǐn)?shù)為70~75%的酒精消毒一縱切剖開(kāi)花蕾，剝?nèi)』ㄋ幰换ㄋ幗?入體積分?jǐn)?shù)為70~75%的酒精消毒50~70s (優(yōu)選60s)-無(wú)菌水沖洗消毒后花藥3次以上， 每次 3~5min ; (3) 將步驟（2)中消毒后花藥接種于改良MS培養(yǎng)基上25~27°C培養(yǎng)，培養(yǎng)分為暗培養(yǎng) 和光培養(yǎng)兩個(gè)過(guò)程，接種后首先于無(wú)光條件下暗培養(yǎng)1〇~14 d，然后轉(zhuǎn)到弱光條件下培養(yǎng)至 煙草小植株，所述弱光條件具體為每天光照8~10h，光照強(qiáng)度50~100 Ix ; 所述改良MS培養(yǎng)基為含有40g/L蔗糖的MS基本培養(yǎng)基。
[0007] 本發(fā)明相較于現(xiàn)有的較為復(fù)雜的煙草花藥單倍體培養(yǎng)技術(shù)而言，具有較為明顯的 技術(shù)優(yōu)勢(shì)，具體表現(xiàn)在：（1)消毒步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便且安全性高；現(xiàn)有技術(shù)中的針對(duì)花蕾、 花藥消毒時(shí)所使用的藥劑主要是次氯酸鈉（NaClO)或升汞（HgC12)，而這兩種藥劑不僅對(duì) 人體具有較大的毒性和傷害性，而且對(duì)于花藥的損失也較大，嚴(yán)重影響了后續(xù)的組培效果， 本發(fā)明通過(guò)改進(jìn)采用普通的酒精消毒藥劑，不僅無(wú)菌效果得到了較好的保障，而且對(duì)人無(wú) 毒無(wú)害，對(duì)與花藥也具有較小的損傷，確保了較好的組培效果；（2)花藥的成活率較高；本 發(fā)明通過(guò)將采摘后的花藥進(jìn)行低溫預(yù)處理，較好的提高了后期組培時(shí)的花藥成活率，并且 能夠較好的調(diào)整花藥培養(yǎng)的操作時(shí)間，因而具有較好的推廣應(yīng)用性；（3)培養(yǎng)基制備簡(jiǎn)單 易操作；在MS基本培養(yǎng)基中調(diào)整蔗糖濃度即可，因而易于制備。
[0008] 總體而言，本發(fā)明誘導(dǎo)獲得煙草單倍體的技術(shù)思路是：花藥脫分化一形成胚狀體 -直接形成完整花粉植株，與現(xiàn)有的獲得單倍體的技術(shù)思路(脫分化一形成愈傷組織一誘 導(dǎo)叢生芽一誘導(dǎo)根）是不同的。由于這種培養(yǎng)方式更接近于植物體的發(fā)育過(guò)程，因而誘導(dǎo) 單倍體植株的頻率較高，例如，對(duì)于NC1071、中煙100與云煙87的雜交Fl代這兩個(gè)材料， 花藥單倍體的誘導(dǎo)率最高可以高達(dá)450%，亦即：從一個(gè)花藥上可以誘導(dǎo)出多個(gè)花粉植株； 同時(shí)采用本發(fā)明獲得單倍體植株所需誘導(dǎo)時(shí)間較短，可以在一個(gè)月的時(shí)間里得到單倍體植 株，整體的培養(yǎng)步驟操作也較為簡(jiǎn)便，因而在煙草雜交育種、快速選擇純化后代中具有較好 的推廣應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為本發(fā)明誘導(dǎo)煙草單倍體植株過(guò)程中各階段煙草植株情況，其中：A.取花冠 剛剛伸出花萼(長(zhǎng)度不超過(guò)Icm)的花蕾低溫預(yù)處理后，表面滅菌；B.取花藥置于培養(yǎng)基上 無(wú)菌培養(yǎng)；C.花藥經(jīng)胚狀體途徑，形成花粉苗叢；D.花粉苗無(wú)在成苗過(guò)程自發(fā)長(zhǎng)出茁壯的 根；E.將花粉苗叢分切成單個(gè)的花粉苗，轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中；F.煙草單倍體植株。
[0010] 圖2為誘導(dǎo)成功的煙草單倍體植株葉片顯微圖像，從圖中可以看出氣孔保衛(wèi)細(xì)胞 中的葉綠體數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，在具體介紹各實(shí)施例前，首先對(duì) 本發(fā)明中所用到的部分實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)藥劑簡(jiǎn)要介紹如下。
[0012] 改良MS培養(yǎng)基：配制時(shí)，溶劑為水，溶質(zhì)采用Sigma公司出產(chǎn)的MS basial medium (with vitamin)，用量為4.4 g·!/1，pH調(diào)節(jié)至5.8~6.0,附加40 g .171的鹿糖。凝固劑采 用瓊脂，濃度為8 g · L'
[0013] 實(shí)驗(yàn)材料：NC1071、中煙100與云煙87雜交Fl代。
[0014] 其中，NC1071是美國(guó)北卡羅來(lái)納州大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站育成的烤煙品種，于1995年由 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研宄所引進(jìn)。其特征是高抗黑脛病0號(hào)小種，中感根結(jié)線蟲(chóng)病。
[0015] 中煙100是中國(guó)煙草遺傳育種研宄(北方）中心以?xún)?yōu)質(zhì)抗病為主攻方向，采用優(yōu)質(zhì) 品種NC82為中心親本與多抗性互補(bǔ)親本9201雜交，再用NC82回交5代后，用系譜法定向 選擇培育而成的優(yōu)質(zhì)多抗烤煙新品種。
[0016] 云煙87是云南省煙草科學(xué)研宄所、中國(guó)煙草育種研宄(南方）中心選育成的雜交 種。2000年12月通過(guò)國(guó)家品種審定委員會(huì)審定?？购谇徊。锌鼓戏礁Y(jié)線蟲(chóng)病。
[0017] 主要儀器設(shè)備： 超凈工作臺(tái)（垂直單向流）VS-1300L-U，生產(chǎn)廠家：蘇州安泰； 型號(hào)為MGC-300H的光照培養(yǎng)箱，生產(chǎn)廠家：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。 實(shí)施例
[0018] 本實(shí)施例分別以NC1071、中煙100與云煙87雜交Fl代這兩個(gè)材料進(jìn)行了煙草植 株的單倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)要介紹如下。
[0019] -步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法，包括以下步驟： (1)提前3~4個(gè)月時(shí)間播種所需的煙草品種。
[0020] 大田種植NC1071 :種植地點(diǎn)為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研宄所許昌試驗(yàn)田；種植時(shí) 間：2014年3月初播種，5月1日前后移栽，6月中旬到7月初，采摘花蕾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0021] 室內(nèi)培養(yǎng)中煙100與云煙87雜交Fl代，成苗后，移栽到溫室的花盆內(nèi)，大約2個(gè) 月左右即可采花蕾用于實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)煙草單倍體植株實(shí)驗(yàn)時(shí)間與大田種植的NC1071品種同 步進(jìn)行。
[0022] 實(shí)驗(yàn)中，選擇煙草花粉時(shí)，在煙草初花時(shí)，選天氣晴朗的時(shí)間，從煙草花序上選取 無(wú)病蟲(chóng)、生長(zhǎng)良好、花冠剛剛伸出花萼的花蕾，花萼長(zhǎng)度不超過(guò)lcm，將取好的花蕾用塑料自 封袋迅速封裝、編號(hào)，置于冰盒上，帶回實(shí)驗(yàn)室；低溫預(yù)處理，備用； 所述低溫處理是指將花蕾置于〇~4°C條件下低溫預(yù)處理2~3天；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，優(yōu)選4°C 低溫預(yù)處理2天；花藥生物活性損失較小，成活率較高，基本無(wú)影響。
[0023] (2)將步驟（1)中低溫預(yù)處理后花蕾，超凈工作臺(tái)滅菌，具體順序?yàn)?，向花蕾表面?灑體積分?jǐn)?shù)為70~75%的酒精消毒一鑷子、解剖刀縱切剖開(kāi)花蕾，從花絲上剝?nèi)』ㄋ幰换ㄋ?浸入體積分?jǐn)?shù)為70~75%的酒精消毒50~70s (操作中，為便于計(jì)時(shí)，通常優(yōu)選60s)，消毒過(guò) 程中輕輕晃動(dòng)使其消毒充分一無(wú)菌水沖洗消毒后花藥3次以上，每次3~5min ; (3)將步驟（2)中消毒后花藥接種于改良MS培養(yǎng)基上25~27°C培養(yǎng)，接種時(shí)，首先將消 毒后的花藥置于無(wú)菌的玻璃器皿內(nèi)，無(wú)菌濾紙吸干多余的水，然后用無(wú)菌鑷子輕取花藥接 種到改良MS培養(yǎng)基上(含有40g/L蔗糖的MS基本培養(yǎng)基)。操作中，來(lái)自于同一花蕾上的 5個(gè)花藥可以置于同一接種瓶中。
[0024] 培養(yǎng)過(guò)程包括暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)兩個(gè)過(guò)程，接種后首先于無(wú)光條件下暗培養(yǎng)10~14d (優(yōu)選培養(yǎng)l〇d)，然后轉(zhuǎn)到弱光條件下培養(yǎng)，所述弱光條件具體為每天光照8~10h，光照強(qiáng)度 50~1001x ;培養(yǎng)4周左右后花藥會(huì)逐漸發(fā)育成肉眼可見(jiàn)的小植株。
[0025] 培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)記錄、觀察花藥培養(yǎng)過(guò)程，部分培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示。從圖1可以 看出，本發(fā)明誘導(dǎo)單倍體的煙草植株的技術(shù)效果較為突出。
[0026] 對(duì)某批次培養(yǎng)效果較好的花粉誘導(dǎo)成植株的誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表。

【權(quán)利要求】
1. 一種一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 從煙草花序上選取無(wú)病蟲(chóng)、生長(zhǎng)良好、花冠剛剛伸出花萼的花蕾，花萼長(zhǎng)度不超過(guò) lcm，將取好的花蕾迅速低溫預(yù)處理，備用； (2) 將步驟（1)中低溫預(yù)處理后花蕾，消毒滅菌，獲得無(wú)菌花藥； (3) 將步驟（2)中消毒后無(wú)菌花藥接種于改良MS培養(yǎng)基上25~27°C培養(yǎng)， 所述改良MS培養(yǎng)基為含有40g/L蔗糖的MS基本培養(yǎng)基。
2. 如權(quán)利要求1所述一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法，其特征在于，所述低溫預(yù)處 理是指將花蕾置于〇°C ~4°C條件下低溫預(yù)處理2~3天。
3. 如權(quán)利要求1所述一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法，其特征在于，步驟（1)中所述 煙草是指NC1071或中煙100與云煙87的雜交F1品種。
4. 如權(quán)利要求1所述一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法，其特征在于，步驟（2)中所述 消毒滅菌采用體積分?jǐn)?shù)為70~75%的酒精進(jìn)行消毒滅菌。
5. 如權(quán)利要求1所述一步法誘導(dǎo)煙草單倍體植株的方法，其特征在于，步驟（3)中所述 培養(yǎng)分為暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)兩個(gè)過(guò)程，接種后首先于無(wú)光條件下暗培養(yǎng)1〇~14 d，然后轉(zhuǎn)到弱 光條件下培養(yǎng)至煙草小植株，所述弱光條件為每天光照8~10h，光照強(qiáng)度50~100 lx。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104488719SQ201410812965
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】平文麗, 李雪君, 丁燕芳, 孫計(jì)平, 孫煥, 俎煥新, 李旭輝, 李彥平, 朱景偉, 劉翔文, 宋鵬飛 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所