紅系祖細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了紅系祖細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用，其中，該紅系祖細(xì)胞凍存液包含：DMSO；HSA；以及血漿。該凍存液能夠有效保存紅系祖細(xì)胞，并且保存時間長，細(xì)胞復(fù)蘇后增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。
【專利說明】紅系祖細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞凍存領(lǐng)域，特別是干細(xì)胞凍存領(lǐng)域。具體地，涉及紅系祖細(xì)胞凍存 領(lǐng)域。更具體地，涉及紅系祖細(xì)胞凍存液、用于凍存紅系祖細(xì)胞的試劑盒以及凍存紅系祖細(xì) 胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來由于血液來源緊張以及輸血相關(guān)疾病的發(fā)生使人們期望尋找更為安全、充 足的血液來源。研究表明干細(xì)胞在體外能夠誘導(dǎo)分化為紅細(xì)胞可作為新的血液來源。除了 成熟紅細(xì)胞外，紅系祖細(xì)胞也可以替代臨床紅細(xì)胞輸注，發(fā)揮其造血支持治療作用，而且紅 系祖細(xì)胞能夠在體內(nèi)繼續(xù)增殖，對于很多需要反復(fù)輸血治療的患者，有望減少輸血次數(shù)以 及輸血產(chǎn)生的副作用，從而，紅系祖細(xì)胞為臨床血液供應(yīng)提供新的替代途徑。
[0003] 目前臨床用的紅細(xì)胞產(chǎn)品體外保存時間較短，而紅系祖細(xì)胞作為有核細(xì)胞可以在 體外進(jìn)行長期凍存，如果能夠?qū)w外誘導(dǎo)分化的紅系祖細(xì)胞長期的保存，并在復(fù)蘇后保持 其祖細(xì)胞特性，將更有利于臨床輸血應(yīng)用。但是對于紅系祖細(xì)胞這一特定的細(xì)胞類型尚缺 乏凍存方面相關(guān)研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種用于紅系祖細(xì)胞長期保存，并能夠在復(fù)蘇后保持其祖細(xì)胞特性的凍存液。
[0005] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0006] DMSO是常用的細(xì)胞冷凍保存劑，單獨(dú)使用保存紅系祖細(xì)胞存活率僅為 (51. 20± 10. 13) %。因而，發(fā)明人致力于尋找能夠促進(jìn)冷凍保存下紅系祖細(xì)胞存活率的成 分，以便與DMSO聯(lián)用，以便通過其與DMSO協(xié)同作用，達(dá)到能夠長期保存紅系祖細(xì)胞的效 果。例如，發(fā)明人利用DMSO(二甲基亞砜，Dimethyl sulfoxide)協(xié)同海藻糖對體外誘導(dǎo) IOd的臍帶血紅系祖細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率由凍存前的（93. 27±1. 79) %降 至（48. 37±9. 14)%，冷凍保存作用并不理想。然而，人血清白蛋白在冷凍復(fù)蘇過程中能夠 調(diào)節(jié)滲透壓，而血漿中又含有多種營養(yǎng)成分，因而，發(fā)明人嘗試將血漿和HSA(人血清白蛋 白，Human Serum Albumin)與DMSO結(jié)合，制備紅系祖細(xì)胞的凍存液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種凍存液 對凍存細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。
[0007] 因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種紅系祖細(xì)胞凍存液。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)施例，該凍存液包含DMSO ;HSA ;以及血漿。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于 凍存紅系祖細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述DMSO的濃度為2體積％ -10體積％，優(yōu)選10體積％。 由此，對紅系祖細(xì)胞的凍存效果好。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述HSA的濃度為2體積％ -5體積％。由此，有利于在冷 凍復(fù)蘇過程中調(diào)節(jié)滲透壓，對細(xì)胞保護(hù)作用好，并且凍存液成本低。根據(jù)本發(fā)明的一些具體 示例，所述HSA的濃度為2體積％。由此，冷凍復(fù)蘇過程中滲透壓調(diào)節(jié)效果好，從而能夠有 效保護(hù)細(xì)胞，提高細(xì)胞存活率，并且保證凍存液成本。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述血漿的濃度為20體積％ -88體積％。由此，有利于凍存 細(xì)胞的保護(hù)，細(xì)胞復(fù)蘇后增殖能力好。根據(jù)本發(fā)明具體示例，所述血漿的濃度為60體積％。 由此，對細(xì)胞的保護(hù)作用突出，細(xì)胞復(fù)蘇后增殖能力強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述血漿為 自體血漿。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)所述DMSO、HSA和血漿的體積百分?jǐn)?shù)之和小于1時，所述 紅系祖細(xì)胞凍存液進(jìn)一步包含剩余體積的MDM或Stemspan培養(yǎng)基。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于凍存紅系祖細(xì)胞的試劑盒，其 包含前面所述的紅系祖細(xì)胞凍存液。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該試劑盒能夠有效用于凍存紅系 祖細(xì)胞，且細(xì)胞有效保存時間長，復(fù)蘇后細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種凍存紅系祖細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā) 明的實(shí)施例，該方法利用前面所述的紅系祖細(xì)胞凍存液或者試劑盒，凍存所述紅系祖細(xì)胞。 發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，采用該方法凍存紅系祖細(xì)胞，細(xì)胞有效保存時間長，復(fù)蘇后細(xì)胞增殖能 力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每IO5-IO7個紅系祖細(xì)胞采用Iml所述紅系祖細(xì)胞凍存液。 由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)紅系祖細(xì)胞的凍存。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，每IO 6個紅系祖細(xì)胞采用 Iml所述紅系祖細(xì)胞凍存液。由此，細(xì)胞凍存效果好。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，于液氮中進(jìn)行所述凍存。由此，有利于細(xì)胞長期保持，對細(xì) 胞的保護(hù)作用好。
[0016] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0018] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例，經(jīng)凍存液1-4凍存并復(fù)蘇后的紅系祖細(xì)胞的 細(xì)胞增殖曲線（η = 6,即每個樣品的吸光度值均為重復(fù)測定6次后所取的平均值）；
[0019] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例，經(jīng)凍存液5-8凍存并復(fù)蘇后的紅系祖細(xì)胞的 增殖曲線（η = 4,即每個樣品的吸光度值均為重復(fù)測定4次后所取的平均值）。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出。下面通過參考 附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種紅系祖細(xì)胞凍存液。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施 例，該細(xì)胞凍存液凍存的細(xì)胞種類不受特別的限制，只要凍存液能用于長期保存細(xì)胞即可。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該凍存液包含DMSO ;HSA ;以及血漿。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能 夠有效用于保存紅系祖細(xì)胞，并且凍存時間長（凍存時間可達(dá)幾年甚至更長），細(xì)胞復(fù)蘇后 增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述DMSO的濃度為2體積％ -10體積％。由此，對細(xì)胞凍 存效果好。根據(jù)本發(fā)明具體示例，DMSO的濃度為10體積％。由此，對細(xì)胞凍存效果突出。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述HSA的濃度為2體積％ -5體積％。由此，有利于在冷 凍復(fù)蘇過程中調(diào)節(jié)滲透壓，對細(xì)胞保護(hù)作用好，并且凍存液成本低。根據(jù)本發(fā)明的一些具體 示例，所述HSA的濃度為2體積％。由此，冷凍復(fù)蘇過程中滲透壓調(diào)節(jié)效果好，從而能夠有 效保護(hù)細(xì)胞，提高細(xì)胞存活率，并且保證凍存液成本。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述血漿的濃度為20體積％ -88體積％。由此，有利于凍存 細(xì)胞的保護(hù)，細(xì)胞復(fù)蘇后增殖能力好。根據(jù)本發(fā)明具體示例，所述血漿的濃度為60體積％。 由此，對細(xì)胞的保護(hù)作用突出，細(xì)胞復(fù)蘇后增殖能力強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述血漿為 自體血漿。其中，需要說明的是，在本文中所使用的術(shù)語"自體血漿"是指與待凍存的紅系 祖細(xì)胞具有同一來源的血漿。換言之，即該血漿與要利用凍存液凍存的紅系祖細(xì)胞取自同 一個體。由此，對自體的紅系祖細(xì)胞排異作用小，有利于凍存細(xì)胞的保護(hù)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)所述DMSO、HSA和血漿的體積百分?jǐn)?shù)之和小于1時，所述 紅系祖細(xì)胞凍存液進(jìn)一步包含剩余體積的MDM或stemspan培養(yǎng)基。例如，在所述紅系祖 細(xì)胞凍存液中，當(dāng)所述DMSO的濃度為10體積％、所述HSA的濃度為2 %體積，所述血漿的濃 度為88%體積時，所述紅系祖細(xì)胞凍存液不包含頂DM或stemspan培養(yǎng)基；當(dāng)所述DMSO的 濃度為5體積％、所述HSA的濃度為2%體積，所述血漿的濃度為88%體積時，所述紅系祖 細(xì)胞凍存液包含5%體積的MDM或stemspan培養(yǎng)基；當(dāng)所述DMSO的濃度為10體積％、所 述HSA的濃度為2 %體積，所述血漿的濃度為20 %體積時，所述紅系祖細(xì)胞凍存液包含68 % 體積的IMDM或stemspan培養(yǎng)基。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于凍存紅系祖細(xì)胞的試劑盒，其 包含前面所述的紅系祖細(xì)胞凍存液。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該試劑盒能夠有效用于凍存紅系 祖細(xì)胞，且細(xì)胞有效保存時間長，復(fù)蘇后細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種凍存紅系祖細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā) 明的實(shí)施例，該方法利用前面所述的紅系祖細(xì)胞凍存液或者試劑盒，凍存所述紅系祖細(xì)胞。 發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，采用該方法凍存紅系祖細(xì)胞，細(xì)胞有效保存時間長，復(fù)蘇后細(xì)胞增殖能 力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每IO5-IO7個紅系祖細(xì)胞采用Iml所述紅系祖細(xì)胞凍存液。 由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)紅系祖細(xì)胞的凍存。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，每IO 6個紅系祖細(xì)胞采用 Iml所述紅系祖細(xì)胞凍存液。由此，細(xì)胞凍存效果好。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述紅系祖細(xì)胞凍存于液氮中。由此，有利于細(xì)胞長期保 持，對細(xì)胞的保護(hù)作用好。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，本發(fā)明的凍存紅系祖細(xì)胞的方法可以包括：將紅系祖 細(xì)胞與本發(fā)明的紅系祖細(xì)胞凍存液混合后，于液氮中進(jìn)行凍存。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以按照以下步驟凍存紅系祖細(xì)胞：將本發(fā)明的紅 系祖細(xì)胞凍存液與待凍存的紅系祖細(xì)胞混勻后，速移入凍存管，并放入凍存盒中，-70°c梯 度降溫過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)保存。
[0032] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的 實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條 件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀 器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 發(fā)明人分別采用不含血漿的4種凍存液和含有血漿的4種凍存液，對體外誘導(dǎo)擴(kuò) 增的紅系祖細(xì)胞進(jìn)行凍存，比較凍存效果，以便觀察臍血漿對紅系祖細(xì)胞凍存保存的影響， 以及降低DMSO濃度以減少細(xì)胞毒性的可能性。具體如下：
[0035] 1、采用不含血漿的凍存液凍存紅系祖細(xì)胞
[0036] 1. 1、分離獲得臍帶血單個核細(xì)胞，并采用添加了 30?、16?-14?0、轉(zhuǎn)鐵蛋白和地塞 米松的Stemspan培養(yǎng)基（其中SCF的濃度為100ng/mL，IGF-I的濃度為40ng/mL，EPO的濃 度為5U/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為100 μ g/mL，地塞米松的濃度為1 μ M)，于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 在培養(yǎng)液體積為5ml，細(xì)胞密度為2xl06/ml，37攝氏度，5% CO2培養(yǎng)箱的條件下誘導(dǎo)擴(kuò)增紅 系祖細(xì)胞10天。
[0037] 1. 2、紅系祖細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇方法：
[0038] 將上述體外誘導(dǎo)擴(kuò)增第10天獲得的紅系祖細(xì)胞分別采用含HSA的四種凍存液進(jìn) 行凍存，其中四種凍存液的成份如下：
[0039] 凍存液1 :5體積％ DMS0+2體積％ HSA ;
[0040] 凍存液2 :5體積％ DMS0+5體積％ HSA ;
[0041] 凍存液 3 :10 % 體積 DMS0+2 % 體積 HSA ;
[0042] 凍存液 4 :10 體積 ％ DMS0+5 體積 ％ HSA，
[0043] 其中，凍存液1-4中剩余體積的均為IMDM(或Stemspan)培養(yǎng)基。
[0044] 按照以下步驟凍存紅系祖細(xì)胞：將冷凍保存液與細(xì)胞混勻后，速移入凍存管，并放 入凍存盒中，_70°C梯度降溫過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)。其中，每IO 6個紅系祖細(xì)胞采用Iml凍 存液。
[0045] 冷凍保存紅系祖細(xì)胞30d，然后進(jìn)行復(fù)蘇。
[0046] 檢測凍存前后細(xì)胞的存活率、增殖能力，以及復(fù)蘇后細(xì)胞回收率。具體地，凍 存前以及凍存并復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率計(jì)算方法為：【活細(xì)胞數(shù)八活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞 數(shù)）】X100%。復(fù)蘇后細(xì)胞回收率的計(jì)算方法為：（復(fù)蘇后活細(xì)胞數(shù)/凍存時活細(xì)胞 數(shù)）X100%，其中，利用CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所生產(chǎn)，貨號CK04)測定細(xì)胞增 殖能力。
[0047] 1. 3、復(fù)蘇紅系祖細(xì)胞檢查結(jié)果：
[0048] 結(jié)果表明，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率均低于凍存前。具體地，凍存液3和4保存的細(xì)胞存 活率明顯優(yōu)于凍存液1和2,且凍存液3和4之間未見差別（PM). 05)，表明10體積％的DMSO 對紅系祖細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，且不同濃度的HSA對于紅系祖細(xì)胞的保護(hù)作用無顯著 差別（見表1);凍存液3和4的細(xì)胞回收率均達(dá)到90%以上，明顯優(yōu)于凍存液1和2 (見表 2)。
[0049] 表1凍存前后的細(xì)胞存活率檢測結(jié)果（η = 6)
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種紅系祖細(xì)胞凍存液，其特征在于，包含： DMSO ； HSA ;以及 血漿。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述DMSO的濃度為2體積％ -10體 積％，優(yōu)選10體積％。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述HSA的濃度為2體積％ -5體積％， 優(yōu)選2體積％。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述血漿的濃度為20體積％ -88體 積％，優(yōu)選60體積％， 任選地，當(dāng)所述DMSO、HSA和血漿的體積百分?jǐn)?shù)之和小于1時，所述紅系祖細(xì)胞凍存液 進(jìn)一步包含剩余體積的IMDM或Stemspan培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述凍存液，其特征在于，所述血漿為自體血漿。
6. -種用于凍存紅系祖細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的 紅系祖細(xì)胞凍存液。
7. -種凍存紅系祖細(xì)胞的方法，其特征在于， 利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的紅系祖細(xì)胞凍存液或者權(quán)利要求6所述的試劑盒，凍 存所述紅系祖細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，每105-107個紅系祖細(xì)胞采用lml所述紅 系祖細(xì)胞凍存液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，每106個紅系祖細(xì)胞采用lml所述紅系祖 細(xì)胞凍存液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，于液氮中進(jìn)行所述凍存。
【文檔編號】A01N1/02GK104222069SQ201410429678
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】陳琳, 裴雪濤, 習(xí)佳飛, 謝小燕, 周軍年, 李艷華, 岳 文, 房芳, 南雪, 劉大慶 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所