專利名稱：一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存時(shí)必須的一種溶液，長(zhǎng)期以來大量國(guó)內(nèi)外生物細(xì)胞學(xué)術(shù)相關(guān)書籍介紹的常規(guī)凍存液配方和我們長(zhǎng)期所使用的凍存液各組分體積百分比均為細(xì)胞培養(yǎng)液70 80%，牛血清10 30%，二甲基亞砜10%。常規(guī)使用的培養(yǎng)液如MEM、M199、 Eagle和DMEM等均已市場(chǎng)商品化。凍存液的作用是使細(xì)胞均勻地分散在溶液中，給細(xì)胞一個(gè)均勻分布的環(huán)境和空間，同時(shí)供給細(xì)胞生命代謝所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，防止或減少冷凍冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。在長(zhǎng)期的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，廣泛使用上述配方凍存細(xì)胞。大量的實(shí)際生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和大量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，采用這種凍存液所凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后存活率一般在50 70%，成活率比較低。凍存細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇，培養(yǎng)12小時(shí)后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，存活率一般在60%左右；當(dāng)存活率小于50%時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖緩慢，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞比較細(xì)小，長(zhǎng)勢(shì)比較差，基本上不能存活；當(dāng)細(xì)胞存活率在60%左右時(shí)，細(xì)胞分布比較均勻，活細(xì)胞比較多，形態(tài)比較正常，長(zhǎng)滿單層需要6 8天。目前采用的細(xì)胞凍存液的凍存過程與復(fù)蘇效果常規(guī)細(xì)胞凍存液包括以下體積百分比的各組分細(xì)胞培養(yǎng)液70%，小牛血清20%，二甲基亞砜10%。以上各組分混勻即成。細(xì)胞凍存過程培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的VER0、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細(xì)胞一瓶，其細(xì)胞密度約6X IOVcm2、培養(yǎng)面積為225cm2，0. 25%的胰酶消化2分鐘，棄掉胰酶，加入培養(yǎng)液10ml，吹打混勻細(xì)胞懸液，離心1500轉(zhuǎn)/10分鐘，棄上清，加入常規(guī)的凍存液20ml混勻， 2ml/管分裝入潔凈的凍存管；將該凍存管置于2 8°C 2小時(shí)，-20°C 2小時(shí)，_80°C過夜， 然后浸入液氮中長(zhǎng)期保存。細(xì)胞復(fù)蘇過程從液氮中取出凍存的VER0、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細(xì)胞一管 (2ml/管)，置入37°C水浴溶解，離心1500轉(zhuǎn)/10分鐘，棄掉上清，加入20 %小牛血清培養(yǎng)液10ml，置37°C培養(yǎng)；培養(yǎng)12小時(shí)候后觀察，可見有60%左右的細(xì)胞貼壁；未長(zhǎng)成單層細(xì)胞，更換10%的小牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，6 8長(zhǎng)滿單層細(xì)胞后傳代培養(yǎng)。在生物技術(shù)飛速發(fā)展的今天，人們?cè)谏锛夹g(shù)學(xué)及其相關(guān)科學(xué)的研究中，越來越多的運(yùn)用組織細(xì)胞培養(yǎng)繁殖技術(shù)，將有研究意義或有應(yīng)用前景的組織細(xì)胞采用低溫度進(jìn)行長(zhǎng)期的保存，一旦有需要，可以隨時(shí)對(duì)所的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)其完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特征，供生命科學(xué)研究使用，細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的效果是直接影響細(xì)胞增殖成功與否的的關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液，包括下述體積百分比的各組分細(xì)胞培養(yǎng)液5 20%，小牛血清65 80%，二甲基亞砜10%，3% (w/v)谷氨酰胺溶液 1 3%，7.5% (w/v)碳酸氫鈉溶液2 4%。本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液，優(yōu)選包括下述體積百分比的各組分細(xì)胞培養(yǎng)液10 15%，小牛血清70 75%，二甲基亞砜10%，3% (w/v)谷氨酰胺溶液 2%，7.5% (w/v)碳酸氫鈉溶液3%。其中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液可任意選用MEM、M199、Eagle或DMEMD。本發(fā)明還提供所述細(xì)胞凍存液的制備方法，包括混合所述配方比例的細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、二甲基亞砜、3% (w/v)谷氨酰胺溶液和7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液。本發(fā)明所提供的細(xì)胞凍存液可應(yīng)用于細(xì)胞凍存，可提高凍存細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后的存活率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在常規(guī)細(xì)胞凍存液組分基礎(chǔ)上增加了 3% (w/v)谷氨酰胺溶液，還增加了 7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液，同時(shí)調(diào)整了細(xì)胞培養(yǎng)液和小牛血清的含量。使用本發(fā)明改進(jìn)的細(xì)胞凍存液，凍存細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后細(xì)胞存活率能達(dá)到90%以上，比常規(guī)細(xì)胞凍存液所凍存細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后的存活率有明顯的提高，保證了細(xì)胞生長(zhǎng)的質(zhì)量和生物學(xué)特性，縮短了細(xì)胞復(fù)蘇的增殖周期，使復(fù)蘇后的組織細(xì)胞能及時(shí)、保質(zhì)保量地提供給生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1稱取3g谷氨酰胺溶于適量水中，定容成100ml，配制成3% (w/v)的谷氨酰胺溶液。稱取7. 5g的碳酸氫鈉，溶于適量水中，定容成100ml，配制成7. 5% (w/v)的碳酸氫鈉溶液。分別量取IOml的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、75ml的小牛血清、IOml的二甲基亞砜、2ml的 3% (w/v)的谷氨酰胺溶液和3ml的7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液，混合制得本發(fā)明細(xì)胞凍存液。實(shí)施例2
本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于分別量取15ml的M199細(xì)胞培養(yǎng)液、70ml的小牛血清、IOml的二甲基亞砜、2ml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和3ml的7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液，混合制得本發(fā)明細(xì)胞凍存液。實(shí)施例3本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于分別量取5ml的Eagle細(xì)胞培養(yǎng)液、80ml的小牛血清、IOml的二甲基亞砜、2ml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和3ml的7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液，混合制得本發(fā)明細(xì)胞凍存液。實(shí)施例4本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于分別量取20ml的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、65ml的小牛血清、IOml的二甲基亞砜、2ml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和3ml的7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液，混合制得本發(fā)明細(xì)胞凍存液。實(shí)施例5本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于分別量取15ml的M199細(xì)胞培養(yǎng)液、70ml的小牛血清、IOml的二甲基亞砜、Iml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和細(xì)1的7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液，混合制得本發(fā)明細(xì)胞凍存液。實(shí)施例6本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于分別量取5ml的Eagle細(xì)胞培養(yǎng)液、80ml的小牛血清、IOml的二甲基亞砜、3ml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和2ml的7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液，混合制得本發(fā)明細(xì)胞凍存液。比較例1分別量取70ml的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、20ml的小牛血清、IOml的二甲基亞砜，混合制得常規(guī)細(xì)胞凍存液。實(shí)驗(yàn)例1以上實(shí)施例1 6及比較例1所制備的細(xì)胞凍存液，分別按照下述方法進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞凍存過程培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的VERO、BHK-21、MRC_5、2BS和KMB17細(xì)胞各一瓶，其細(xì)胞密度約6 X IOVcm2、培養(yǎng)面積為225cm2，加入pH7. 0的PBS洗細(xì)胞表面一次，用 0. 25%的胰酶消化2分鐘，棄掉胰酶，加入細(xì)胞培養(yǎng)液10ml，吹打混勻細(xì)胞懸液，1500轉(zhuǎn)/ 分離心10分鐘，棄上清，加入15ml的細(xì)胞凍存液，混勻，1. 5ml/管分裝入潔凈凍存管；將凍存管置于2 8°C 2小時(shí)，-200C 2小時(shí)，-SO0C 12小時(shí)，然后浸入液氮中長(zhǎng)期保存。細(xì)胞復(fù)蘇的過程與效果從液氮中取出凍存的VERO、BHK-21、MRC-5、2BS和KMB17 細(xì)胞各一管(1. 5ml/管)，置入39 °C水浴溶解，1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄掉上清，加入 20%小牛血清培養(yǎng)液10ml，置37 °C培養(yǎng)。使用實(shí)施例1 6中本發(fā)明細(xì)胞凍存液所凍存細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)6小時(shí)候后觀察，可見有90 %左右的細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞比較豐滿，活細(xì)胞很多，大小均勻，已長(zhǎng)成單層細(xì)胞；更換10%的小牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2 3天可長(zhǎng)滿單層細(xì)胞。使用比較例1中的常規(guī)細(xì)胞凍存液所凍存細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)12小時(shí)候后觀察，可見有 60%左右的細(xì)胞貼壁，未長(zhǎng)成單層細(xì)胞，更換10%的小牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，需6 8天長(zhǎng)滿單層細(xì)胞。
表1 各細(xì)胞凍存液用于凍存細(xì)胞并經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率
權(quán)利要求
1.種細(xì)胞凍存液，其特征在于，包括下述體積百分比的各組分細(xì)胞培養(yǎng)液小牛血清、5 20%， 65 80%， 10%,甲基亞砜、3 % (w/v)谷氨酰胺溶液 1 3 %， 7. 5 % (w/v)碳酸氫鈉溶液 2 4 %。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述細(xì)胞凍存液，其特征在于，包括下述體積百分比的各組分3% (w/v)谷氨酰胺溶液 2%， 7. 5 % (w/v)碳酸氫鈉溶液 3 %。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞凍存液，其特征在于，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM、 M199、Eagle 或 DMEM。
4.權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞凍存液的制備方法，其特征在于，包括混合所述配方比例的細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、二甲基亞砜、3% (w/v)谷氨酰胺溶液和7. 5% (w/v)碳酸氫鈉溶液。
5.權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞凍存液在提高凍存細(xì)胞復(fù)蘇后存活率中的應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)液小牛血清、10 15%， 70 75%， 10%,甲基亞砜
全文摘要
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用。該細(xì)胞凍存液包括，5～20％(v/v)的細(xì)胞培養(yǎng)液、65～80％(v/v)的小牛血清、10％(v/v)的二甲基亞砜、1～3％(v/v)的3％(w/v)谷氨酰胺溶液和2～4％(v/v)的7.5％(w/v)碳酸氫鈉溶液。本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液用于凍存培養(yǎng)細(xì)胞，提高了凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率，保證了細(xì)胞生長(zhǎng)的質(zhì)量并縮短了細(xì)胞增殖的時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102172237SQ20101062361
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者徐希麗, 林登宇 申請(qǐng)人:北京民海生物科技有限公司