人外周血干細(xì)胞凍存液的配制及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人外周血干細(xì)胞凍存液的配制及使用方法，主要特征在于由羥乙基淀粉代血漿、復(fù)發(fā)氨基酸注射液（18AA-IV）、二甲基亞砜和人血清白蛋白組成干細(xì)胞凍存液，它們的終體積百分含量分別是48.2%、2%、4.8%、20%。該凍存液具有高復(fù)蘇活率（>99%）和可直接靜脈回輸?shù)奶攸c。同時本發(fā)明還提供了上述凍存液的制備和使用方法。具體是無菌環(huán)境下，凍存液各組分按先后順序預(yù)混好后，加入干細(xì)胞懸液并混勻，之后裝入凍存袋冷凍保存。加有凍存液的干細(xì)胞可直接放入-80℃低溫冰箱保存，無需使用程序降溫儀，操作簡便、使用安全。
【專利說明】人外周血干細(xì)胞凍存液的配制及使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于干細(xì)胞生物工程領(lǐng)域。具體涉及一種人外周血干細(xì)胞凍存液的配制及 使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 自體外周血造血干細(xì)胞移植現(xiàn)已成為治療惡性血液病、惡性淋巴瘤、實體瘤等疾 病根治性方法之一。自體外周血干細(xì)胞移植的方法是先用造血干細(xì)胞動員劑將造血干細(xì)胞 動員入外周血中，然后用血細(xì)胞分離機分離采集外周血的單個核細(xì)胞組分。由于是自體外 周血干細(xì)胞移植，患者在動員和分離采集自體外周血干細(xì)胞后，需經(jīng)過1周甚至更長時 間的放、化療等預(yù)處理。在這段時間內(nèi)，為了保持造血干細(xì)胞的活性及造血和免疫重建功 能，采集的細(xì)胞必須冷凍保存。所以干細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)是移植成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 申請?zhí)?01210552263. 4,公開了一種造血干細(xì)胞凍存的方法及保護劑，該專利造血干細(xì)胞 保護劑成分及比例是9-10%DMS0 (二甲基亞砜)+5%1640 (1640培養(yǎng)基)+5-6%ACD I (血液 保存液I)，凍存過程是直接放入_8〇°C低溫冰箱中保存。由該專利申請文件的實施例表一 可以看出，用該專利方法凍存的干細(xì)胞，在不同的凍存時間點（月）復(fù)蘇，細(xì)胞活率與用經(jīng)典 凍存方法（10% DMS0+6%HES (輕乙基淀粉）+4%HAS (人血白蛋白），程序降溫、液氮保存） 凍存的干細(xì)胞相比無明顯差異。盡管該凍存技術(shù)簡單方便，凍存效果也好，但在臨床應(yīng)用上 也存在一些問題：1.細(xì)胞活率維持時間短。兩種凍存方法的細(xì)胞活率由第1個月的92%下 降到第12個月的84%左右。特別是用該技術(shù)凍存的細(xì)胞，細(xì)胞活率由第1個月的92. 6%下 降到第6個月的86. 2%，平均每個月下降1%左右；2.因高濃度DMS0對人體有一定的毒副作 用，復(fù)蘇后直接移植進(jìn)患者體內(nèi)易使患者產(chǎn)生惡心、嘔吐、腹部痙攣及心率減慢、血壓升高 等癥狀，所以9-10%的DMS0濃度不易直接臨床輸注；3.因1640培養(yǎng)基其成分與人體環(huán)境 相差較遠(yuǎn)，未被批準(zhǔn)臨床使用，不能直接臨床輸注。所以由此技術(shù)凍存的干細(xì)胞，復(fù)蘇后需 經(jīng)去凍存液處理才可臨床輸注，這給臨床應(yīng)用帶來不便。而經(jīng)典的凍存方法因使用程序降 溫儀降溫凍存，使得操作繁瑣、成本增高也不易在臨床大規(guī)模使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了有助于理解本發(fā)明，除非有另外說明，本文中，凍存體系是指含有凍存液和干 細(xì)胞懸液的體系。
[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中造血干細(xì)胞凍存液難以兼顧長時間維持細(xì)胞活率和臨床直 接輸注的不足。本發(fā)明的目的之一是提供一種既能減少保護劑的使用濃度又能提高復(fù)蘇后 細(xì)胞活率而且還可直接臨床輸注的人外周血干細(xì)胞凍存液。該凍存液是由羥乙基淀粉代血 漿、復(fù)方氨基酸注射液（18AA-IV)、DMS0和人血清白蛋白配制而成，四者在凍存體系中的終 體積百分含量分別是48. 2%、2%、4. 8%、20%。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供一種上述人外周血干細(xì)胞凍存液的配制及使用方法，包 括如下步驟：1.無菌抽取20ml復(fù)方氨基酸注射液（18AA - IV)和50ml DMS0,兩者充分混 勻；2.把步驟1的混合液注入500ml羥乙基淀粉代血漿中，充分混勻。三者混合液占凍存體 系終體積的55% ;3.根據(jù)采集的干細(xì)胞體積(采集的干細(xì)胞懸液占凍存體系終體積的25%) 算出凍存體系的總體積，再根據(jù)步驟2混合液的終體積百分含量55%算出所需的混合液體 積數(shù)，無菌抽取并注入無菌容器(如凍存袋）；4.根據(jù)人血清白蛋白終體積百分含量20%，算 出所需人血清白蛋白的體積數(shù)，無菌抽取并注入步驟3中的無菌容器，充分混勻；5.新鮮 采集的人外周血干細(xì)胞懸液，無菌抽取并注入步驟4中的無菌容器，充分混勻；6.抽取步 驟5的干細(xì)胞和凍存液的混合液，分裝入干細(xì)胞凍存袋，排凈空氣，封口并在凍存袋的進(jìn)液 管處留取多段細(xì)胞。最后硬紙板固定凍存袋使之平整，放入-80°C冰箱內(nèi)凍存。
[0006] 本技術(shù)方案的主要特征在于由羥乙基淀粉代血漿、復(fù)發(fā)氨基酸注射液 (18AA-IV)、DMS0和人血清白蛋白組成干細(xì)胞凍存液，各組分終體積百分含量分別是 48. 2%、2%、4.8%、20%。干細(xì)胞懸液的終體積含量為25%。干細(xì)胞凍存液中的成分除了 DMS0 夕卜，其余都是臨床常見注射用成分，使用安全、獲取方便。使用本發(fā)明中的凍存液，無需使用 程序降溫儀，可直接把細(xì)胞放入_80°C低溫冰箱保存。
[0007] 本發(fā)明的有益效果：1.本發(fā)明提供了一種新的外周血干細(xì)胞凍存液的配制及使 用方法，可有效保存干細(xì)胞，在凍存的不同時間點（1、3、6個月）復(fù)蘇，干細(xì)胞臺盼藍(lán)拒染率 始終保持在99%以上；2.干細(xì)胞復(fù)蘇后可直接臨床輸注；3.操作簡便、使用安全。

【具體實施方式】
[0008] 以下結(jié)合【具體實施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0009] 張XX，非霍奇金淋巴瘤。血細(xì)胞分離機采集外周血干細(xì)胞懸液100ml，白細(xì)胞濃度 為245. 43X 109/L。采集袋置于超凈臺。根據(jù)干細(xì)胞懸液占凍存體系終體積的25%，算出凍 存終體積為l〇〇ml + 25%=400ml ;根據(jù)復(fù)方氨基酸注射液（18AA-IV)、DMS0和羥乙基淀粉代 血漿三者混合液占凍存體系終體積的55%，算出三者混合液體積為400mlX55%=220ml ;根 據(jù)人血清白蛋白終體積百分含量20%，算出所需人血清白蛋白的體積為400 ml X 20%=80ml。 無菌抽取20ml復(fù)方氨基酸注射液（18AA-IV)和50ml DMS0在無菌瓶中充分混勻，接著把混 合液全部注入500ml羥乙基淀粉代血漿中充分混勻。抽取上述三者混合液220ml注入醫(yī)用 干細(xì)胞凍存袋中，接著注入80ml人血白蛋白充分混勻。然后把采集袋中的干細(xì)胞懸液全部 抽取注入上述凍存袋中充分混勻。最后把干細(xì)胞混合液，分裝入干細(xì)胞凍存袋，l〇〇ml/袋， 共4袋。排凈空氣，封口并在凍存袋的進(jìn)液管處留取4段細(xì)胞，標(biāo)簽注明采集及凍存時間、 患者及凍存者姓名、凍存量、凍存細(xì)胞濃度。硬紙板固定凍存袋使之平整，放入_80°C冰箱內(nèi) 凍存。
[0010] 我們在凍存前及凍存后的第1、3、6個月分別檢測干細(xì)胞臺盼藍(lán)拒染率及每10 5個 細(xì)胞中粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落生成單位（CFU-GM)的集落數(shù)，檢測結(jié)果如表1、2所示。表1為 患者張XX干細(xì)胞凍存前后臺盼藍(lán)拒染率及CFU-GM集落數(shù)。表2為18例患者干細(xì)胞凍存 前后臺盼藍(lán)拒染率及CFU-GM集落數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果。
[0011] 表1張XX干細(xì)胞凍存前后細(xì)胞臺盼藍(lán)拒染率及CFU-GM集落數(shù)

【權(quán)利要求】
1. 一種人外周血干細(xì)胞凍存液，其特征在于是由羥乙基淀粉代血漿、復(fù)方氨基酸注射 液（18AA-IV)、二甲基亞砜和人血清白蛋白組成，各組分在凍存體系中的終體積百分含量分 別是 48. 2%、2%、4. 8%、20%。
2. -種如權(quán)利要求1所述的人外周血干細(xì)胞凍存液的制備方法，其特征在于先把20ml 復(fù)方氨基酸注射液（18AA-IV)和50ml二甲基亞砜預(yù)混好，接著把兩者混合液與500ml羥乙 基淀粉代血漿預(yù)混好，之后根據(jù)終體積百分含量抽取三者混合液加入無菌容器，最后加入 人血清白蛋白預(yù)混好。
3. -種如權(quán)利要求1所述的人外周血干細(xì)胞凍存液的使用方法，其特征在于采集的 人外周血干細(xì)胞懸液直接與凍存液混合，其中干細(xì)胞懸液在凍存體系中的終體積百分含量 為 25%。
4. 根據(jù)權(quán)利3所述的凍存液使用方法，干細(xì)胞懸液與凍存液充分混勻后分裝入干細(xì)胞 凍存袋，排凈空氣并用硬紙板固定凍存袋使之平整，放入_80°C冰箱內(nèi)凍存。
5. -種如權(quán)利要求1所述的人外周血干細(xì)胞凍存液，其所凍存的干細(xì)胞復(fù)蘇后可直接 臨床輸注。
【文檔編號】A01N1/02GK104430303SQ201410820814
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月26日
【發(fā)明者】孫偉紅 申請人:孫偉紅