一株根結(jié)線蟲生防細(xì)菌、生防菌劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株根結(jié)線蟲生防細(xì)菌、生防菌劑及其應(yīng)用。該生防細(xì)菌為雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06，保藏編號為CGMCC No.10246。本發(fā)明利用雷氏普羅威登斯菌UN06菌株發(fā)酵獲得的發(fā)酵液與菌渣、草炭等吸附載體和菌體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)尿素混合均勻后造粒制成UN06顆粒劑。每畝施用100公斤UN06顆粒劑對番茄根結(jié)線蟲、黃瓜根結(jié)線蟲、煙草根結(jié)線蟲的防效在分別為90.17％、88.66％和85.98％。本發(fā)明的根結(jié)線蟲病生防菌劑具有成本低、防效高、無殘留、對人畜安全的特點，是防治根結(jié)線蟲病的高效生物農(nóng)藥。CGMCC No.1024620141226
【專利說明】一株根結(jié)線蟲生防細(xì)菌、生防菌劑及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株根結(jié)線蟲生防細(xì)菌、生防菌劑及其在防治根結(jié)線蟲病防治中的應(yīng) 用，屬于微生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 作物病原線蟲引起的病害已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的第二大類病害。全球每年因作物 病原線蟲造成的直接經(jīng)濟損失高達1570億美元（Abad P，Gouzy J，Aury JM. et al. 2008. Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nat. Biotechnol. 26(8) :909-15. doi :10. 1038/nbt. 1482.)，其中危害最重、造成損失最大 的是根結(jié)線蟲，根結(jié)線蟲可危害糧食、油料、蔬菜、煙草、水果等3000多種植物。根結(jié)線蟲以 二齡幼蟲侵染作物根系并誘導(dǎo)植物組織線蟲根瘤，根瘤的形成阻礙了植物從土壤中吸收營 養(yǎng)和水分；此外，根結(jié)線蟲的侵染造成傷口和降低植物抗性，有利于土壤中其它植物病原菌 的侵染，因此容易導(dǎo)致根結(jié)線蟲病與其它植物病害的復(fù)合發(fā)生，造成更大的損失（Bird DM and Kaloshian I.2003.Are roots special? Nematodes have their say. Physiol. Mol. Plant Pathol. 62:115-123.)。
[0003] 蔬菜是我國第一大經(jīng)濟作物和最大的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品。據(jù)不完全統(tǒng)計，2008年 全國設(shè)施蔬菜面積已達5020萬畝，面積仍在不斷增加。由于設(shè)施大棚高溫、多年連茬等因 素，近年來大棚蔬菜根結(jié)線蟲危害猖獗失控，給蔬菜生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。發(fā)病地塊一般減產(chǎn) 20%以上，嚴(yán)重的達75%甚至絕收。據(jù)估算，我國蔬菜每年因根結(jié)線蟲危害造成的損失超過 50億元。
[0004] 煙草是中國多個省份經(jīng)濟的重要支柱產(chǎn)業(yè)，2012年全國煙草種植面積2118萬畝。 目前，除東北外，煙草根結(jié)線蟲在全國各主要產(chǎn)煙區(qū)都有發(fā)生，在云、貴、川等西南省份的山 地?zé)焻^(qū)法寶尤為嚴(yán)重，一般發(fā)病田減產(chǎn)3?4成，重病田減產(chǎn)6?7成。
[0005] 長期以來，對作物病原線蟲的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但由于化學(xué)殺線蟲劑高毒 性，造成農(nóng)產(chǎn)品和生態(tài)污染問題非常突出。根據(jù)保護臭氧層的"蒙特利爾議定書"國際條約， 發(fā)達國家已于2005年全面禁用使用最廣泛的化學(xué)殺線蟲劑溴甲烷，發(fā)展中國家將于2015 年全面禁用(Ristaino J, Thomas W. 1998. Agriculture, methyl bromide and the ozone hole:can we fill the gap Plant Dis. 81:964-997·)。目前，滅線磷、溴甲燒、涕滅威等化 學(xué)殺線蟲劑在國內(nèi)幾乎都被禁用或限制使用。由此導(dǎo)致可選用的化學(xué)殺線蟲劑種類更少， 加劇了線蟲防治的困難。
[0006] 生物農(nóng)藥具有安全、有效、無污染等特點，利用生防微生物研發(fā)生物農(nóng)藥具有 廣闊的發(fā)展前景。目前國內(nèi)外有不少防治線蟲的生物農(nóng)藥品種問世，并且有些生物農(nóng) 藥已經(jīng)在局部地區(qū)使用。根結(jié)線蟲和孢囊線蟲侵染作物根部，由作物根際、病原線蟲、 土著微生物及其環(huán)境因子構(gòu)成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)直接影響到生防微生物的根際定殖和防 效。因土壤抑菌作用（fungistasis of soil)導(dǎo)致的防效不穩(wěn)定已嚴(yán)重制約了病原 線蟲生物農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化推廣。如何克服土壤抑菌作用對生防制劑田間萌發(fā)、定殖生態(tài) 的影響，是線蟲生防乃至整個植物病蟲害生物防治領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。雷 氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)是一種具有異氧脫氮性能的細(xì)菌，在生物 除氮和解決水體富營養(yǎng)化方面有應(yīng)用前景（Taylor SM，He YL，Zhao B，Huang J. 2009. Heterotrophic ammonium removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium,Providencia rettgeri YL.Journal of Environmental Sciences，21:1336-1341.) D該微生物殺線蟲方面的特性未見報道D


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一株對根結(jié)線蟲病有高效殺滅活性的生防細(xì)菌一雷氏普 羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株UN06。溫室試驗和田間試驗的結(jié)果表明：該生 防細(xì)菌對根結(jié)線蟲病有很好的防治效果，具備研發(fā)成根結(jié)線蟲病生物農(nóng)藥并產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng) 用的前景。
[0008] 本發(fā)明具體是這樣實現(xiàn)的：本發(fā)明人從山東壽光大棚番茄健康植株的莖部分離到 一株根結(jié)線蟲生防細(xì)菌一雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株UN06。該菌 株已于2014年12月26日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號： CGMCC No. 10246。該菌株具有以下生物學(xué)特性：在AMS培養(yǎng)基平板上，菌落乳白色，直徑 2mm、半透明、圓形、光滑。菌體桿狀，大小為0. 5 μ mXO. 8-1. 5 μ m，最適生長溫度為28°C，最 適生長pH值為7。
[0009] 雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株UN06的培養(yǎng)方法或繁殖方法 為：
[0010] (1)普通培養(yǎng)保存采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5g，瓊脂 20g，水 lOOOmL，pH 7. 2-7. 4 ;
[0011] (2)實驗室液體培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏5g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，水 lOOOmL，pH 7. 2-7. 4 ;
[0012] (3)大量發(fā)酵采用SRC培養(yǎng)基，配方為：蔗糖12. 5g，大米粉50g，蟹殼粉37. 5g， NaCl 2. 5g，MgSO4L 25g，ΚΗ2Ρ042· 5g，加水定容到 1000ml，pH 6. 5。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種包括上述雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株 UN06的生防菌劑。
[0014] 上述生防菌劑的制備方法，具體包括以下步驟：
[0015] (1)斜面種子培養(yǎng)：將雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株UN06的 菌體移到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面上，15-40?下培養(yǎng)1-5天后獲得斜面種子；
[0016] (2)液體種子培養(yǎng)：將斜面種子接種到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中， 15-40°C，50-350rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)2-7天；
[0017] (3)發(fā)酵罐大量培養(yǎng)：將液體種子按1-5% (V/V)的比例接入發(fā)酵罐中的SRC培養(yǎng) 基中于發(fā)酵罐中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：溫度26-37°C，攪拌速度150-250rpm，發(fā)酵時間2-4天； 上述發(fā)酵液可以制成各種生物防治制劑，如顆粒劑、可濕性粉劑等；
[0018] (4)顆粒劑的制備：每50升發(fā)酵液加入40-90公斤食用菌菌渣、10-30公斤尿素、 5-20公斤草炭；充分混勾后用造粒機制成直徑l-3mm，長度2-4mm的圓柱狀顆粒，顆粒在 65-100°C下烘干或自然曬干至水分含量小于10%，即制成UN06顆粒劑。
[0019] 上述步驟（1)最適宜的培養(yǎng)條件是36°C下培養(yǎng)2天。
[0020] 上述步驟⑵最適宜的培養(yǎng)條件為36°C，200rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天。
[0021] 上述步驟（3)最適宜的培養(yǎng)條件為32°C，攪拌速度200rpm，發(fā)酵時間3天。
[0022] 上述步驟（4)最適宜的比例為：每50升發(fā)酵液加入70公斤食用菌菌渣、20公斤 尿素和10公斤草炭。
[0023] 本發(fā)明還提供了雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株UN06制備的生 防菌劑在防治根結(jié)線蟲病方面的應(yīng)用，上述根結(jié)線蟲為番茄根結(jié)線蟲、黃瓜根結(jié)線蟲、絲瓜 根結(jié)線蟲、苦瓜根結(jié)線蟲或者煙草根結(jié)線蟲等。
[0024] 本發(fā)明利用雷氏普羅威登斯菌UN06菌株制備的生防菌劑對防治番茄根結(jié)線蟲， 黃瓜根結(jié)線蟲、絲瓜根結(jié)線蟲、苦瓜根結(jié)線蟲、煙草根結(jié)線蟲的防效在80%以上。每畝施 用100公斤UN06顆粒劑對番茄根結(jié)線蟲、黃瓜根結(jié)線蟲、煙草根結(jié)線蟲的防效在分別為 90. 17%、88. 66%和85. 98%。利用雷氏普羅威登斯菌UN06菌株制備的生防菌劑主要在移 栽期混土并結(jié)合穴施施用，也可在成株期穴施使用。使用時將雷氏普羅威登斯菌UN06菌株 制備的生防菌劑施入作物根際周圍或兌水灌根。雷氏普羅威登斯菌UN06菌株制備的生防 菌劑對根結(jié)線蟲病重災(zāi)區(qū)，移栽期和成株期分別施用一次效果最好。
[0025] 本發(fā)明利用雷氏普羅威登斯菌UN06菌株制備的生防菌劑具有成本低、防效高、無 殘留、對人畜安全的特點，是茄科作物，特別是設(shè)施大棚的茄科蔬菜種植中防治根結(jié)線蟲病 的高效生物農(nóng)藥。

【具體實施方式】
[0026] 實施例1 :雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株UN06菌株的分離
[0027] 本發(fā)明人從山東壽光大棚番前的莖部利用選擇性培養(yǎng)基分離、純化出一批內(nèi) 生細(xì)菌，經(jīng)過對根結(jié)線蟲的生物測定后篩選出高效殺滅根結(jié)線蟲的雷氏普羅威登斯菌 (Providencia rettgeri)菌株UN06。該菌株已于2014年12月26日保存于中國微生物菌 種保藏委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生 物研宄所），保藏編號：CGMCC No. 10246。
[0028] 該菌株的生物學(xué)特性如下：在AMS培養(yǎng)基平板上菌落乳白色，直徑2mm、半透明、圓 形、光滑。菌體桿狀，大小為〇. 5 μ mXO. 8-1. 5 μ m，最適生長溫度為28°C，最適生長pH值 為 7。AMS 培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏 5g，蛋白胨 2g，MgS04.7H20 lg，CaCl20.2g，EDTA 0.004g， NH4Cl 0· 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 02g，MnCl2 · H2O 0· Olg，ZnSO4 · 7H20 0· Olg，瓊脂 20g，補水至 1000ml，pH6.8。
[0029] 該菌株的分子生物學(xué)特性如下：該菌株的16S rRNA基因（SEQ-1)，已提交到 GeneBank公共數(shù)據(jù)庫，其序列號為KP277112,此序列是鑒定該菌株的主要特征依據(jù)。
[0030] 實施例2 :雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株UN06生防菌劑的制 備
[0031] 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，水 IOOOmL, pH 7. 2-7. 4 ；
[0032] 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL， pH7. 2-7. 4 ；
[0033] SRC培養(yǎng)基，配方為：蔗糖12. 5g，大米粉50g，蟹殼粉37. 5g，NaCl 2. 5g， MgSO4L 25g，ΚΗ2Ρ042· 5g，加水定容到 1000ml，pH 6· 5。
[0034] 制備方法，具體包括以下步驟：
[0035] (1)斜面種子培養(yǎng)：將該菌株的菌體移到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面上，36°C 下培養(yǎng)2天后獲得斜面種子；
[0036] (2)液體種子培養(yǎng)：將斜面種子接種到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中， 36°C，200rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天；
[0037] (3)發(fā)酵罐大量培養(yǎng)：將液體種子按3 % (V/V)的比例接入發(fā)酵罐中的SRC培養(yǎng)基 中，在20-1000升發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件控制在：溫度32°C，攪拌速度200rpm，發(fā)酵時間3天；
[0038] (4)顆粒劑的制備：在50升經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得的微生物菌體及其代謝物中加入70 公斤食用菌菌渣、20公斤純度為99. 9%的尿素和10公斤草炭?；旌衔锍浞只靹蚝笥迷炝?機制成直徑1-3_，長度2-4mm的圓柱狀顆粒，顆粒在65-100°C下烘干或自然曬干至水分含 量小于10%，即制成UN06顆粒劑。菌劑需保證UN06菌體的活菌數(shù)含量在IX IO9個/克以 上。
[0039] 實施例3 :UN06顆粒劑防治大棚番茄根結(jié)線蟲的田間試驗
[0040] 試驗地點：山東省壽光市蔬菜大棚。
[0041] 試驗作物：番茄（品種：粉都-80)。
[0042] 供試藥劑：a.活菌數(shù)含量為3. 6 X IO9個/克的UN06顆粒劑；b. 2%阿維菌素乳油。
[0043] 試驗方法：共設(shè)如下三個處理，每處理3個重復(fù)，每重復(fù)120株番茄。
[0044] 處理I :100公斤/畝UN06顆粒劑。整地時，按75公斤/畝的用量將UN06顆粒劑 均勻撒施于土面上，并用翻耕機將其混入土壤中；移栽時每株10克UN06顆粒劑穴施于根部 (每畝按2500株計算，穴施用量為25公斤/畝）。
[0045] 處理2 :2%阿維菌素乳油兌水稀釋1000倍灌根。
[0046] 處理3 :不施用任何殺線蟲藥劑的空白對照。
[0047] 調(diào)查和統(tǒng)計方法：180天后調(diào)查植株根瘤病級指數(shù)（0級：無根瘤；1級：1-20%的 根系有根瘤；2級：21-40%的根系有根瘤；3級：41-60%的根系有根瘤；4級：61-80%的根 系有根瘤；5級：81-100%的根系有根瘤），并按以下公式計算病情指數(shù)和防效：
[0048] 病情指數(shù)（％) = (1^X1+1^X2+113X3+114X4+115X5) ASX5) X 100, Ii1-Ii5分別代 表根瘤病級指數(shù)1-5級相應(yīng)的植株總數(shù)，S代表調(diào)查的植株總數(shù)。
[0049] 防效（％ ) = 100(l_x/y)，x、y分別處理和對照的病情指數(shù)。
[0050] 試驗結(jié)果：表1顯示每畝施用100公斤UN06顆粒劑對番茄根結(jié)線蟲的防效高達 90. 17%，顯著高于施用2%阿維菌素乳油的對照（81. 68% )。
[0051] 表I UN06顆粒劑對大棚番茄根結(jié)線蟲的防效
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一株根結(jié)線蟲生防細(xì)菌，它為雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)菌株 UN06,該菌株的保藏編號為CGMCC No. 10246。
2. -種生防菌劑，包括權(quán)利要求1所述的雷氏普羅威登斯菌菌株UN06。
3. 權(quán)利要求2所述的生防菌劑的制備方法，其特征是，具體包括以下步驟： (1) 斜面種子培養(yǎng)：將雷氏普羅威登斯菌菌株UN06的菌體移到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng) 基斜面上，15-40°C下培養(yǎng)1-5天后獲得斜面種子； (2) 液體種子培養(yǎng)：將斜面種子接種到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中， 15-40°C，攪拌轉(zhuǎn)速50-350rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)2-7天； (3發(fā)酵罐大量培養(yǎng)：將液體種子按體積比1-5 %的比例接入發(fā)酵罐中的SRC培養(yǎng)基中 于發(fā)酵罐中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：溫度26-37°C，攪拌速度150-250rpm，發(fā)酵時間2-4天；所述 SRC 培養(yǎng)基為：蔗糖 12. 5g，大米粉 50g，蟹殼粉 37. 5g，NaCl 2. 5g，MgS04l. 25g，KH2P042. 5g， 加水定容到l〇〇〇ml，pH 6. 5。
4. 如權(quán)利要求3所述的生防菌劑的制備方法，其特征是，每50升發(fā)酵液加入40-90公 斤食用菌菌渣、10-30公斤尿素和5-20公斤草炭；混勻后用造粒機制成直徑l-3mm，長度 2-4_的圓柱狀顆粒，顆粒在65-100°C下烘干或自然曬干至水分含量小于10%，即制成生 防菌劑的顆粒劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的生防菌劑的制備方法，其特征是，每50升發(fā)酵液加入70公斤食 用菌菌渣、20公斤尿素和10公斤草炭。
6. 如權(quán)利要求3-5中任意一項所述的生防菌劑的制備方法，其特征是，所述步驟（1)培 養(yǎng)條件為：36°C下培養(yǎng)2天。
7. 如權(quán)利要求3-5中任意一項所述的生防菌劑的制備方法，其特征是，所述步驟（2)的 培養(yǎng)條件為：36°C，攪拌速度200rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天。
8. 如權(quán)利要求3-5中任意一項所述的生防菌劑的制備方法，其特征是，所述步驟（3)的 培養(yǎng)條件為：32°C，攪拌速度200rpm，發(fā)酵時間3天。
9. 權(quán)利要求2所述的生防菌劑在防治根結(jié)線蟲病方面的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的生防菌劑在防治根結(jié)線蟲病方面的應(yīng)用，其特征是，所述根結(jié) 線蟲為番茄根結(jié)線蟲、黃瓜根結(jié)線蟲、絲瓜根結(jié)線蟲、苦瓜根結(jié)線蟲或者煙草根結(jié)線蟲。
【文檔編號】A01N63/00GK104480053SQ201510014134
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2015年1月12日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月12日
【發(fā)明者】周峰, 莫明和, 潘克靜 申請人:山東泰寶生物科技股份有限公司