本發(fā)明涉及一種禾本科牧草種子萌發(fā)的方法，具體涉及一種羊草種子高效萌發(fā)的方法，屬于種子生物學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羊草(Leymus chinensis)，又名堿草，屬于禾本科賴草屬根莖型多年生禾本科牧草，是我國東北及內(nèi)蒙古草原的主要建群種和優(yōu)勢種之一。我國羊草的草原面積約為21萬平方千米，占全世界總面積的50％。羊草適應(yīng)性強，具有耐寒、旱和鹽堿等優(yōu)良特性，而且營養(yǎng)價值高、適口性好，有較高的飼用價值和經(jīng)濟價值，是我國重要的牧草，同時也是防止水土流失、治理土地退化、恢復(fù)和重建草原生態(tài)系統(tǒng)的常用物種。
當前我國保障畜牧業(yè)健康發(fā)展所需要的干草為每年160萬噸左右，其中50％需要通過國外進口獲得滿足，因此對國內(nèi)的高產(chǎn)抗逆且高品質(zhì)的牧草資源存在巨大的需求缺口。另外，我國草地退化嚴重，受損面積在1000萬公頃左右，恢復(fù)和重建這些退化的草地也需要大量的羊草種子。因此，人工繁育成為提高羊草種子生產(chǎn)力的必然選擇。
然而羊草種子休眠性較強，如讓其自然萌發(fā)，萌發(fā)率只有8％～9％，且需15～20天才能萌發(fā)(楊映根.羊草種子生產(chǎn)及提高種子萌發(fā)率的研究進展，種子，2001)。先前已報道的羊草萌發(fā)方面的研究，主要集中在低溫春化、物理方法、化學藥物及激素浸泡等處理方法，共同缺點是實驗品種限于選育的單一品種、數(shù)據(jù)間可比性較差、費時耗力且不具可重復(fù)性，因此亟需研發(fā)一整套簡單快速穩(wěn)定的羊草種子萌發(fā)技術(shù)，用于羊草的育種和生產(chǎn)實踐。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是為了解決目前羊草種子萌發(fā)的實驗品種限于選育的單一品種、數(shù)據(jù)間可比性較差、費時耗力且不具可重復(fù)性的技術(shù)問題，而提供一種羊草種子高效萌發(fā)的方法。
本發(fā)明的一種羊草種子高效萌發(fā)的方法是按以下步驟進行的：
一、選取種子：收獲處在乳熟期的羊草種子，然后曬干，篩選羊草種子凈度為95％以上的備用；所述的羊草種子未進行脫麩處理；
二、破壁、超聲：將步驟一中種子凈度為95％以上的羊草種子放入質(zhì)量分數(shù)為30％～35％的氫氧化鈉水溶液中浸泡40min～45min，然后使用無菌水清洗3～4次，在室溫下干燥24h～30h，超聲處理20min～25min；
三、配置培養(yǎng)基：向1/2MS培養(yǎng)基中添加蔗糖、赤霉素和瓊脂，在121℃的條件下滅菌15min，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)pH為5.8～6.0，得到SMG培養(yǎng)基；所述的SMG培養(yǎng)基中蔗糖的濃度是15g/L，赤霉素的濃度是200mg/L，瓊脂的濃度是7.5g/L；
四、在超凈工作臺中，將步驟二超聲后的羊草種子放入無菌管中，然后加入體積分數(shù)為70％的乙醇水溶液浸泡30s，用無菌水清洗2次～3次，然后放入體積分數(shù)為10％的次氯酸鈉水溶液中浸泡10min，再用無菌水清洗4次～5次，用滅菌牙簽將種子移到鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上，吹風0.5h～1h；
五、將步驟四得到的羊草種子接種到步驟三制備的SMG培養(yǎng)基中，然后放入培養(yǎng)箱中，在溫度為25℃的條件下暗培養(yǎng)2天～3天，即完成羊草種子的萌發(fā)。
在步驟二中羊草種子破壁方法包括30％～35％氫氧化鈉初步化學處理，然后使用能夠規(guī)?；瘧?yīng)用的超聲波進行物理處理，從物理和化學兩方面處理增強種皮透性，打破羊草種子休眠，提高種子的萌發(fā)率。
本申請步驟三中SMG培養(yǎng)基中的赤霉素是一種植物生長素，可以打破休眠，使脫落酸的含量減少，促進發(fā)芽。
本發(fā)明的優(yōu)點：
1)本發(fā)明的方法中羊草萌發(fā)可以不受季節(jié)與環(huán)境限制兼具簡單方便、快速高效、受品種制約小等優(yōu)勢。
2)本發(fā)明首次通過物理、化學和激素有效結(jié)合方法打破羊草種子休眠，顯著的提高了羊草的萌發(fā)率，從而確保獲得足夠數(shù)量的種苗用于羊草再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及用于牧草商業(yè)化生產(chǎn)；
本發(fā)明提供的方法能夠不受季節(jié)和環(huán)境的限制，快速高效地破除羊草種子休眠，并使其在2～3天內(nèi)的萌發(fā)率達到70％以上，且具有發(fā)芽整齊，重復(fù)性高，受羊草品種的限制小，從而極大節(jié)省了羊草萌發(fā)和育種的時間，為其快速擴繁與推廣奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
1)限制性小：本發(fā)明中羊草種子不局限于羊草的基因型和生態(tài)型，不僅適用于人工繁育的種子，對天然草原收獲的羊草種質(zhì)資源也適用，不受植物發(fā)育時期的限制；
2)快速高效：本發(fā)明所需羊草種子不需要進行貯藏、去稃、變溫等處理，不受季節(jié)與環(huán)境限制，根據(jù)實際需要，可以隨時隨地進行萌發(fā)實驗，從接種到發(fā)芽僅需2-3天，能夠達到每人每月繁殖30000棵種子苗的工作效率。
具體實施方式
具體實施方式一：本實施方式為一種羊草種子高效萌發(fā)的方法，具體是按以下步驟進行的：
一、選取種子：收取處在乳熟期的羊草種子，然后曬干，篩選羊草種子凈度為95％以上的備用；所述的羊草種子未進行脫麩處理；
二、破壁、超聲：將步驟一中種子凈度為95％以上的羊草種子放入質(zhì)量分數(shù)為30％～35％的氫氧化鈉水溶液中浸泡40min～45min，然后使用無菌水清洗3～4次，在室溫下干燥24h～30h，超聲處理20min～25min；
三、配置培養(yǎng)基：向1/2MS培養(yǎng)基中添加蔗糖、赤霉素和瓊脂，在121℃的條件下滅菌15min，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)pH為5.8～6.0，得到SMG培養(yǎng)基；所述的SMG培養(yǎng)基中蔗糖的濃度是15g/L，赤霉素的濃度是200mg/L，瓊脂的濃度是7.5g/L；
四、在超凈工作臺中，將步驟二超聲后的羊草種子放入無菌管中，然后加入體積分數(shù)為70％的乙醇水溶液浸泡30s，用無菌水清洗2次～3次，然后放入體積分數(shù)為10％的次氯酸鈉水溶液中浸泡10min，再用無菌水清洗4次～5次，用滅菌牙簽將種子移到鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上，吹風0.5h～1h；
五、將步驟四得到的羊草種子接種到步驟三制備的SMG培養(yǎng)基中，然后放入培養(yǎng)箱中，在溫度為25℃的條件下暗培養(yǎng)2天～3天，即完成羊草種子的萌發(fā)。
具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟一中所述的羊草種子為農(nóng)菁4號、農(nóng)菁11號、吉生1號、東北羊草或海拉爾野生羊草。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟二中將步驟一中種子凈度為95％以上的羊草種子放入質(zhì)量分數(shù)為30％的氫氧化鈉水溶液中浸泡40min。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟三中用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)pH為5.8。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟四中所述無菌濾紙的制備方法為：將濾紙放入滅菌鍋中，在121℃的條件下滅菌15min，得到無菌濾紙。其他與具體實施方式一相同。
通過以下試驗驗證本發(fā)明效果：
試驗一：本試驗為一種羊草種子高效萌發(fā)的方法，具體是按以下步驟進行的：
一、選取種子：收取處在乳熟期的羊草種子，然后曬干，篩選羊草種子凈度為95％以上的備用；所述的羊草種子未進行脫麩處理；
二、破壁、超聲：將步驟一中種子凈度為95％以上的羊草種子放入質(zhì)量分數(shù)為30％的氫氧化鈉水溶液中浸泡40min，然后使用無菌水清洗4次，在室溫下干燥24h，超聲處理20min；
三、配置培養(yǎng)基：向1/2MS培養(yǎng)基中添加蔗糖、赤霉素和瓊脂，在121℃的條件下滅菌15min，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)pH為5.8，得到SMG培養(yǎng)基；所述的SMG培養(yǎng)基中蔗糖的濃度是15g/L，赤霉素的濃度是200mg/L，瓊脂的濃度是7.5g/L；
四、在超凈工作臺中，將步驟二超聲后的羊草種子放入無菌管中，然后加入體積分數(shù)為70％的乙醇水溶液浸泡30s，用無菌水清洗3次，然后放入體積分數(shù)為10％的次氯酸鈉水溶液中浸泡10min，再用無菌水清洗5次，用滅菌牙簽將種子移到鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上，吹風1h；
五、將步驟四得到的羊草種子接種到步驟三制備的SMG培養(yǎng)基中，然后放入培養(yǎng)箱中，在溫度為25℃的條件下暗培養(yǎng)3天，即完成羊草種子的萌發(fā)。
步驟一中所述的羊草種子為農(nóng)菁4號；
步驟四中所述無菌濾紙的制備方法為：將濾紙放入滅菌鍋中，在121℃的條件下滅菌15min，得到無菌濾紙。
試驗一的羊草種子的萌發(fā)率達到70.3％。