本發(fā)明涉及微電極生物傳感技術(shù)，具體地說，涉及一種活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

赤霉素(GAs)是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育不可缺少的植物激素之一,調(diào)控種子萌發(fā)、下胚軸伸長、葉片伸展、花、果實(shí)及種子發(fā)育等眾多生理過程，其通過GA-GID1-DELLA復(fù)合物,尤其是DELLA蛋白與多種植物激素發(fā)生相互作用，對(duì)植物正常生長發(fā)育起著重要作用。

當(dāng)前，在植物生理學(xué)研究中，傳統(tǒng)的GAs檢測多采用光化學(xué)誘導(dǎo)熒光法、高效液相色譜法(HPLC)、色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等離體靜態(tài)分析方法。這類方法需要對(duì)植物材料離體取樣，通過檢測浸提液中GAs濃度來推測植株體內(nèi)的含量，所以需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，耗時(shí)長同時(shí)對(duì)樣品提取純度要求較高，并且這種離體檢測反應(yīng)的只是植物體內(nèi)某一時(shí)刻的靜態(tài)濃度或累積效應(yīng)，無法對(duì)植物進(jìn)行長時(shí)間實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析。而隨著研究的深入，研究者們希望獲得植物體在生長發(fā)育過程及環(huán)境適應(yīng)過程中植物激素的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)信息，從而更好的指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。所以對(duì)植物活體組織GAs的原位動(dòng)態(tài)檢測顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的一種活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器具有三電極體系，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對(duì)電極，金工作電極，所述金工作電極上電沉積Au/Ag核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米粒子溶膠后，再電聚合L-Cys/GA3分子印跡聚合物。

所述Au/Ag核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米粒子溶膠的制備方法為：將100mL 1.0×10^-3-5×10^-3mol·L^-1的HAuCl₄溶液加熱至沸，向沸液中一次性加入9.34mL 0.0378-0.5mol·L^-1的Na₂C₆H₅O₇溶液，保持沸騰15-30min，自然冷卻；取10mL通過上述方法制得的金溶膠稀釋至100mL加熱至沸，向沸液中一次性加入1mL 0.0378-0.5mol·L^-1的Na₂C₆H₅O₇溶液，再沸；向沸液中分批加入5mL 1×10^-2-5×10^-2mol·L^-1的AgNO₃溶液，保持沸騰1-1.5h，自然冷卻。

所述L-Cys/GA3分子印跡聚合物的制備方法為：將0.007g GA3加入到100ml蒸餾水中，制備2.0×10^-4M GA3原液；將0.0024g L-Cys加入到1.0M NaOH溶液中，用0.04M的PBS溶液稀釋至100ml，制備2.0×10^-4M L-Cys原液；將L-Cys和GA3的原液以2：1-4:1的體積混合，制備分子印跡聚合物溶液。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器的金工作電極的制備方法包括以下步驟：

首先微電極陣列通過微機(jī)電加工技術(shù)(MEMS)制備，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對(duì)電極及金工作電極，其中裸露導(dǎo)電部分長約5-20mm；將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(-0.2～1.6V)得到典型的循環(huán)伏安譜圖，確保電極表面清潔；

在金工作電極上電沉積Au/Ag核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米粒子溶膠進(jìn)行修飾，20-40分鐘后(優(yōu)選30分鐘)，用前述修飾過的金工作電極以L-Cys/CA3分子印跡聚合物溶液為電解質(zhì)溶液，用循環(huán)伏安法掃描進(jìn)行電聚合，然后用甲醇乙酸溶液沖洗。

進(jìn)一步地，循環(huán)伏安法掃描進(jìn)行電聚合的工作條件為，電壓0V-1.2V，20-100mV/s(優(yōu)選50mV/s)，掃描15-60圈(優(yōu)選30圈)。優(yōu)選地，電壓0V-1.2V，50mV/s，掃描30圈。

所述甲醇乙酸溶液的體積比為5:1-8:1(優(yōu)選8:1)，沖洗時(shí)間為5分鐘。

為了能夠?qū)崿F(xiàn)活體檢測植物組織中的赤霉素，采樣中把對(duì)植物組織的傷害降低到最小，本發(fā)明的微電極生物傳感器的電極外觀具有穿透植物組織的能力，如圖1所示的外觀，裸露導(dǎo)電部位長度為5-20mm。

本發(fā)明提供了上述微電極生物傳感器在活體實(shí)時(shí)檢測植物赤霉素中的應(yīng)用。

具體地，檢測部位為植物的莖、葉、果實(shí)或嫩芽。

本發(fā)明提供了一種活體在線檢測植物赤霉素濃度的方法，包括：

(1)將上述微電極生物傳感器連接至電化學(xué)工作站，與不同濃度的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行連續(xù)檢測，由濃度與電流關(guān)系獲得穩(wěn)定的檢測GA3的工作曲線；

(2)將上述的微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學(xué)工作站，獲取電流變化，導(dǎo)入工作曲線，計(jì)算被測樣本內(nèi)赤霉素的濃度。

具體地，活體在線檢測植物赤霉素濃度的方法的步驟(1)是用CV或DPV法與GA3的標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，獲得工作電位為0.2V，然后在0.2V工作電位下，用計(jì)時(shí)電流法檢測不同濃度的GA3標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.1、0.5、1.0、3.0、10、25、60nM)，得到一組電流與濃度的關(guān)系曲線Δi＝45.56+12.55lgC(r＝0.9880)

具體地，步驟(2)是選用培養(yǎng)至第15天植物幼苗做實(shí)驗(yàn)材料，將微電極插入幼苗的嫩莖中，再連接至電化學(xué)工作站，在線測定1天內(nèi)GA3的濃度變化。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了一種基于微型生物傳感技術(shù)的植物體內(nèi)赤霉素的活體在線監(jiān)測方法，從而更全面、深入地了解植物體內(nèi)赤霉素的調(diào)節(jié)規(guī)律及作用機(jī)制。本發(fā)明通過在工作電極電沉積Au/Ag核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米粒子后，再電聚合L-Cys/GA3分子印跡聚合物，沖洗后獲得分子印跡敏感膜，保證檢測的靈敏度和特異性。本發(fā)明通過對(duì)活體植物體內(nèi)GAs的在線監(jiān)測，原位實(shí)時(shí)的掌握植物體內(nèi)GAs的動(dòng)態(tài)變化信息，為了解GAs參與植物生命體系的調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。應(yīng)用本發(fā)明的微電極生物傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)植物活體內(nèi)GAs的在線監(jiān)測，對(duì)被檢測樣本不造成本質(zhì)傷害；得到的數(shù)據(jù)結(jié)果可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的反映植物體內(nèi)GAs的含量變化，實(shí)際應(yīng)用操作簡便，易于掌握。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述微電極生物傳感器三電極體系外觀結(jié)構(gòu)圖。

圖2為本發(fā)明所述微電極生物傳感器的金工作電極制備與檢測GAs的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1工作電極的制備

(1)微電極陣列通過微機(jī)電加工技術(shù)(MEMS)制備，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對(duì)電極及金工作電極，其中裸露導(dǎo)電部分長約5-20mm；將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(-0.2～1.6V)得到典型的循環(huán)伏安譜圖，確保電極表面清潔。

(2)制備Au/Ag核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米粒子溶膠：將100mL1.0×10^-3mol·L^-1的HAuCl₄溶液加熱至沸，向沸液中一次性加入9.34mL0.0378mol·L^-1的Na₂C₆H₅O₇溶液，保持沸騰15min，自然冷卻；取10mL通過上述方法制得的5×10^-4mol·L^-1金溶膠稀釋至100mL加熱至沸，向沸液中一次性加入1mL 0.0378mol·L^-1的Na₂C₆H₅O₇溶液，再沸；向沸液中分批加入5mL 1×10^-2mol·L^-1的AgNO₃溶液，保持沸騰1h，自然冷卻。

(3)準(zhǔn)備分子印跡聚合物溶液：將0.007g GA3加入到100ml蒸餾水中，制備2.0×10^-4M GA3原液；將0.0024g L-Cys加入到1.0M NaOH溶液中，用0.04M的PBS溶液稀釋至100ml，制備2.0×10^-4M L-Cys原液；將L-Cys和GA3的原液以3：1的體積混合，制備分子印跡聚合物溶液。

(4)電極修飾過程：在金電極上電沉積Au/Ag核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米粒子溶膠，30分鐘后，用上述修飾過的電極以分子印跡聚合物溶液為電解質(zhì)溶液，用循環(huán)伏安法(電壓0V-1.2V，50mV/s)掃描30圈進(jìn)行電聚合，然后用甲醇乙酸溶液(8：1)沖洗5分鐘，將模板分子沖洗掉，完成工作電極的修飾。

實(shí)施例2微電極生物傳感器的應(yīng)用

先用CV或DPV法與GA3的標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，獲得工作電位為0.2V，然后在0.2V工作電位下，用實(shí)施例1制得的微電極采用計(jì)時(shí)電流法檢測不同濃度的GA3標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.1、0.5、1.0、3.0、10、25、60nM)，得到一組電流與濃度的關(guān)系曲線Δi＝45.56+12.55lgC(r＝0.9880)。

選用培養(yǎng)至第15天番茄幼苗做實(shí)驗(yàn)材料，將微電極插入番茄幼苗的嫩莖中，再連接至電化學(xué)工作站，在線測定12h內(nèi)GA3的濃度變化。

分別取培養(yǎng)至第15天的番茄幼苗嫩莖，用傳統(tǒng)的液相色譜連用方法對(duì)不同時(shí)間選取的樣本(2h，4h，8h，12h)進(jìn)行GA3的檢測。將液相色譜-質(zhì)譜連用(HPLC-MS)得到的結(jié)果與同一時(shí)期微電極在線監(jiān)測的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次計(jì)算其平均值，得到結(jié)果如表1：

表1番茄幼苗莖部GA3含量檢測結(jié)果

由上表看出，利用微電極在線檢測番茄幼苗莖部GA3含量與傳統(tǒng)HPLC-MS方法測量結(jié)果數(shù)據(jù)基本吻合。該方法數(shù)據(jù)可靠、選擇性高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)GA3高度靈敏、專一的識(shí)別，適用于植物的莖、葉、果實(shí)等不同組織部位，可實(shí)現(xiàn)植物體內(nèi)GA3的活體在線監(jiān)測，有助于了解GA3參與植物生命活動(dòng)的調(diào)控規(guī)律及作用機(jī)制。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1制得的微電極與GA3的標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，在0.2V工作電位下，用計(jì)時(shí)電流法檢測不同濃度的GA3標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.1、0.5、1.0、3.0、10、25、60nM)，得到一組電流與濃度的關(guān)系曲線Δi＝45.56+12.55lgC(r＝0.9880)。

將培養(yǎng)至第15天的番茄幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。將微電極插入番茄幼苗的嫩莖中，再連接至電化學(xué)工作站，在線測定鹽脅迫處理后1h內(nèi)GA3的濃度變化。本發(fā)明實(shí)施例1制備的微電極生物傳感器采樣間隔為0.1秒，可實(shí)時(shí)給出番茄幼苗在鹽脅迫下1h內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)。而HPLC方法則只能對(duì)某幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣，經(jīng)過復(fù)雜的處理過程再進(jìn)行檢測，需要的采樣量多，而得到的信息量少，不能實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化信息的采集，某些情況下可能丟失重要信息。

對(duì)比例1

1)微電極清潔后，(不電沉積Au/Ag核-殼納米粒子)用清潔過的電極以分子印跡聚合物溶液為電解質(zhì)溶液，用循環(huán)伏安法(電壓0V-1.2V，50mV/s)掃描30圈進(jìn)行電聚合，然后用甲醇乙酸溶液(8：1)沖洗5分鐘，將模板分子沖洗掉，完成工作電極的修飾。

2)將上述微電極生物傳感器連接至電化學(xué)工作站，與不同濃度的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行連續(xù)檢測，由濃度與電流關(guān)系獲得穩(wěn)定的檢測GA3的工作曲線為Δi＝56.82+8.45lgC(r＝0.9877)，與制備的包含電沉積Au/Ag核-殼納米粒子步驟的傳感器相比，靈敏度降低。

3)將上述的微電極生物傳感器插入番茄幼苗的嫩莖中，再連接至電化學(xué)工作站，在線測定GA3，獲取電流變化，導(dǎo)入工作曲線，計(jì)算的赤霉素的濃度數(shù)值也偏低

表2番茄幼苗莖部GA3含量檢測結(jié)果

對(duì)比例2

1)微電極清潔后，在金電極上電沉積Au/Ag核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米粒子溶膠。

2)準(zhǔn)備分子印跡聚合物溶液：將0.007g GA3加入到100ml蒸餾水中，制備2.0×10^-4M GA3原液；將0.0024g L-Cys加入到1.0M NaOH溶液中，用0.04M的PBS溶液稀釋至100ml，制備2.0×10^-4M L-Cys原液；將L-Cys和GA3的原液以1:1的體積混合，制備分子印跡聚合物溶液。

3)用修飾有Au/Ag核-殼納米粒子的電極以分子印跡聚合物溶液為電解質(zhì)溶液，用循環(huán)伏安法(電壓0V-1.2V，50mV/s)掃描30圈進(jìn)行電聚合，然后用甲醇乙酸溶液(8：1)沖洗5分鐘，將模板分子沖洗掉，完成工作電極的修飾。

4)將上述微電極生物傳感器連接至電化學(xué)工作站，與不同濃度的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行連續(xù)檢測，由濃度與電流關(guān)系獲得穩(wěn)定的檢測GA3的工作曲線為Δi＝33.22+9.623gC(r＝0.9925)，與制備的將L-Cys和GA3的原液以2:1-4:1的體積混合的傳感器相比，靈敏度降低。

5)將上述的微電極生物傳感器插入番茄幼苗的嫩莖中，再連接至電化學(xué)工作站，在線測定GA3，獲取電流變化，導(dǎo)入工作曲線，計(jì)算赤霉素的濃度數(shù)值也偏低。

表3番茄幼苗莖部GA3含量檢測結(jié)果

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。