本發(fā)明涉及一種多孢分離方法，尤其涉及一種高效的虎奶菇多孢分離方法以及使用的多孢分離裝置。

背景技術(shù)：

食用菌品種菌種質(zhì)量的好壞是決定其產(chǎn)量高低和質(zhì)量優(yōu)劣的根基，也是食用菌種植效益的最直接影響因子。傳統(tǒng)的菌種質(zhì)量保持方法在實(shí)踐中由于保藏基質(zhì)、保藏環(huán)境以及繼代操作等諸多因素，造成了部分菌種在栽培應(yīng)用中，表現(xiàn)出生產(chǎn)性能的退化。因此，不少制種和生產(chǎn)單位開始大量應(yīng)用新分離種作為原始種進(jìn)行擴(kuò)繁和生產(chǎn)。

多孢分離指采用分離多孢子獲得純培養(yǎng)物的方法，是食用菌育種的主要方法之一。多孢分離的效果例如孢子萌發(fā)率、次生菌絲菌落密度等直接影響優(yōu)勢菌株篩選效果。

關(guān)于菌種多孢分離的研究較多，目前公開及使用的主要以無菌紙收集法和鉤子懸空方法為主，在公開的中國專利申請CN1786149A中，公開了一種傘菌孢子的野外分離方法，將子實(shí)體置于無菌紙上，然后將吸有清水的吸水紙貼于器皿內(nèi)壁，器皿罩住無菌紙，孢子會彈射到無菌紙上，形成孢子印，該方法的主要缺點(diǎn)在于孢子的接觸介質(zhì)與孢子的接觸面積大，受污染風(fēng)險(xiǎn)高；在公開的中國專利申請CN104396572A中，公開了一種冬蟲夏草菌種孢子的分離提純復(fù)壯方法，其中分離采用鉤子懸空方法，包括在試管塞下端錘入一個(gè)小鉤，在無菌條件下將菌種的子座下端倒掛于試管塞的小鉤上，使子座尖端部向下，將掛好子座的試管塞塞入斜面試管；該方法的主要缺點(diǎn)在于一方面只能用于較小的子實(shí)體，另一方面，每一子實(shí)體只能收集于一個(gè)培養(yǎng)試管，效率不高。

基于以上情況，需要研究一種高效的、適合于大型子實(shí)體且污染風(fēng)險(xiǎn)小的多孢分離方法及裝置。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明提供一種高效的虎奶菇多孢分離方法。

一種高效的虎奶菇多孢分離方法，包括：

將多孢分離裝置封口并滅菌，采收菌蓋直徑6-8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實(shí)體，切除菌柄，消毒菌蓋表面，打開隔離容器，箘褶朝下地把將菌蓋放置于懸空放置裝置，重新蓋上隔離容器并封口，每隔8-10小時(shí)更換一次收集裝置；

所述多孢分離裝置包括：隔離容器，以及隔離容器中的懸空放置裝置，所述懸空放置裝置下方設(shè)置有收集裝置。

優(yōu)選的，所述消毒菌蓋表面時(shí)不要接觸箘褶部位。

優(yōu)選的，每一次子實(shí)體可收集20-24小時(shí)。

優(yōu)選的，當(dāng)重新蓋上隔離容器后，在隔離容器封口處噴施酒精后，再重新封口。

優(yōu)選的，所述收集裝置中還有培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％，葡萄糖1.5％-2％，磷酸氫二鉀0.05％-0.1％，硫酸鎂0.03％-0.05％，其余為水。

進(jìn)一步優(yōu)選的，上述培養(yǎng)基的pH為6.5。

優(yōu)選的，所述收集裝置中還有培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為水，所述培養(yǎng)基的pH 6.5。

優(yōu)選的，將收集裝置取出并封口后，在26℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，所述多孢培養(yǎng)的孢子萌發(fā)率高，次生菌絲的菌落均勻。

優(yōu)選的，所述隔離容器包括燒杯；所述懸空放置裝置包括蒸架；所述收集裝置包括培養(yǎng)皿。

優(yōu)選的，更換子實(shí)體后，重新清洗、封口、滅菌多孢分離裝置再使用。

另一方面，本發(fā)明還提供一種高效的虎奶菇多孢分離裝置，用于上述高效的虎奶菇多孢分離方法。

一種高效的虎奶菇多孢分離方法使用的多孢分離裝置，所述多孢分離裝置包括：隔離容器，以及隔離容器中的懸空放置裝置，所述懸空放置裝置下方設(shè)置有收集裝置。

優(yōu)選的，所述懸空放置裝置為直徑10-11厘米、腳高7-8厘米的蒸架。

采用本發(fā)明的虎奶菇多孢分離方法分離得到的孢子經(jīng)過培養(yǎng)后，可以得到大量半透明匍匐狀初生菌絲體菌落，初生菌絲融合后，會出現(xiàn)白色毛氈狀菌落，這些菌落可以用于后續(xù)的分離、鑒定或培養(yǎng)等。

采用本發(fā)明收集的虎奶菇孢子，收集的孢子的孢子萌發(fā)率高，次生菌絲的菌落均勻，從而有助于后續(xù)的優(yōu)勢菌株篩選。。

與現(xiàn)有技術(shù)的無菌紙收集法相比，本發(fā)明的虎奶菇多孢分離方法孢子的不與中間介質(zhì)接觸，直接收集到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，減少污染風(fēng)險(xiǎn)；與現(xiàn)有技術(shù)的鉤子懸空方法相比，本發(fā)明可以適用于較大型的子實(shí)體，而且可以多次更換收集裝置，每一子實(shí)體可以實(shí)現(xiàn)多次收集，提高效率。

本發(fā)明的高效的虎奶菇多孢分離方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，污染風(fēng)險(xiǎn)小、效率高，融合后的次生菌絲體生長旺盛，方法和裝置簡化高效。

附圖說明

圖1是虎奶菇多孢分離后的次生菌絲體菌落。

圖2是培養(yǎng)基環(huán)境下形成子實(shí)體原基的虎奶菇分離菌株。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

食用用菌從孢子萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生初生菌絲，一般認(rèn)為初生菌絲不具備形成子實(shí)體(菇體)的能力，初生菌絲體存在不同交配型，當(dāng)相匹配的兩個(gè)(或兩個(gè)以上)交配型初生菌絲體接觸并融合后，可產(chǎn)生具備形成子實(shí)體能力的次生菌絲體，在食用菌行業(yè)中則稱為菌種。

多孢分離實(shí)際上是多孢子間布朗運(yùn)動、隨機(jī)重組的結(jié)果，是把許多孢子接種在同一培養(yǎng)基上，讓其萌發(fā)、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法，能獲得與原始親本具有不同遺傳背景的菌株。

虎奶菇是一種能產(chǎn)生大體型、厚肉質(zhì)子實(shí)體的側(cè)耳屬食用菌，作為食材時(shí)能適用多種烹飪方式，口感清爽有嚼勁。營養(yǎng)學(xué)研究指出，虎奶菇中含有豐富的蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、多種維生素、真菌多糖、膳食纖維等食藥用成分，蛋白質(zhì)含量為15.6％、脂肪2.5％、粗纖維6.3％、粗多糖10.8％、總糖34.6％；礦質(zhì)元素中鉀、鈣、鐵、鋅、硒含量較高，氨基酸總含量為14.9％，其中人體必需的8種氨基酸量占氨基酸總量的46.1％，異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸含量相對較高。并且，有關(guān)研究表明，虎奶菇中的虎奶多糖具有提高人體免疫功能、抗腫瘤等神奇效用。

進(jìn)一步研究表明，虎奶菇屬于偏高溫型食用菌，菌絲體生長、子實(shí)體發(fā)育都需在25℃以上，適合在我國南方長夏季地區(qū)工廠化栽培生產(chǎn)，能極大降低栽培溫控所產(chǎn)生的能耗。因此，虎奶菇是一種非常具有開發(fā)價(jià)值和潛力的食用菌。

鑒于此，一方面，本發(fā)明提供一種高效的虎奶菇多孢分離方法，包括：將多孢分離裝置封口并滅菌，采收菌蓋直徑6-8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實(shí)體，切除菌柄，消毒擦拭菌蓋表面，打開隔離容器，箘褶朝下地把將菌蓋放置于懸空放置裝置，重新蓋上隔離容器并重新封口，每隔8-10小時(shí)更換一次收集裝置中的培養(yǎng)平板；

所述多孢分離裝置包括：隔離容器，以及隔離容器中的懸空放置裝置，所述懸空放置裝置下方設(shè)置有收集裝置。

在本發(fā)明的上述多孢分離方法中，子實(shí)體的成熟度以及收集裝置的收集時(shí)間對成功分離得到次生菌絲體純培養(yǎng)菌落具有重要的影響，發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，在子實(shí)體成熟度小于本發(fā)明分離方法所要求成熟度時(shí)，收集的多孢菌落稀少，萌發(fā)時(shí)間長，影響后續(xù)優(yōu)勢菌株挑選，而在子實(shí)體大于本發(fā)明分離方法所要求成熟度時(shí)，收集的多孢密度大，不易分離，并且污染幾率顯著上升；而切除菌柄可以進(jìn)一步減少污染發(fā)生幾率。

其中，上述方法中，所述消毒擦拭菌蓋表面時(shí)優(yōu)選不要接觸箘褶部位，箘褶部位是孢子著生部位，脆弱而容易損傷，當(dāng)損傷箘褶部位時(shí)會影響孢子的彈射；并且，當(dāng)本發(fā)明所述的子實(shí)體成熟度時(shí)，子實(shí)體雖然暴露出箘褶時(shí)，但箘褶部位基本是無雜菌的狀態(tài)，不接觸箘褶可減少污染風(fēng)險(xiǎn)。

其中，上述方法中，優(yōu)選每隔8-10小時(shí)，例如8小時(shí)更換一次收集裝置。該優(yōu)選的收集時(shí)間內(nèi)，收集的多孢密度適中，有利于后續(xù)的菌落分離，并且不易污染。

其中，上述方法中，每一次子實(shí)體可收集優(yōu)選20-24小時(shí)，例如24小時(shí)。

本發(fā)明每一次子實(shí)體可以收集2-3次，收集效果高，方便快捷。

其中，上述方法中，當(dāng)重新蓋上隔離容器后，優(yōu)選在隔離容器封口處噴施酒精后，再重新封口，降低污染風(fēng)險(xiǎn)。

其中，上述方法中，優(yōu)選所述收集裝置中還有培養(yǎng)基，具有消毒后培養(yǎng)基的收集裝置在收集多孢后，直接取出，就可以進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)，減少中間步驟帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)，操作方便。

其中，所述培養(yǎng)基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％、優(yōu)選為0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％、優(yōu)選為0.2％，葡萄糖1.5％-2％、優(yōu)選為2％，磷酸氫二鉀0.05％-0.1％、優(yōu)選為0.1％，硫酸鎂0.03％-0.05％、優(yōu)選為0.05％，其余為水。

進(jìn)一步地，上述培養(yǎng)基的pH為6.5。

其中，所述培養(yǎng)基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為水，培養(yǎng)基的pH為6.5。經(jīng)研究，這樣的培養(yǎng)基適合于虎奶菇多孢培養(yǎng)。

其中，上述方法中，所述隔離容器在收集虎奶菇過程中提供/保持無菌環(huán)境，并且阻斷外界氣流對孢子的彈射影響，使得更多的孢子能夠掉落與收集在收集裝置中，所述隔離容器優(yōu)選包括玻璃罩，例如燒杯等。

其中，上述方法中，所述懸空放置裝置用于懸空放置子實(shí)體，可以根據(jù)虎奶菇子實(shí)體大小選擇合適的懸空放置裝置，例如蒸架。

對于本發(fā)明上述分離方法中的菌蓋直徑6-8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實(shí)體，優(yōu)選采用直徑10-11厘米、腳高7-8厘米的蒸架。

其中，上述方法中，所述收集裝置用于收集彈射的孢子，根據(jù)隔離容器大小和收集需求選擇合適大小的收集裝置，例如基于商業(yè)方便購買角度，可以使用培養(yǎng)皿作為收集裝置。

其中，上述方法中，更換子實(shí)體后，優(yōu)選重新清洗、封口、滅菌多孢分離裝置再使用。更換子實(shí)體會更容易帶來污染風(fēng)險(xiǎn)，為控制/降低污染風(fēng)險(xiǎn)，在更換子實(shí)體后，對多孢分離裝置清洗后，重新進(jìn)行上述多孢分離方法的步驟。

其中，上述方法中，在收集裝置收集完成后，將上述含有培養(yǎng)基的收集裝置取出并封口后，在26℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，例如培養(yǎng)5-7日后，會出現(xiàn)大量半透明匍匐狀初生菌絲體菌落，待初生菌絲融合后，出現(xiàn)白色毛氈狀菌落。

其中，本發(fā)明方法收集的多孢培養(yǎng)的孢子萌發(fā)率高，次生菌絲的菌落均勻，有助于后續(xù)優(yōu)勢菌落篩選。多孢分離的效果，應(yīng)以是污染程度、生長旺盛的次生菌絲體菌落致密程度為要點(diǎn)。

應(yīng)該理解，本發(fā)明中所述的多孢分離方法，不僅適用于虎奶菇，還可以用于與虎奶菇具有相似的子實(shí)體維持時(shí)間的菌種的多孢分離。

本發(fā)明的多孢分離方法，不僅可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)子實(shí)體2-3次的收集，而且在該收集時(shí)間內(nèi)收集的孢子密度合適，經(jīng)培養(yǎng)后的次生菌絲菌落均勻，非常有益于后續(xù)優(yōu)勢菌落篩選；此外，本發(fā)明方法可以直接收集后培養(yǎng)萌發(fā)，不需要再轉(zhuǎn)接而增加污染風(fēng)險(xiǎn)。

另一方面，本發(fā)明還提供一種高效的虎奶菇多孢分離裝置，用于上述高效的虎奶菇多孢分離方法。

一種高效的虎奶菇多孢分離方法使用的多孢分離裝置，所述多孢分離裝置包括：隔離容器，以及隔離容器中的懸空放置裝置，所述懸空放置裝置下方設(shè)置有收集裝置。

對于菌蓋直徑6～8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實(shí)體，本發(fā)明的多孢分離裝置優(yōu)選采用直徑10-11厘米、腳高7-8厘米的蒸架。

進(jìn)一步地，所述蒸架為金屬蒸架。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，蒸架為直徑10.5cm、腳高7.5cm的蒸架或金屬蒸架，蒸架的腳朝向隔離容器開口方向放置。

其中，上述分離裝置中，所述收集裝置用于收集彈射的孢子，根據(jù)隔離容器大小和收集需求選擇合適大小的收集裝置，例如基于商業(yè)方便購買角度，可以使用培養(yǎng)皿作為收集裝置。

其中，上述分離裝置中，所述收集裝置中還包含有適合于虎奶菇孢子萌發(fā)的培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基滅菌后倒入收集裝置中，使用。

本發(fā)明中優(yōu)選的培養(yǎng)基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％、優(yōu)選為0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％、優(yōu)選為0.2％，葡萄糖1.5％-2％、優(yōu)選為2％，磷酸氫二鉀0.05％-0.1％、優(yōu)選為0.1％，硫酸鎂0.03％-0.05％、優(yōu)選為0.05％，其余為水。

進(jìn)一步地，上述培養(yǎng)基的pH為6.5。

本發(fā)明中更優(yōu)選的培養(yǎng)基，包括以下重量百分比組分：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為水，培養(yǎng)基的pH為6.5。

多孢分離裝置使用時(shí)，需要對分離裝置進(jìn)行封口后滅菌，具體地，將分離裝置組裝完成后，將隔離容器進(jìn)行封口，并滅菌，例如高壓蒸汽滅菌，滅菌后，干燥容器內(nèi)水滴，例如在超凈工作臺內(nèi)采用風(fēng)機(jī)干燥容器內(nèi)水滴。

本發(fā)明中所述的“封口”，如無特別說明，是指對裝置與外界環(huán)境進(jìn)行隔離，特別是對裝置的開口部分與外界環(huán)境進(jìn)行隔離，例如采用報(bào)紙或封口膜等。

所述多孢分離裝置按照上述分離方法在分離虎奶菇多孢中使用。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的虎奶菇多孢分離方法簡化、快捷，并且高效，基本能使污染率達(dá)到0％，在食用菌育種等方面具有較大應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)施例1

一種多孢分離裝置，包括2000mL燒杯作為隔離容器，燒杯的杯口直徑約14.5cm，內(nèi)放置一直徑10.5cm，腳高7.5cm的金屬蒸架作為懸空放置裝置，架腳朝燒杯杯口方向放置，杯口以報(bào)紙和橡皮筋封口后，高壓蒸汽滅菌30min(0.1MPa，121℃)，滅菌結(jié)束冷卻后取出，放置入超凈工作臺，打開氣流風(fēng)機(jī)，干燥瓶內(nèi)水滴；另一方面，配制培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌16min后，稍冷卻，取出于超凈臺中倒入直徑6cm的無菌培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿置于燒杯內(nèi)，金屬屬蒸架下面，即得。

培養(yǎng)基的組分為：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為水，培養(yǎng)基的pH為6.5。

實(shí)施例2

一種高效的虎奶菇的多孢分離方法

本實(shí)施例方法采用實(shí)施例1的多孢分離裝置，采收表面無雜物污物，菌蓋直徑6～8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實(shí)體，用已表面消毒的刀沿箘褶與菌柄連接處齊根切除菌柄，用蘸有75％酒精棉球稍拭擦菌蓋表面，但不接觸箘褶部位；將菌蓋部分送入超凈工作臺，摘下分離裝置的報(bào)紙(即打開封口)，舉起燒杯，箘褶朝下地把菌蓋放置在蒸架上，重新蓋上燒杯，在燒杯口和底部報(bào)紙接觸位置噴施75％酒精，翻折報(bào)紙以橡皮筋重新封杯口，開始收集。

每隔8h更換一次培養(yǎng)皿，一個(gè)子實(shí)體可使用24h，更換3次培養(yǎng)皿進(jìn)行3次收集，更換子實(shí)體后需要重新清洗、封口和滅菌分離裝置。

實(shí)施例3

一種高效的虎奶菇的多孢分離方法

本實(shí)施例基本采用實(shí)施例1的多孢分離裝置，不同的是，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿暫時(shí)不放置到燒杯內(nèi)，而放置在超凈臺中待用，在使用時(shí)再組裝。

采收表面無雜物污物，菌蓋直徑6～8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的新鮮虎奶菇子實(shí)體，用已表面消毒的刀沿箘褶與菌柄連接處齊根切除菌柄，用蘸有75％酒精棉球稍拭擦菌蓋表面，但不接觸箘褶部位，將菌蓋部分送入超凈工作臺，解開燒杯的封口，舉起燒杯，箘褶朝下地把菌蓋放置在蒸架上，在蒸架之下放入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，重新蓋上燒杯，在燒杯口和底部報(bào)紙接觸位置噴施75％酒精，翻折報(bào)紙以橡皮筋重新封杯口。

每隔8小時(shí)更換一次培養(yǎng)皿，一個(gè)子實(shí)體收集3次。更換子實(shí)體后需要重新清洗、封口和滅菌分離裝置。

取出的收集了孢子的培養(yǎng)皿用封口膜封口后置26℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，5-7日后可見大量半透明匍匐狀初生菌絲體菌落，待初生菌絲融合，出現(xiàn)白色毛氈狀菌落，產(chǎn)生氣生菌絲體，如圖1所示，可挑選出并移接到新的培養(yǎng)基上根據(jù)需要進(jìn)行后續(xù)分離、鑒定或培養(yǎng)操作。

實(shí)施例4

將實(shí)施例3收集孢子后培養(yǎng)得到的白色毛氈狀菌落，挑取生長旺盛的單菌落至新的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)菌落在培養(yǎng)基的環(huán)境下即可形成子實(shí)體原基，如圖2所示，而此現(xiàn)象在多孢分離前的虎奶菇菌種中并未發(fā)現(xiàn)，表明虎奶菇經(jīng)多孢分離后獲得了子實(shí)體形成能力強(qiáng)的菌株，孢子萌發(fā)率高、多孢融合菌絲的菌落均勻。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。