本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及組織培養(yǎng)基，具體涉及一種用于黃花磯松組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基

背景技術(shù)：

黃花磯松(Limoniumau-reum)又稱金色補(bǔ)血草、黃花補(bǔ)血草，是多年生草本。黃花磯松屬于蘭雪科補(bǔ)血草屬植物，它是干旱荒漠地區(qū)為數(shù)不多的野生花卉之一，花色艷麗，開花延續(xù)時(shí)期較長。根為直根系，粗大，全株平滑，株高20～50cm，粗放管理、極耐干旱、花期長，是豐富北方城市綠化建設(shè)中地被植物品種的重要種質(zhì)資源，而且又是防風(fēng)固沙的優(yōu)良植物。黃花磯松極具抗干旱高溫、耐鹽堿和耐貧瘠的特點(diǎn)，在敦煌的沙質(zhì)戈壁灘能忍受降水量50mm，地表溫度55℃的干旱高溫環(huán)境；在北方干旱地區(qū)不需澆水，在氣溫-36℃以內(nèi)可安全越冬；土壤PH9以下、含鹽量4‰以內(nèi)可正常生長開花。其藥用價(jià)值具有止痛、消炎、補(bǔ)血之功效，在國內(nèi)已開展相關(guān)研究。該物種不僅有良好的經(jīng)濟(jì)效益，而且在保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面也具有很好的生態(tài)效益，其開發(fā)利用前景廣泛。

近年來，關(guān)于黃花磯松的的組織培養(yǎng)已有文獻(xiàn)進(jìn)行了報(bào)道，但文獻(xiàn)報(bào)道的黃花磯松組織培養(yǎng)的外植體多選擇種子，子葉或者莖段，培養(yǎng)基多采用的都是改良的MS培養(yǎng)基，這種組織培養(yǎng)方法極易引起褐化現(xiàn)象，并且不易生根。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于黃花磯松組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括初代誘導(dǎo)基、繼代增殖基、生根培養(yǎng)基，初代誘導(dǎo)基配方為B5+KT 0.2-0.8mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L+2，4-D 0.02-0.08mg/L；繼代增殖培養(yǎng)基配方為B5+KT 0.5-0.8mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L；生根培養(yǎng)基配方為B5+IBA 0.1mg/L，在各個(gè)培養(yǎng)階段均附加食用白砂糖20-40g/L，卡拉膠3-5g/L。初代誘導(dǎo)基配方優(yōu)選B5+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+2，4-D 0.05mg/L；繼代增殖培養(yǎng)基配方優(yōu)選為B5+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L。

本發(fā)明的培養(yǎng)基在使用過程中有如下步驟

(1)外植體的選擇與滅菌：取黃花磯松花序消毒滅菌，用自來水沖洗30-40min，吸水紙吸去水分后在70-75％的酒精中沖洗1-2min，再用0.1％的升汞溶液處理8-10min，無菌水淋洗6-7次，用已滅菌的濾紙吸干，黃花磯松的花序?yàn)?-3天后將要開放的花蕾；

(2)外植體誘導(dǎo)：將滅菌處理好的花序接入改良的B5培養(yǎng)基上，即在B5培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加植物激素，其濃度分別為：2，4-D 0.02-0.08mg/L；KT 0.2-0.8mg/L；NAA 0.05-0.1mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。附加食用白砂糖20-40g/L，卡拉膠3-5g/L。在溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度1500-2000lx，光照時(shí)間12-16h/d的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)15-20天誘導(dǎo)出愈傷；

(3)繼代增殖培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)出的黃花磯松愈傷取出，接種于改良的B5繼代增殖培養(yǎng)基，其中植物激素濃度為：KT 0.5-0.8mg/L；NAA 0.05-0.1mg/L，附加食用白砂糖20-40g/L，卡拉膠3-5g/L。在溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度1500-2000lx，光照時(shí)間12-16h/d的條件下增殖培養(yǎng)30-40天，增殖出黃花磯松不定芽；

(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)增殖培養(yǎng)出的黃花磯松不定芽轉(zhuǎn)入配方為B5+IBA0.1mg/L生根培養(yǎng)基中，附加食用白砂糖20-40g/L，卡拉膠3-5g/L。在溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度1500-2000lx，光照時(shí)間12-16h/d的條件下生根培養(yǎng)5-7天獲得組培苗。

本發(fā)明的技術(shù)方案中

1)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2，4-D 0.02-0.08mg/L，優(yōu)選0.05mg/L；KT 0.2-0.8mg/L，優(yōu)選0.5mg/L；NAA 0.05-0.1mg/L，優(yōu)選0.1mg/L。2，4-D可誘導(dǎo)愈傷的分化，側(cè)芽的萌發(fā)與生長，但過量的2，4-D有抑制芽形成的副作用，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基不僅誘導(dǎo)率高，而且每個(gè)外植體新增芽數(shù)多，其誘導(dǎo)率最高可達(dá)84.8％。

2)增殖培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加KT 0.2-0.8mg/L，優(yōu)選0.5mg/L；NAA 0.05-0.1mg/L，優(yōu)選0.1mg/L。適當(dāng)濃度的NAA對(duì)黃花肌松不定芽的形成有促進(jìn)作用，研究發(fā)現(xiàn)，隨著NAA濃度的增加，其增殖倍數(shù)逐漸增大，其濃度為0.1mg/L，增殖系數(shù)達(dá)到最大，繼續(xù)增大NAA濃度，其增值率未有明顯增大且有下降趨勢。隨著KT濃度的增大，增殖倍數(shù)有所增加，繼續(xù)增大KT濃度，增值率改善不明顯，而且出現(xiàn)了徒長現(xiàn)象。

3)生根培養(yǎng)基：改良B5+IBA 0.1mg/L，該生根培養(yǎng)基生根效果較好，生根率達(dá)92.1％。生根基部可新增帶根的叢生芽，平均可達(dá)3-4個(gè)。在培養(yǎng)基中加入恰當(dāng)濃度的IBA可提高和改善生根時(shí)間、根的長度和生根率。

在本發(fā)明中，在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知范圍內(nèi)，KT、NAA、IBA、2，4-D分別是6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、2，4-二氯苯氧乙酸的簡稱。

本發(fā)明篩選出用于黃花磯松組織培養(yǎng)在不同時(shí)期的最佳培養(yǎng)基，確定了培養(yǎng)基中各激素的配比，按照本發(fā)明的配方配制的培養(yǎng)基可滿足了黃花磯松各個(gè)時(shí)期的營養(yǎng)需要和生長發(fā)育。提高了組織培養(yǎng)過程中的誘導(dǎo)率和生根率，是實(shí)現(xiàn)黃花磯松規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵和核心技術(shù)。

本發(fā)明的組織基使黃花磯松的培養(yǎng)繁殖不受自然條件限制，且誘導(dǎo)率和生根率高，可以不斷進(jìn)行大量繁殖，在短期內(nèi)可獲得大量的小苗，解決了栽培中種源較少的問題，同時(shí)可以有效降低品種的退化率，為今后的研究以及規(guī)?；?，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供保障，為該物種在園林建設(shè)中的大量推廣普及提供技術(shù)支撐；同時(shí)，也為西北地區(qū)物種保護(hù)和資源快速更新提供科學(xué)依據(jù)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例中統(tǒng)計(jì)計(jì)算公式

成活率＝(有生活力的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100％

初代芽誘導(dǎo)率＝(出芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100％

繼代增殖倍數(shù)＝(誘導(dǎo)出的叢生芽數(shù)/接入單株芽的總數(shù))×100％

生根率＝(分化根的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100％

(1)外植體的選擇與滅菌，取開花前2-3天將要開放的花蕾，用自來水沖洗30-40min，吸水紙吸去水分后在70-75％的酒精中沖洗1-2min，再用0.1％的升汞溶液處理8-10min，無菌水淋洗6-7次，用已滅菌的濾紙吸干，接種在改良的B5培養(yǎng)基中。

外植體對(duì)黃花肌松成活率及不定芽誘導(dǎo)的影響

分別選取黃花肌松的花序、子葉、莖段接種于B5+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+2，4-D 0.05mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，附加糖30g/L，卡拉膠3.5g/L，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度，25±2℃；光照強(qiáng)度為1500-2000lx；光照時(shí)間為每天12-16小時(shí)。第30天分別統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。結(jié)果如表1所示，同樣的培養(yǎng)條件下，外植體為花序時(shí)，黃花磯松的誘導(dǎo)率為84.8％。

表1部位對(duì)黃花肌松不定芽誘導(dǎo)的影響

(2)外植體誘導(dǎo)

將黃花磯松的花序接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度，25±2℃；光照強(qiáng)度為1500-2000lx；光照時(shí)間為每天12-16小時(shí)。培養(yǎng)15-20天，開始產(chǎn)生愈傷組織，在含有2，4-D的培養(yǎng)基中20天左右產(chǎn)生結(jié)構(gòu)緊密，淡綠色的不定芽，逐漸增加2，4-D的濃度，不定芽誘導(dǎo)率隨著2，4-D濃度的增加而增加，但繼續(xù)增大2，4-D濃度，不定芽誘導(dǎo)率呈下降趨勢，說明過量的2，4-D有抑制芽形成的副作用。

從表2可見，7種激素組合均可誘導(dǎo)黃花磯松花序誘導(dǎo)出不定芽，但各個(gè)組合的分化率不同，3號(hào)B5+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+2，4-D 0.05mg/L是黃花磯松花序的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不但誘導(dǎo)率高，而且每個(gè)外植體新增芽數(shù)多，分化率最高，其分化率可達(dá)80.9％。結(jié)果如表2所示。

表2激素濃度及其組合對(duì)黃花磯松花序不定芽誘導(dǎo)的影響

(3)繼代增殖培養(yǎng)

將以上誘導(dǎo)出的黃花磯松不定芽取出，接種于附加不同濃度KT和NAA的B5培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度，25±2℃；光照強(qiáng)度為1500-2000lx；光照時(shí)間為每天12-16小時(shí)。30后天觀察不同激素組合條件下的增殖率及分化情況。從表3可見，9種激素組合均可誘導(dǎo)黃花磯松產(chǎn)生增殖體系，但各個(gè)組合的不定芽生長狀況不同，當(dāng)激素配比為5號(hào)時(shí)，其增殖倍數(shù)和不定芽生長情況都較優(yōu)，所以B5+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L是黃花磯松不定芽增殖生長狀況最佳培養(yǎng)基。

表3激素濃度及其組合對(duì)黃花磯松不定芽增殖的影響

(4)生根培養(yǎng)

將繼代培養(yǎng)基中長勢較好的苗，分成單株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，每瓶接入4株，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度，25±2℃；光照強(qiáng)度為1500-2000lx；光照時(shí)間為每天12-16小時(shí)，觀察記錄不同培養(yǎng)基上苗的生根情況，7天后統(tǒng)計(jì)生根率。

從生根培養(yǎng)7天的試驗(yàn)結(jié)果來看，兩個(gè)培養(yǎng)基對(duì)根的形成均有誘導(dǎo)作用，其中2號(hào)生根培養(yǎng)基生根效果較好，生根率達(dá)88.7％。不加任何激素的B5培養(yǎng)基也可誘導(dǎo)黃花磯松幼苗生根，但是生根數(shù)量較少，且根比較細(xì)長，當(dāng)培養(yǎng)基中加入激素生IBA，根的數(shù)量，生根率均有所提高，所以，適宜生根的培養(yǎng)基優(yōu)選B5+IBA 0.1mg/L(見表4)。

表4無機(jī)鹽對(duì)幼苗生根的影響

從附表中可以看出，本發(fā)明中各培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率和生根率高，黃花磯松可以不斷進(jìn)行大量繁殖。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求所界定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。