本發(fā)明屬于通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生領(lǐng)域，具體涉及到一種蘿芙木快速增殖培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蘿芙木：直立常綠灌木，高可達(dá)3m，具乳汁，屬于一種藥材，功能主治鎮(zhèn)靜，降壓，活血止痛，清熱解毒。用于高血壓病，頭痛，眩暈，失眠，高熱不退，外用治跌打損傷，毒蛇咬傷等。蘿芙木根中分離出利血平、阿嗎堿、蘿萊堿、蛇根亭堿、阿嗎靈、山馬蹄堿、蘿芙木甲素、錐洛斯明堿、霹靂蘿芙辛堿、一種單萜類生物堿等多種生物堿，含量為1～2％，其中利血平具有良好的降壓作用。蘿芙木中尚含熊果酸0.2％，熊果酸的抗腫瘤作用廣泛，極有可能成為低毒有效的新型抗癌藥物。因此，蘿芙木具有很高的藥用價(jià)值，而且蘿芙木的種植也已經(jīng)得到國(guó)家的推廣。由于連年的采挖，資源急劇減少，從20世紀(jì)80年代中期開始，生產(chǎn)廠家就把藥用部位由根擴(kuò)展到全株，而且為保護(hù)野生資源，滿足企業(yè)生產(chǎn)需求，越來越多的研究機(jī)構(gòu)開展了蘿芙木規(guī)范化種植研究。蘿芙木的繁殖主要是種子與扦插繁殖，但是種子繁殖發(fā)芽率低，生長(zhǎng)速度慢，周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，而扦插繁殖操作復(fù)雜，成活率低等缺點(diǎn)而不能廣泛推廣，因此，為了促進(jìn)蘿芙木快速繁殖，對(duì)蘿芙木組織進(jìn)行了培養(yǎng)基的研究，擺脫了外部環(huán)境對(duì)植株的影響，而且可以對(duì)優(yōu)良的品種進(jìn)行篩選，對(duì)品種進(jìn)行優(yōu)化，因此，植物培養(yǎng)基對(duì)蘿芙木的快速繁殖十分重要?！都t果蘿芙木植物組織培養(yǎng)及快速繁殖》，張麗珍，等，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)出版社，2015年第43卷第6期公開了紅果蘿芙木不同時(shí)期的培養(yǎng)基，以紅果蘿芙木莖段為外植體，研究其再生條件，結(jié)果表明：叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6－BA+0.05mg/LIBA；繼代增殖、壯苗培養(yǎng)基分別為MS+0.3～0.5mg/L6－BA+0.02mg/LIBA、MS+0.1～0.2mg/L6-BA+0.01mg/LIBA；根分化的最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/LNAA+0.2mg/LIBA。公開號(hào)為101731149A的中國(guó)專利申請(qǐng)公開了一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖云南蘿芙木的方法，該發(fā)明以蘿芙木嫩枝帶芽莖段作外植體，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生，啟動(dòng)培養(yǎng)基組成為MS+2.0-4.0mg/LBA+0.05-0.1mg/LNAA。增殖培養(yǎng)MS+2.5-5.0mg/LBA+0.1-0.5mg/LNAA，增殖系數(shù)為8-12，每4-5周重復(fù)繼代一次。生根培養(yǎng)基為添加1.0mg/LNAA或IBA或NAA+IBA＝1.0mg/L的1/2MS培養(yǎng)基，5-6周后將生根苗移栽到煉苗基質(zhì)中，20-30℃保濕遮陰煉苗3-4周轉(zhuǎn)栽或大田種植，成活率達(dá)90％。此發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，繁殖速度快，遺傳穩(wěn)定性好，為工廠化育苗提供技術(shù)支撐。但是上述技術(shù)中增殖培養(yǎng)使用的是1個(gè)單位的MS培養(yǎng)基，銨態(tài)氮含量過高，容易傷害外植體，造成成活率低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明公開了一種蘿芙木快速增殖培養(yǎng)基及其應(yīng)用，本發(fā)明公開的培養(yǎng)基是在B5培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加適量的植物激素，并且加入了蘿芙木乳汁和蔗糖，極大地加快了蘿芙木的快速增殖。一種蘿芙木快速增殖培養(yǎng)基，所述的增殖培養(yǎng)基組成為B5培養(yǎng)基、0.5-1mg/L6-芐基嘌呤、0.2-0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.1-0.2mg/L赤霉酸、0.5-1g維生素E、1000-1500mg/L蘿芙木乳汁和30-40g/L蔗糖。進(jìn)一步的，所述的增殖培養(yǎng)基組成為B5培養(yǎng)基、0.8mg/L6-芐基嘌呤、0.35mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.15mg/L赤霉酸、0.8g維生素E、1300mg/L蘿芙木乳汁和35g/L蔗糖。其中B5培養(yǎng)基的組成為大量元素：KNO32500，MgSO4·7H2O250，CaCl2·2H2O150，(NH4)2SO4134，NaH2PO4.H2O150；微量元素：KI0.75，H3BO33.0，MnSO4·4H2O10，ZnSO4·7H2O2.0，Na2MoO4·2H2O0.25，CoCl2·6H2O0.025，CuSO4·5H2O0.025；鐵鹽：Na2-EDTA37.3，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8；有機(jī)成分：肌醇100，煙酸1.0，鹽酸吡哆醇1.0，鹽酸硫銨10，單位為mg/L。B5培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，而銨這一營(yíng)養(yǎng)成分過多對(duì)蘿芙木有抑制生長(zhǎng)的作用，愈傷組織B5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得更好。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明添加蘿芙木乳汁豐富了要培養(yǎng)加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，采用B5培養(yǎng)基是由于培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量較低，而且本發(fā)明還使用了維生素E，防止植株愈傷組織發(fā)生褐化。具體實(shí)施方式通過以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，使本領(lǐng)域技術(shù)人員更加理解本發(fā)明技術(shù)方案，但并非是對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明培養(yǎng)基購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司供應(yīng)的Sigma的B5培養(yǎng)基。試驗(yàn)涉及到的蘿芙木品種為云南蘿芙木；椰子汁：鄭州綠爾生物科技發(fā)展有限公司。實(shí)施例1進(jìn)一步的，所述的增殖培養(yǎng)基組成為B5培養(yǎng)基、0.8mg/L6-芐基嘌呤、0.35mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.15mg/L赤霉酸、0.8g維生素E、1300mg/L蘿芙木乳汁和35g/L蔗糖。所述的快速增殖培養(yǎng)基的制備方法為：向B5培養(yǎng)基中加入6-芐基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、赤霉酸、維生素E、蘿芙木乳汁和蔗糖，攪拌均勻即得。實(shí)施例2一種蘿芙木快速增殖培養(yǎng)基，所述的增殖培養(yǎng)基組成為B5培養(yǎng)基、1mg/L6-芐基嘌呤、0.2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.2mg/L赤霉酸、0.5g維生素E、1500mg/L蘿芙木乳汁和30g/L蔗糖。所述的快速增殖培養(yǎng)基的制備方法與實(shí)施例1類似。實(shí)施例3一種蘿芙木快速增殖培養(yǎng)基，所述的增殖培養(yǎng)基組成為B5培養(yǎng)基、0.5mg/L6-芐基嘌呤、0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.1mg/L赤霉酸、1g維生素E、1000mg/L蘿芙木乳汁和40g/L蔗糖。所述的快速增殖培養(yǎng)基的制備方法與實(shí)施例1類似。對(duì)比例1進(jìn)一步的，所述的增殖培養(yǎng)基組成為B5培養(yǎng)基、0.8mg/L6-芐基嘌呤、0.35mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.15mg/L赤霉酸、0.8g維生素E、1300mg/L椰子汁和35g/L蔗糖。與實(shí)施例1相比，區(qū)別是不添加蘿芙木乳汁，替換為椰子汁。所述的快速增殖培養(yǎng)基的制備方法與實(shí)施例1類似。試驗(yàn)例1培養(yǎng)試驗(yàn)試驗(yàn)對(duì)象為：實(shí)施例1-3與對(duì)比例1制備的蘿芙木快速增殖培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法：采摘長(zhǎng)勢(shì)較優(yōu)的蘿芙木嫩枝，在無菌條件下，消毒后用水沖洗1個(gè)小時(shí)，剪取帶節(jié)的2cm莖段作為外植體，接種在B5培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)腋芽的產(chǎn)生，當(dāng)腋芽處的不定芽生長(zhǎng)到1-2cm時(shí)，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，將不定芽的頂芽和帶芽莖段作為外植體接種于增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為24℃，光照時(shí)間為16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2500LX，每20天將不定芽在增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)一次。具體結(jié)果如表1所示，數(shù)值均為平均值。表1增殖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況(增值系數(shù)為一個(gè)腋芽長(zhǎng)出的植株數(shù))從表1中可以看出，本發(fā)明公開的實(shí)施例1-3培養(yǎng)基相對(duì)于對(duì)比例1培養(yǎng)基，增殖系數(shù)高，生長(zhǎng)速度快，不定芽較粗，葉片為深綠色，而且愈傷組織不發(fā)生褐化，獲得比較健壯的幼苗，幼苗質(zhì)量更好。試驗(yàn)例2移栽成活率試驗(yàn)方法：將試驗(yàn)例1得到的叢生苗在增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)20天，生出若干根，移到普通房間，并將封口打開，3天后將生根苗移出，然后洗去培養(yǎng)基，移栽到煉苗基質(zhì)中澆透水(珍珠巖：泥炭土重量比為2：1)，25℃下放置在植物恒溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，20天后，移栽到外部環(huán)境中進(jìn)行種植，計(jì)算一個(gè)月后植株的成活量，具體結(jié)果如表2所示。表2移栽成活率與生長(zhǎng)狀況培養(yǎng)基移栽成活率生長(zhǎng)狀況實(shí)施例193％長(zhǎng)勢(shì)旺盛、葉片深綠、莖部粗壯實(shí)施例292.5％長(zhǎng)勢(shì)旺盛、葉片深綠、莖部粗壯實(shí)施例391％長(zhǎng)勢(shì)旺盛、葉片深綠、莖部粗壯對(duì)比例185％長(zhǎng)勢(shì)旺盛、葉片綠色、莖部稍細(xì)從表2中可以里看出，本發(fā)明實(shí)施例1-3的移栽成活率均在90％以上，大于對(duì)比例1中85％的移栽成活率，說明本發(fā)明公開的培養(yǎng)基進(jìn)一步的提高了蘿芙木的成活率，有利于蘿芙木的快速增殖。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3