本發(fā)明涉及一種菌肥，更具體的說涉及一種青蒿幼苗培育方法及其專用深綠木霉K菌肥。技術(shù)背景木霉(Trichodermaspp.)屬半知菌類叢梗抱目、叢梗抱科真菌，廣泛存在于土壤、根圍、葉圍、種子和球莖等生態(tài)環(huán)境中。木霉菌落生長迅速，呈不定型棉絮狀或致密叢束狀。其表面的顏色多呈綠色。菌絲有隔分枝。厚垣孢子有或無。分生孢子梗是菌絲的短側(cè)枝。側(cè)枝上對稱或互生分枝，形成2級和3級分枝。分枝角度為銳角或近于直角，在分枝末端形成瓶狀小梗。分生孢子多為卵圓形。無色或綠色，簇生于小梗頂端。木霉菌是一種嗜溫真菌，生長適溫為20-28℃，在37℃條件下能生長，但在48℃條件下不能生長，在6℃或32℃仍生長良好。木霉的生長要求較高濕度，其營養(yǎng)生長的相對濕度要求92％以上，孢子的形成需要93％-95％的濕度，因而木霉在潮濕土壤中的生命力較干性土壤中強(qiáng)。光照以對數(shù)比例增強(qiáng)可以促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生.有研究發(fā)現(xiàn)380nm和440nm波長的光誘導(dǎo)力最強(qiáng)，木霉經(jīng)日光處理3min或經(jīng)紫外線光處理10-30S誘導(dǎo)產(chǎn)孢的效果更好。木霉的最適生長pH值為5-5.5，在pH值為1.5或9.0的培養(yǎng)基上也可能生長，但酸性條件比堿性條件下的萌發(fā)率更高。CO2對木霉生長的影響取決于CO2的濃度和培養(yǎng)基的PH值，在堿性基質(zhì)中，高濃度的CO2有利于木霉菌的生長。木霉菌株能夠利用多種有機(jī)物作為碳源，較理想的是單糖、雙糖、多糖、嘌呤、嘧啶和氨基酸等。銨是木霉菌最易利用的氮源，其他氮源如氨基酸、尿素、硝酸鹽、亞硝酸鹽也能維持其正常生長。以天冬門素為氮源生長特別好，含氮量低，會促進(jìn)抱子形成，對高濃度硝酸鹽的負(fù)影響由于硫酸鎂的存在可以得到補(bǔ)償。無機(jī)鹽對木霉的生長很重要。對綠色木霉來說，鎂離子能促進(jìn)其生長，銅離子能促進(jìn)分生抱子色素形成，鐵離子對抱子的形成也很重要。自1932年Weindling發(fā)現(xiàn)木素木霉(T.lignorum)寄生于多種植物病原真菌后，木霉菌作為一類生防菌顯示出巨大的應(yīng)用潛力。許多研究者觀察到在藻類、半知菌、子囊菌和擔(dān)子菌中有木霉寄生物。木霉菌能寄生的植物病原菌即拮抗對象包括絲核菌屬((Rhimetonia)、小核菌((Selerolium)、核盤菌屬(Sclerotinia)、長蠕抱屬(Helminth)、鐮刀菌屬(Fusarium)、毛盤抱屬(Colletotriehum)、輪枝抱屬(Yerticillium),黑星菌屬(Venturia)、內(nèi)座殼屬(Endothia),腐霉屬((Pythium)、疫霉屬(Phytophlhora),聞座殼屬(Diaporthe)和黑星孢屬((Fusicladium)等。因此，木霉具有抗病害作用；此外，木霉具有很強(qiáng)的分解纖維素能力，有利于作物吸收利用，具有促進(jìn)植物生長的作用；木霉還降解農(nóng)藥；且對環(huán)境無危害性?？傊?，木霉是研發(fā)有機(jī)菌肥的優(yōu)質(zhì)菌種之一。有機(jī)菌肥是將一種或多種有益微生物植入有機(jī)物中制備而成的一種新型肥料，多效有機(jī)菌肥的有機(jī)物既是肥力的基礎(chǔ)，又是有益微生物的培養(yǎng)基質(zhì)。這種新型肥料兼具促生長、抗病、改善土質(zhì)、無農(nóng)殘等多重優(yōu)點，目前已在國內(nèi)外得到大量應(yīng)用，且取得了顯著效果。國內(nèi)研究者王慧中、趙培潔等對木霉的微生物肥料作用研究得較為透徹，據(jù)趙培潔報道，浙江大學(xué)從1991年起研發(fā)的以哈茨木霉發(fā)酵液為主要成分的微生物多效有機(jī)菌肥，對作物增產(chǎn)效果顯著，并于1997年通過省級鑒定，獲肥料登記和國家專利。所登記的高效微生物態(tài)氮由哈茨木霉深層發(fā)酵液經(jīng)減壓濃縮精制而成，蛋白質(zhì)含量為45％。生產(chǎn)流程為哈茨木霉菌種→平板培養(yǎng)→液體振蕩培養(yǎng)→深層發(fā)酵→測定→過濾→沉渣(棄去)→清夜→減壓濃縮配制→干燥→粉碎→樣品。其產(chǎn)品經(jīng)過大田試驗，發(fā)現(xiàn)與使用傳統(tǒng)的尿素、廄肥相比，對白菜的增產(chǎn)效果明顯，且使用簡單，在蔬菜上具有廣闊的應(yīng)用前景。浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所研制推廣的威綠達(dá)(VIRIDA)菌肥以綠色木霉為主，毛殼菌、枯草芽抱桿菌為輔混配制成，主要應(yīng)用于綠色蔬菜生產(chǎn)、旱地作物、草地保護(hù)，也可以作花卉肥料。該生物制劑以城市生活垃圾為基物，摻混入木霉、毛殼菌及有益細(xì)菌，它既含有作物生長所需的有機(jī)和無機(jī)成分，又具有防病促進(jìn)生長的作用，并且可以改良土壤，是一種多功能的生物菌肥。威綠達(dá)在國內(nèi)外尚屬首創(chuàng)，產(chǎn)品也具有良好的應(yīng)用前景。以綠色木霉為主要成分的利江牌微生物肥(綠色木霉)，是利江實業(yè)公司在利江有機(jī)肥的基礎(chǔ)上，引進(jìn)技術(shù)研制而成的一種木霉微生物肥料。該菌肥對黃瓜、芹菜、油菜等都有顯著的增產(chǎn)作用，并且能夠促進(jìn)早熟，改善作物品質(zhì)，還可抑制病蟲害的發(fā)生?？梢姡跃G色木霉為主要成分的木霉微生物肥料具有多種效果，而且符合當(dāng)今農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)綠色環(huán)保無公害無農(nóng)殘及可持續(xù)發(fā)展的要求，具有廣闊的市場前景。青蒿ArtemisiaannuaL.,又名黃花蒿,是菊科一年生藥用草本植物。具有清熱解暑，除蒸，截瘧的功效。用于暑邪發(fā)熱，陰虛發(fā)熱，夜熱早涼，骨蒸勞熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸。其提取物青蒿素對腦瘧疾和氯喹瘧疾具有高效低毒的抗瘧性能,WHO已經(jīng)認(rèn)定復(fù)方青蒿素成藥為目前最安全有效的抗瘧藥。目前該藥物青蒿素雖然能人工合成,但成本很高,未能產(chǎn)業(yè)化。主要從青蒿植株中提取。青蒿原料主要來自人工栽培，因生產(chǎn)中長期大量施用化肥，導(dǎo)致土壤酸化，環(huán)境污染。亟待尋找綠色環(huán)保無農(nóng)殘的肥料進(jìn)行替代。而我們分離出一株深綠木霉(,Trichodermaaureoviride)K菌株，對青蒿幼苗生長具有顯著的促生作用。因此，用該菌株制作菌肥，可減少甚至避免青蒿幼苗生長時期化肥的施用，從而達(dá)到保護(hù)土壤和環(huán)境的目的。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對青蒿幼苗生長中出現(xiàn)的問題，同時本領(lǐng)域還沒有一種適用于青蒿育苗的菌肥的問題，本發(fā)明提供了一種青蒿幼苗培育方法及其專用深綠木霉K菌肥。其中，一種青蒿幼苗培育方法，為青蒿幼苗根際土中打小洞，灌施深綠木霉K菌肥后蓋土。所述深綠木霉K菌肥的施用量為3g菌球/株。一種專用于青蒿幼苗培育的深綠木霉K菌肥，所述深綠木霉K菌肥的制備的步驟為：1)在無菌操作條件下，取深綠木霉K菌種接種于制備好的液體培養(yǎng)基；2)接深綠木霉K的液體培養(yǎng)基置于搖床，轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分鐘，環(huán)境溫度25℃，培養(yǎng)時間6-8天，液體培養(yǎng)基中長滿菌球后取出；3)濾去多余液體培養(yǎng)基，用清水懸浮菌球，得到深綠木霉K菌肥。所述深綠木霉K菌種的制備方法包括以下步驟：1)在當(dāng)年6月，取無病斑健壯青蒿側(cè)枝，剪成小段，洗去泥土灰塵，用洗衣粉水浸泡1分鐘，流水沖洗后備用；2)在超凈工作臺上，用75％乙醇清洗，1/1000升汞消毒，無菌水清洗4-5次，用無菌濾紙吸干水分，剪成0.5-1厘米長小莖段；3)小莖段置于土豆葡萄糖平皿培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7±1天，挑取莖段周圍長出的真菌菌絲；4)將真菌菌絲在土豆葡萄糖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直到得到純化的真菌菌落為止；5)將上述真菌菌落做分子鑒定，選取深綠木霉K菌株作為深綠木霉K菌肥的菌種。所述土豆葡萄糖培養(yǎng)基的制備方法為：稱取土豆200克切小塊，煮汁水過濾，加入葡萄糖20克，瓊脂粉7克，定容至1升，121℃滅菌30分鐘后，在超凈工作臺上倒入平皿，冷卻后備用。所述液體培養(yǎng)基制備方法為：稱量土豆200克，切小塊，煮沸20分鐘，去渣取汁水，加入葡萄糖20克，加水定容至1升。分裝1升三角瓶，250-500毫升/瓶。121℃滅菌30分鐘得到。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于青蒿幼苗培育的深綠木霉K菌肥，填補(bǔ)了青蒿種植領(lǐng)域的空白。同時采用深綠木霉菌K菌肥能夠有效地促進(jìn)青蒿幼苗的生長發(fā)育，且比化肥綠色環(huán)保。具體實施方式實施例1深綠木霉菌肥的制備1、深綠木霉K菌肥的制備(1)深綠木霉菌株K的篩選6月，取無病斑健壯青蒿側(cè)枝，剪3厘米長小段，洗去泥土灰塵，用洗衣粉水浸泡1分鐘，流水沖洗40分鐘，在超凈工作臺上，用75％乙醇清洗1分鐘，1/1000升汞消毒5分鐘，無菌水清洗4-5次，用無菌濾紙吸干水分，剪成0.5-1厘米長小段，置于土豆葡萄糖PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7天左右，挑取莖段周圍長出的真菌在新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直到得到純化的真菌菌落為止。所得菌落送華大基因公司做分子鑒定，鑒定出一株內(nèi)生真菌為深綠木霉，將其接種于試管培養(yǎng)基(成分同土豆葡萄糖培養(yǎng)基)，25℃培養(yǎng)備用，定名為深綠木霉K。(2)深綠木霉K菌肥的制備在超凈工作臺上，無菌操作條件下，取深綠木霉K的試管菌種一小塊，接種于制備好的三角瓶液體培養(yǎng)基，然后置于搖床，培養(yǎng)條件設(shè)置為25℃,轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)6-8天。待液體培養(yǎng)基中長滿菌球后取出。用紗布濾去多余液體培養(yǎng)基(因該液體對青蒿幼苗生長有抑制作用)，用少量清水懸浮菌球，得到深綠木霉K菌肥。2、對照深綠木霉L菌肥的制備深綠木霉是重寄生菌，可侵染其他真菌，因此我們培養(yǎng)活性較弱的羊肚菌菌絲，以吸引空氣中的深綠木霉孢子，從而分離得到深綠木霉菌株。其培養(yǎng)步驟如下：(1)深綠木霉菌株L的篩選①羊肚菌麥粒種培養(yǎng)小麥粒浸泡于清水24小時，浸泡過心，瀝干水分，裝罐頭瓶，121℃滅菌40分鐘，在超凈工作臺上接種羊肚菌試管菌種，封口，于25℃培養(yǎng)7天左右。待麥粒長滿羊肚菌菌絲后備用。②深綠木霉L菌種的培養(yǎng)腐殖土裝罐頭瓶，121℃滅菌40分鐘，將羊肚菌麥粒種分散成粒后，埋入土中約1-2厘米，塑料膜封口，于15℃培養(yǎng)約7天，羊肚菌菌絲長滿土面后揭開塑料膜，于20℃培養(yǎng)，待土面長出青綠色孢子后，取孢子，在超凈工作臺上接種于土豆葡萄糖培養(yǎng)基平皿(土豆葡萄糖培養(yǎng)基制作方法：土豆200克切小塊，煮汁水過濾，加入葡萄糖20克，瓊脂粉7克，定容至1升，121℃滅菌30分鐘后，在超凈工作臺上倒入平皿冷卻后備用)，25℃培養(yǎng)4-7天，長出菌落后，取菌落邊緣菌絲接種于土豆葡萄糖培養(yǎng)基平皿，這樣多次純化后，得到的菌種送華大基因公司進(jìn)行分子鑒定，確認(rèn)為深綠木霉后，接種于試管培養(yǎng)基(成分同土豆葡萄糖培養(yǎng)基)，25℃培養(yǎng)備用，定名為深綠木霉L。(2)深綠木霉L菌肥的制備在超凈工作臺上，無菌操作條件下，取深綠木霉L試管菌種一小塊，接種于制備好的三角瓶液體培養(yǎng)基，然后置于搖床，培養(yǎng)條件設(shè)置為25℃,轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)6-8天。待液體培養(yǎng)基中長滿菌球后取出。用紗布濾去多余液體培養(yǎng)基(因該液體對青蒿幼苗生長有抑制作用)，用少量清水懸浮菌球，得到深綠木霉L菌肥。實施例2深綠木霉K菌肥在青蒿幼苗培育中的應(yīng)用試驗在當(dāng)年4-6月進(jìn)行，此時溫度利于深綠木霉菌絲體生長。將青蒿幼苗分為3組，每組55株，分別為對照組、深綠木霉K菌肥組和深綠木霉L菌肥組，在青蒿幼苗根際土中打小洞，分別灌施實施例1中得到的深綠木霉K菌肥和深綠木霉L菌肥(約3克菌球/株)后蓋土。另設(shè)一組僅以清水澆灌，作為對照。25天后，統(tǒng)計青蒿幼苗各項生長發(fā)育指標(biāo)，具體如表1所示。對表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果如表2所示。從表2可見，除根長以外，其余所有生長發(fā)育指標(biāo)，深綠木霉L菌肥相對對照組沒有實際的技術(shù)效果；施用深綠木霉K菌肥的青蒿苗均顯著優(yōu)于深綠木霉L菌肥組及對照組青蒿苗。表1施用深綠木霉菌肥對青蒿幼苗生長的影響表2深綠木霉對青蒿促生長作用肥效顯著性分析結(jié)果編號根長cm株高cm根粗mm莖粗mm地下鮮重g地上鮮重g地下干重g地上干重g總鮮重g總干重g對照組26.3036a3.0491b1.1302b1.0889b0.2582b0.2556b0.0296b0.0425b0.5138b0.0722b深綠木霉K菌肥組26.0882ab3.7418a1.3198a1.2138a0.3445a0.3009a0.0437a0.0515a0.6454a0.0952a深綠木霉L菌肥組25.7245ab3.1358b1.1332b1.1105b0.2748b0.2548b0.0302b0.0456b0.5203b0.0885b當(dāng)前第1頁1 2 3