轉chi基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種生物技術領域的提高青葛素含量的方法，特別是一種轉CHI基因 提高青葛中青葛素含量的方法。
【背景技術】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的 含有過氧橋的倍半祗內醋氧化物一一青葛素，是目前應用最廣泛，療效最好的抗追疾藥物， 特別是對腦型追疾和抗氯哇追疾更加有效。目前，青葛素聯(lián)合療法(ACTS)是世界衛(wèi)生組織 推薦的最有效的治療追疾的方法。隨著對青葛素藥理研究的逐步深入，科學家發(fā)現(xiàn)青葛素 及其衍生物還具有抗炎、抗腫瘤、抗癌W及免疫調節(jié)的功能。
[0003] 然而青葛素在植物青葛中的含量非常低，大規(guī)模商業(yè)化生產受到了限制，無法完 全滿足全球的市場需求。由于青葛素結構復雜，人工合成難度大，產量低，成本高，不具可行 性。通過酵母工程生產青葛素，前期投入成本大，且產量有限不能滿足需求?，F(xiàn)有技術表明 植物基因工程為提高青葛中青葛素的含量提供了一個可行的方法。
[0004] 青葛具有分泌型腺毛（g 1 a n d U 1 a r t r i C h O m e S )和非分泌型腺毛 (nonglanduladrichomes)。在青葛葉片的正面和背面、莖桿、花上都大量存在分泌型腺毛， 運里是大量次生代謝物的累積場所，青葛素也被認為儲存于此處。
[0005] 經過對現(xiàn)有技術文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Jin-Ho Kang等在《Plant化ysiology》(植物生理 學）2014年 164卷 1161-1174頁發(fā)表了題為"The Flavonoid Biosynthetic Enzyme ChalconeIsomerase Modulates Terpenoid Production in Glandular Trichomes of Tomato"("查爾酬異構酶對番茄腺毛祗類物質生物合成的調控"）的論文，報道掲露了番茄 CHIl基因和祗類合成有聯(lián)系，黃酬類和祗類路徑的代謝協(xié)調有助于優(yōu)化毛狀體腺在動態(tài)環(huán) 境中的作用。查爾酬異構酶(化alconeIsomerase，CHI)是黃酬合成途徑中的一個關鍵酶，因 此，克隆CHI基因并轉化青葛，對探究黃酬類途徑和青葛素途徑的代謝協(xié)調及基因工程育種 具有重要意義。
[0006] 本發(fā)明致力于采用基因工程手段，獲得青葛素高產的青葛植株，為規(guī)?；a青 葛素提供一條新途徑。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種轉CHI基因提高青葛中青葛 素含量的方法。本發(fā)明設及的基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、青葛素提取及含量 測定用于本發(fā)明，建立了穩(wěn)定提高青葛中青葛素含量的方法，為利用青葛大規(guī)模生產青葛 素奠定了基礎。
[000引本發(fā)明提供一種轉CHI基因提高青葛中青葛素含量的方法，包括W下步驟：
[0009] (1)采用基因克隆方法獲得CHI基因；
[0010] (2)把所述CH堪因連接于表達調控序列，構建含CH堪因的植物表達載體；
[0011] (3)將所述含CHI基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得含所述CHI基因植物 表達載體的根癌農桿菌菌株；
[0012] (4)利用所述含CHI基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株轉化青葛，獲得經PCR檢 測的整合外源目的基因 CHI的轉基因青葛植株。
[0013] 進一步地，所述CHI基因的DNA序列如沈Q ID NO. 1所示。
[0014] 進一步地，所述CHI基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0015] 進一步地，在所述步驟（1)中，所述基因克隆方法包括W下步驟:提取青葛基因組 總RNA，將所獲的青葛基因組總RNA通過反轉錄酶化反轉錄獲得第一鏈cDNA，W所述第一鏈 CDNA為模板，W上游引物和下游引物為引物對，進行PCR擴增，其中所述上游引物的DNA序列 如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016] 優(yōu)選地，在所述步驟（1)中，所述基因克隆方法包括W下步驟:提取青葛基因組總 RNA，將所獲的青葛基因組總RNA通過反轉錄酶化反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù)SEQ ID NO. 1 所示的DNA序列，設計擴增出完整編碼框的上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ ID NO.2所示的DNA序列，所述下游引物為SEQ ID NO.3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引 物上分別引入限制性內切酶位點W便構建表達載體，W所述的第一鏈CDNA為模板，W所述 上游引物和所述下游引物為引物對，經PCR擴增后進行測序。
[0017] 進一步地，在所述步驟(2)中，所述構建含CHI基因的植物表達載體包括W下步驟： 先構建中間載體PJET-CHI，再用BamH巧PXbaI酶切中間載體PJET-CHI和表達載體pHB-n-f lag，回收CHI基因片段和抑B-n-f lag載體大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR 檢測和酶切驗證。P皿-n-flag是對P皿201表達載體在35s啟動子后插入flag改造獲得并保 存的表達載體。
[0018] 進一步地，所述構建中間載體UET-CHI包括W下具體步驟:通過高保真酶擴增CHI 基因前后分別引入BamHI和甜al酶切位點的基因全長，通過連接酶連接到PJET載體上。
[0019] 進一步地，在所述步驟(4)中，所述轉化包括W下步驟:外植體的預培養(yǎng);農桿菌與 外植體的共培養(yǎng);抗性再生植株的篩選;其中，
[0020] 所述預培養(yǎng)包括W下步驟:青葛種子用75%乙醇浸泡Imin,再用20%化Cio浸泡 20min，無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS固體培養(yǎng)基中， 25°C光照培養(yǎng)，即可獲得青葛無菌苗，待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉 化。
[0021] 所述共培養(yǎng)包括W下步驟:將所述葉片外植體轉到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，滴加含活化 好的所述含CHI基因植物雙元表達載體的根癌農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液 充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3天，W滴加在不帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸 液的葉片外植體為對照。
[0022] 所述篩選包括W下步驟:將所述共培養(yǎng)3天的青葛外植體轉入到發(fā)芽篩選基上于 25°C光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經過2-3次繼代培養(yǎng)后即可獲得潮霉素化yg)抗性叢 生芽，將所述生長良好的Hyg抗性叢生芽剪下轉入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根，即可獲得Hyg 抗性再生青葛植株。
[0023] 進一步地，在所述步驟(4)中，所述PCR檢測包括W下步驟:根據(jù)目的基因所在表達 盒p35s-CHI-nos序列p35s和CHI分別設計正向引物和反向引物;進行DNA擴增；紫外線下觀 察，若目的條帶為陽性，則該株系即為所述轉基因青葛植株;所述正向引物的DM序列如SEQ ID NO.4所示，所述反向引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
[0024] 進一步地，還包括步驟(5)對所述轉基因青葛中青葛素含量進行高效液相色譜法 及蒸發(fā)光散射檢測器測定化PLC-ELSD)測定，篩選獲得青葛素含量提高的轉基因青葛植株。
[0025] 優(yōu)先地，在所述步驟(5)中，所述HPLC-ELSD測定包括W下條件:所用色譜柱為C-18 反相硅膠柱，流動相選用體積比為70:30的甲醇和水，柱溫30°C，流速1.OmL/min，進樣量20y L，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)為7，載氣壓力化ar。
[0026] 本發(fā)明的轉CHI基因提高青葛中青葛素含量的方法，采用基因工程方法，將查爾酬 異構酶CHI基因導入青葛植株中，獲得了青葛素高含量顯著提高的轉基因青葛株系，轉CHI 基因青葛中青葛素的含量最高可達到干重的12mg/g，是非轉化普通青葛(8mg/g干重）的1.5 倍，該發(fā)明對于為青葛素的規(guī)模化生產提供高產、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。
【附圖說明】
[0027] 圖1是攜帶有轉CHI基因的青葛與非轉化普通青葛的青葛素含量檢測結果圖。
【具體實施方式】
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