本發(fā)明屬于微生物農(nóng)業(yè)
技術領域：
，具體涉及川圓芝1號靈芝新菌株及其繁殖方法。
背景技術：
：靈芝是我國傳統(tǒng)名貴的藥用真菌，素有“仙草”、“瑞草”的美名，具有多種生理活性和藥理作用，能有效增強人體免疫能力，抑制腫瘤發(fā)生。我國人工栽培靈芝已有多年的歷史，目前市場銷售的靈芝產(chǎn)品有野生靈芝和人工栽培靈芝，其中人工栽培靈芝占主要部分。市場調查顯示，目前市場上靈芝貨源豐富，價格不高。靈芝優(yōu)等品要求菌蓋直徑10cm以上、厚度≧1cm，單個不連朵、菌蓋近圓形、美觀。客戶對產(chǎn)品要求嚴格，優(yōu)等品能賣35-45元/公斤，而菌蓋小、畸形的靈芝每公斤售價僅為十多元。因此，高產(chǎn)優(yōu)質靈芝新菌株和品種選育能夠進一步提升靈芝的栽培效益?；谝陨戏治觯瑑?yōu)質的農(nóng)藝性狀，高含量的功效成分的新品種能有效拓寬靈芝人工栽培效益，促進靈芝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術問題提供高產(chǎn)優(yōu)質靈芝新菌株。本發(fā)明的技術方案是提供了一種靈芝新菌株ganodermalucidum川圓芝1號。該菌株的保藏號為cgmccno.13174。保藏時間為2016年10月21日，保藏地點為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。具體的，所述靈芝菌株的its序列具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了所述靈芝菌株的繁殖方法，具體如下：川圓芝1號的菌種擴繁生產(chǎn)需嚴格遵循無菌操作原則，母種生產(chǎn)用pda培養(yǎng)基培養(yǎng)，原種和栽培種生產(chǎn)采用以棉籽殼、木屑為主料，麥麩為輔料組成的培養(yǎng)基；培養(yǎng)及栽培條件：菌絲生長溫度15℃～38℃，出芝溫度20℃～35℃。優(yōu)選的，菌絲生長溫度24℃～26℃。優(yōu)選的，出芝溫度為26℃～28℃。本發(fā)明還提供了上述的靈芝菌株在制備藥品或者保健食品中的用途。本發(fā)明的優(yōu)質靈芝新菌株川圓芝1號具有以下優(yōu)點：(1)遺傳性狀穩(wěn)定，適應性廣，產(chǎn)量高。(2)芝形近圓形，外觀均一度高，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。(3)適應性強，可適宜于廣泛的大面積推廣種植。(4)功效成分含量高，氨基酸含量為干重的4.217％，蛋白質含量為干重的13.5％，多糖含量1.27％，三萜含量0.87％，是保健品、藥品等生產(chǎn)的優(yōu)質原材料，具有十分可觀的經(jīng)濟效益。本發(fā)明提供的新菌株鑒定為多孔菌科靈芝屬赤芝種(ganodermalucidum)，命名為川圓芝1號。該菌株保藏于：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編：100101。保藏號：cgmccno.13174，其生物學分類命名為：ganodermalucidum。附圖說明圖1、川圓芝1號菌絲形態(tài)(左)、孢子形態(tài)(中)及子實體形態(tài)(右)。圖2、基于its序列構建的系統(tǒng)進化樹。圖3、32個靈芝菌株p2引物電泳圖。圖4、32個靈芝菌株issr聚類圖譜。圖5、川圓芝1號與川芝6號拮抗試驗圖。圖6、川圓芝1號(成都大邑段木生產(chǎn)圖)。具體實施方式本發(fā)明的靈芝菌株為發(fā)明人從福建省尤溪縣研究選育的的菌株，經(jīng)進一步系統(tǒng)選育而成的新品系，經(jīng)鑒定為多孔菌科靈芝屬赤芝種(ganodermalucidum)，命名為川圓芝1號。該菌株保藏于：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：cgmccno.13174，其生物學分類命名為：ganodermalucidum。該菌株的形態(tài)特征如下：1、形態(tài)特征菌絲：川圓芝1號菌絲白色、粗壯，在斜面上有時有轉色現(xiàn)象；子實體成熟后木質化，菌蓋土黃色(孢子粉色澤)，“川圓芝1號”孢子為褐色、卵圓形；菌絲濃白、粗壯；子實體腎形至近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm；菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。2、生物學特性營養(yǎng)成分來源：川圓芝1號品種可pda培養(yǎng)基保存，適宜在4℃冰箱低溫冷藏保存，每3個月轉接1次。川圓芝1號的菌種擴繁生產(chǎn)需嚴格遵循無菌操作原則，母種生產(chǎn)適宜用pda培養(yǎng)基培養(yǎng)；原種和栽培種生產(chǎn)適宜用以棉籽殼、木屑為主料，麥麩為輔料組成的培養(yǎng)基。培養(yǎng)及栽培條件：菌絲生長溫度15℃～38℃，最適24℃～26℃；出芝溫度20℃～35℃，最適26℃～28℃。實施例1菌株的篩選與鑒定(1)親本的來源：為了豐富四川省靈芝種質資源，選育出優(yōu)良的靈芝品種，解決生產(chǎn)上的用種問題，2013年發(fā)明人從福建省引育了靈芝菌株，通過獲得的菌株多次分離純化進行系統(tǒng)栽培選育研究。(2)初篩：將獲得的菌株進行小規(guī)模栽培，了解菌株的子實體形態(tài)。篩選農(nóng)藝性狀較好(子實體近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm；菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤)的菌株進行復篩。(3)復篩：擴大栽培規(guī)模，了解初篩的菌株產(chǎn)量、抗雜性和穩(wěn)定性等。表132個靈芝菌株產(chǎn)量及多糖數(shù)據(jù)(表1的32個菌株是對應表2的32個菌株。結合多糖含量高及農(nóng)藝性狀篩選出31號菌株)(4)菌株真實性鑒定：依據(jù)《ny/t1730-2009食用菌菌種真實性鑒定issr法》，一共32株菌株(表2)，進行菌株(菌種)真實性鑒定，鑒定所用的引物見表3。表232個靈芝菌株編號編號菌株名稱菌株來源編號菌株名稱菌株來源1slz177攀枝花野生分離17slz194攀枝花野生分離2slz178攀枝花野生分離18slz195攀枝花野生分離3slz179攀枝花野生分離19slz196攀枝花野生分離4slz180攀枝花野生分離20slz197攀枝花野生分離5slz181攀枝花野生分離21slz198攀枝花野生分離6slz183攀枝花野生分離22slz199攀枝花野生分離7slz184攀枝花野生分離23slz200攀枝花野生分離8slz185攀枝花野生分離24slz201攀枝花野生分離9slz186攀枝花野生分離25slz202攀枝花野生分離10slz187攀枝花野生分離26slz203攀枝花野生分離11slz188攀枝花野生分離27slz204攀枝花野生分離12slz189攀枝花野生分離28slz205攀枝花野生分離13slz190攀枝花野生分離29zzmy綿陽梓潼14slz191攀枝花野生分離30pzno.1攀枝花野生分離15slz192攀枝花野生分離31cyzno.1川圓芝1號16slz193攀枝花野生分離32czno.6四川主栽川芝6號表310個引物序列編號引物名稱引物序列復性溫度1issr807agagagagagagagagt(seqidno.4)49℃2issr810gagagagagagagagat(seqidno.5)47℃3issr811gagagagagagagagac(seqidno.6)49℃4issr816cacacacacacacacat(seqidno.7)47℃5issr861accaccaccaccaccacc(seqidno.8)54℃6issr866ctcctcctcctcctcctc(seqidno.9)49℃7issr873gacagacagacagaca(seqidno.10)49℃8issr878ggatggatggatggat(seqidno.11)49℃9e45846acttccccacaggttaacaca(seqidno.12)54℃10e26637agagagagagagagagg(seqidno.13)54℃指紋圖譜(圖3)結果顯示，川圓芝1號與現(xiàn)有品種及其他對照菌株在分子生物學水平上均存在著差異性。用its序列構建系統(tǒng)進化樹(圖2、圖4)鑒定出川圓芝1號為赤芝，且與現(xiàn)有品種及其他對照菌株在分子生物學水平上均存在一定的差異性。為了進一步驗證菌種真實性，設置并完成了相關拮抗實驗。依據(jù)《ny/t1845-2010食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應》，32株菌株，進行菌株(菌種)區(qū)別性鑒定結果顯示，川圓芝1號與現(xiàn)有品種及其他野生靈芝菌株均存在著差異性，這就進一步證實了川圓芝1號菌株區(qū)別于現(xiàn)有的靈芝菌株(圖5)。對鑒定的川圓芝1號進行培養(yǎng)，其菌絲形態(tài)(圖1左)、孢子形態(tài)(圖1中)及子實體形態(tài)(圖1右)。經(jīng)觀察，形態(tài)如下：菌絲：濃白、粗壯，直徑4.0～6.0μm。孢子：褐色、卵圓形，直徑8～11.5μm。子實體腎形至近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm，菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。川圓芝1號經(jīng)特異性引物its1(seqidno.2)：tccgtaggtgaacctgcgg，its4(seqidno.3)：tcctccgcttattgatatgc的pcr擴增，通過構建進化樹，鑒定川圓芝1號為赤芝ganodermalucidum。seqidno.1川圓芝1號的its序列如下(seqidno.1)：ggctttcgaagctacgacgtggatgtagcaggccttccgaggcatgtgcacgccctgctcatccactctacacctgtgcacttactgtgggcttcagattgcgaggcacgctctttaccgggcttgcggagcatatctgtgcctgcgtttatcacaaactctataaagtaacagaatgtgtattgcgatgtaacacatctatatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacctacaagcttttgtggtttgtaggcttggacttggaggcttgtcggccgttatcggtcggctcctcttaaatgcattagcttggttccttgcggatcggctctcggtgtgataatgtctacgccgtgaccgtgaagcgtttggcgagcttctaaccgtcttataagacagctttatgacctctgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa。實施例2栽培區(qū)域對比試驗為明確新菌株“川圓芝1號”的栽培推廣價值，按照四川省農(nóng)作物品種審定委員會《食用菌品種審定標準》，連續(xù)二季(即2年)開展了川圓芝1號袋栽試驗的不公開區(qū)域試驗(以下簡稱區(qū)試)。供試參比品種：以目前四川省生產(chǎn)上大面積栽培的品種川芝6號，并作為川圓芝1號的對照。同批制作川圓芝1號和川芝6號的栽培種備用。栽培料配方：棉籽殼60％，木屑30％，玉米粉4％，麩皮5％，石膏1％。含水量65％，ph自然。供試栽培料干燥、不霉變。裝料筒袋：使用聚乙烯塑料袋塑料筒袋作為供試品種栽培料基質的盛裝容器。筒袋規(guī)格(長度×折徑×厚度)為33cm×17cm×0.025cm。(1)第一年區(qū)域試驗用袋栽進行區(qū)域試驗，每個品種栽培350袋，共設3個重復，每個重復100袋，在室內(nèi)床架上進行栽培出芝管理。結果表明(表4)：川圓芝1號平均每袋產(chǎn)鮮靈芝158.3g，較川芝6號增產(chǎn)10.1％。產(chǎn)品質量高于國家藥典標準，川圓芝1號子實體菌蓋直徑10～25cm，蓋厚1.5～2.0cm，菌柄長2～4cm，菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。表4川圓芝1號的區(qū)域試驗(金堂趙家鎮(zhèn))(2)第二年區(qū)域試驗用袋栽進行區(qū)域試驗，每個品種栽培350袋，共設3個重復，每個重復100袋，在室內(nèi)床架上栽培，按常規(guī)方法進行管理。結果表明(表5)：川圓芝1號平均每袋產(chǎn)鮮靈芝157.7g，比川芝6號增產(chǎn)11.0％。川圓芝1號產(chǎn)品質量達到同類品種標準。子實體呈腎形至近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm，菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。表5川圓芝1號的區(qū)域試驗(成都大邑)“川圓芝1號”品種子實體的成熟期、形態(tài)特征和產(chǎn)量等綜合農(nóng)藝性狀在同一地區(qū)相同栽培環(huán)境條件下表現(xiàn)較為一致；在不同地區(qū)(兩個區(qū)域點)表現(xiàn)出的總體效果較為一致。這表明，“川圓芝1號”的遺傳性狀穩(wěn)定并具有適應性廣的特點。比對照增產(chǎn)幅度較大，豐產(chǎn)性好。具有在生產(chǎn)上大面積推廣應用的價值。實施例3段木生產(chǎn)試驗為探究“川圓芝1號”菌種用于段木生產(chǎn)的栽培情況，在四川金堂、大邑等地進行了不公開段木生產(chǎn)試驗(圖6)，“川圓芝1號”抗性強于川芝6號，污染率為5％，低于對照川芝6號?！按▓A芝1號”在金堂的產(chǎn)量為553kg/畝，較對照增產(chǎn)10.5％；“川圓芝1號”在大邑的產(chǎn)量為556kg/畝，較對照增產(chǎn)11.2％。子實體呈腎形至近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm，菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。試驗結果見表6。通過段木生產(chǎn)試驗可以看出：“川圓芝1號”在菌絲長勢，污染率上明顯優(yōu)于川芝6號，同時“川圓芝1號”具有更整齊的芝體，同時具有更高的產(chǎn)量。在農(nóng)藝性狀及栽培效益上都超過了川芝6號。表6川圓芝1號生產(chǎn)試驗實施例4品質分析及藥用成分委托中國測試技術研究院對子實體成分含量測定的結果顯示川圓芝1號的氨基酸含量為干重的4.217％，蛋白質含量為干重的13.5％，多糖含量1.27％，三萜含量0.87％。(《中國藥典》2015年版，多糖含量不得少于0.90％；三萜及甾醇以齊墩果酸，不得少于0.50％)。因此，川圓芝1號完全符合國家藥典的標準，且功效成分含量較高，具有較高的藥用價值。表7川圓芝1號的成分含量測定結果sequencelisting<110>四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所<120>川圓芝1號靈芝新菌株及其繁殖方法<130>a170156k<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>613<212>dna<213>ganodermalucidum<400>1ggctttcgaagctacgacgtggatgtagcaggccttccgaggcatgtgcacgccctgctc60atccactctacacctgtgcacttactgtgggcttcagattgcgaggcacgctctttaccg120ggcttgcggagcatatctgtgcctgcgtttatcacaaactctataaagtaacagaatgtg180tattgcgatgtaacacatctatatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatc240gatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcg300aatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtca360tgaaatcttcaacctacaagcttttgtggtttgtaggcttggacttggaggcttgtcggc420cgttatcggtcggctcctcttaaatgcattagcttggttccttgcggatcggctctcggt480gtgataatgtctacgccgtgaccgtgaagcgtttggcgagcttctaaccgtcttataaga540cagctttatgacctctgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatca600ataagcggaggaa613<210>2<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>引物its1<400>2tccgtaggtgaacctgcgg19<210>3<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>引物its4<400>3tcctccgcttattgatatgc20<210>4<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr807<400>4agagagagagagagagt17<210>5<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr810<400>5gagagagagagagagat17<210>6<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr811<400>6gagagagagagagagac17<210>7<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr816<400>7cacacacacacacacat17<210>8<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr861<400>8accaccaccaccaccacc18<210>9<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr866<400>9ctcctcctcctcctcctc18<210>10<211>16<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr873<400>10gacagacagacagaca16<210>11<211>16<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr878<400>11ggatggatggatggat16<210>12<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>引物e45846<400>12acttccccacaggttaacaca21<210>13<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物e26637<400>13agagagagagagagagg17當前第1頁12