本發(fā)明涉及林木無(wú)性繁殖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種杉木野外優(yōu)異資源的繁育方法。
背景技術(shù)：
杉木(cunninghamialanceolata)具有生長(zhǎng)快、材質(zhì)好、出材率高等特點(diǎn)，是我國(guó)南方重要的商品用材和造林樹(shù)種。目前我國(guó)杉木遺傳改良工作已進(jìn)入第四代改良階段，選育了大批具有優(yōu)良特性的基因資源，成效顯著。由于林木自身的生長(zhǎng)特性、林地自然條件的復(fù)雜性以及人工林砍伐利用等壓力，如何使優(yōu)異基因資源得到及時(shí)有效地保存，以及如何使科研成果得到及時(shí)轉(zhuǎn)化是備受重視的熱點(diǎn)問(wèn)題。利用傳統(tǒng)的嫁接、扦插、種子園等方法進(jìn)行資源的保存和繁育，具有周期長(zhǎng)、成本高、成效低等問(wèn)題，因而應(yīng)用現(xiàn)代育種技術(shù)縮短育種周期，提高育種效率也是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必由之路。植物組織培養(yǎng)是保存珍稀基因資源的重要途徑，也是快速繁殖植物新品種的重要方法，在保持品種優(yōu)良遺傳特性的同時(shí)，可在短期內(nèi)大量繁育優(yōu)質(zhì)苗木供生產(chǎn)應(yīng)用，極大促進(jìn)了工業(yè)用材林的良種化進(jìn)程。
但在林木組織培養(yǎng)中，解決成年樹(shù)木生理年齡幼化是主要難點(diǎn)之一，傳統(tǒng)方式主要采用砍伐或基部環(huán)割等手段，并結(jié)合除雜、光照、激素處理等技術(shù)，以促進(jìn)大樹(shù)伐樁或基部環(huán)割部位萌條的產(chǎn)生，此方法不僅操作困難而且成效不高，同時(shí)存在資源滅絕等風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何經(jīng)濟(jì)、高效地保存和繁育林木野外優(yōu)異基因資源迫在眉睫。杉木組織培養(yǎng)外植體材料有取自成熟種子的成熟胚、成熟和未成熟合子、子葉、下胚軸、種子萌發(fā)的嫩芽、大樹(shù)基部萌芽、幼苗莖和葉等，但利用野外成年大樹(shù)側(cè)枝為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)繁殖時(shí)，由于生理年齡和位置效應(yīng)等限制，常存在繁殖系數(shù)低、苗木品質(zhì)差等問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種有效的杉木野外優(yōu)異基因資源的繁育方法，該方法能顯著縮短其繁育和利用周期，極大提高杉木優(yōu)異基因資源的保存時(shí)間和效率，有效解決了杉木基因資源繁育和利用過(guò)程中高成本、低效率等問(wèn)題，對(duì)保護(hù)原有資源，節(jié)省土地利用，培育杉木高品質(zhì)苗木，促進(jìn)速生優(yōu)質(zhì)杉木人工林產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展具有重大意義。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供了一種杉木野外優(yōu)異資源的繁育方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)以野外杉木植株半木質(zhì)化側(cè)枝作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到一代組培苗；
(2)將所述一代組培苗經(jīng)煉苗后，移植于圃地中；
(3)當(dāng)苗木長(zhǎng)至一定高度時(shí)，壓彎苗木主干，用土壤覆蓋苗木主干基部至苗木中段，并將苗木基部的部分主干裸露在外，進(jìn)行栽培；
(4)選擇所述裸露主干萌發(fā)出的半木質(zhì)化萌條進(jìn)行再次繁育。
優(yōu)選的，步驟(4)中，所述再次繁育為將所述半木質(zhì)化萌條進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到叢生芽，用于杉木資源的離體保存。
優(yōu)選的，步驟(4)中，所述再次繁育為將所述半木質(zhì)化萌條進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到高品質(zhì)的組培苗，用于生產(chǎn)應(yīng)用。
優(yōu)選的，步驟(4)中，所述再次繁育為將所述半木質(zhì)化萌條進(jìn)行扦插繁育，得到高品質(zhì)的扦插苗，用于生產(chǎn)應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述步驟(1)中的組織培養(yǎng)包括不定芽的誘導(dǎo)，芽的增殖培養(yǎng)和芽的生根培養(yǎng)；
其中，所述不定芽的誘導(dǎo)所用培養(yǎng)基的配方為：ms+6-芐氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/l；
所述芽的增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為：ms+6-芐氨基腺嘌呤0.05～0.2mg/l+萘乙酸0.005～0.02mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l；
所述芽的生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為：1/2ms+萘乙酸0.3～0.8mg/l+蔗糖20～30g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l。
優(yōu)選的，所述外植體在進(jìn)行組織培養(yǎng)前還包括滅菌的步驟，所述滅菌用75％酒精溶液和質(zhì)量濃度為0.5％的次氯酸鈉溶液進(jìn)行滅菌。
優(yōu)選的，所述組織培養(yǎng)的條件為：溫度控制在25±2℃，相對(duì)濕度50％～60％，光照強(qiáng)度1500lx～3000lx，光照時(shí)間為每天12h～16h。
優(yōu)選的，步驟(2)中，所述煉苗在大棚中進(jìn)行，采用自然光照和濕度，溫度控制在25～30℃；當(dāng)組培苗根系長(zhǎng)至1.0～1.5cm時(shí)，向組培苗中注入清水，使水面超過(guò)培養(yǎng)基表面0.5～1.0cm，開(kāi)蓋煉苗2～5天。
優(yōu)選的，步驟(3)中，所述苗木高80～100cm時(shí)，壓彎苗木主干，所述土壤覆蓋厚度為3～5cm，所述裸露基部主干長(zhǎng)度為10～15cm。
優(yōu)選的，步驟(4)中，ms+6-芐氨基腺嘌呤0.3～0.8mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/l。
優(yōu)選的，步驟(4)中，dcr+6-芐氨基腺嘌呤0.8～1.5mg/l+苯基噻二唑基脲0.01～0.1mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l。
優(yōu)選的，步驟(4)中，所述組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為：1/2ms+萘乙酸0.3～0.8mg/l+蔗糖20～30g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l。
優(yōu)選的，所述叢生芽長(zhǎng)為1.5～2.0cm時(shí)，進(jìn)行芽叢的分離和轉(zhuǎn)瓶。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明的杉木野外優(yōu)異資源的繁育方法，以野外杉木植株半木質(zhì)化側(cè)枝作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到的組培苗經(jīng)煉苗移栽后，采用壓干促萌方法，打破杉木成年大樹(shù)側(cè)枝具有的生理年齡和位置效應(yīng)，獲得高品質(zhì)、幼態(tài)化的無(wú)性繁殖材料；再將得到的無(wú)性繁殖材料經(jīng)組織培養(yǎng)后，得到可大量擴(kuò)繁的杉木叢生芽和生根苗，從而實(shí)現(xiàn)杉木野外優(yōu)異基因資源的快速繁育，能夠高效保存杉木優(yōu)異離體資源，快速繁育高品質(zhì)的杉木組培苗木。建立了“組培苗—采穗圃—扦插繁育”相互對(duì)接又相互促進(jìn)的生產(chǎn)模式，實(shí)現(xiàn)了資源的有效保存以及無(wú)性系苗木的規(guī)?；a(chǎn)。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明杉木野外優(yōu)異資源離體保存和快速繁育方法的流程圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種杉木野外優(yōu)異資源的繁育方法，包括以下步驟：
(1)以野外杉木植株半木質(zhì)化側(cè)枝作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到一代組培苗；
(2)將所述一代組培苗經(jīng)煉苗后，移植于圃地中；
(3)當(dāng)苗木長(zhǎng)至一定高度時(shí)，壓彎苗木主干，用土壤覆蓋苗木主干基部至苗木中段，并將苗木基部的部分主干裸露在外，進(jìn)行栽培；
(4)選擇所述裸露主干萌發(fā)出的半木質(zhì)化萌條進(jìn)行再次繁育。
本發(fā)明中，杉木外植體優(yōu)選為杉木優(yōu)良資源。本發(fā)明實(shí)施例中的杉木外植體采集的是野外資源。對(duì)杉木種源、家系或無(wú)性系測(cè)定林中經(jīng)測(cè)定分析后篩選出的杉木優(yōu)良單株，或者杉木成熟人工林中選擇的優(yōu)異個(gè)體，采集該植株中上部的半木質(zhì)化側(cè)枝，除去葉片后，作為本發(fā)明組織培養(yǎng)的外植體。
將采集的外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，培育杉木一代組培苗。
本發(fā)明中，采集的外植體先進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理采用中性洗衣粉和吐溫-80的混合液浸泡振蕩，除去外部污物。優(yōu)選浸泡振蕩的時(shí)間為3～5min。將浸泡后的外植體用清水沖洗。優(yōu)選清水沖洗的時(shí)間為20～30min。
將預(yù)處理后的外植體進(jìn)行消毒滅菌。
本發(fā)明中，進(jìn)行消毒滅菌的外植體長(zhǎng)度優(yōu)選為3～4cm，更優(yōu)選為3.5cm。
本發(fā)明中，外植體依次用75％酒精和0.5％次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒滅菌。其中，外植體用75％酒精溶液浸泡的時(shí)間優(yōu)選為20s～1min，更優(yōu)選為30s。酒精浸泡后取出，用無(wú)菌水沖洗。本發(fā)明中優(yōu)選用無(wú)菌水沖洗2～3次。將沖洗后的外植體再用0.5％次氯酸鈉溶液浸泡，浸泡的同時(shí)輕微震蕩。本發(fā)明中，優(yōu)選0.5％次氯酸鈉溶液浸泡的時(shí)間為10～15min，更優(yōu)選為12～14min。取出外植體材料用無(wú)菌水沖洗，優(yōu)選無(wú)菌水沖洗3～5次，更優(yōu)選為4次。用無(wú)菌試紙吸去側(cè)枝上多余的水分后，進(jìn)行組織培養(yǎng)。
本發(fā)明的一代組織培養(yǎng)過(guò)程包括不定芽的誘導(dǎo)，芽的增殖培養(yǎng)和芽的生根培養(yǎng)。
本發(fā)明的組織培養(yǎng)優(yōu)選在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)瓶的材質(zhì)沒(méi)有特殊限定，透明培養(yǎng)瓶均能夠應(yīng)用于本發(fā)明中。本發(fā)明優(yōu)選采用玻璃培養(yǎng)瓶。本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)瓶的大小沒(méi)有特殊限定。在本發(fā)明具體實(shí)施例中，采用培養(yǎng)瓶的容積為240ml，高90mm，口徑62mm。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)材料來(lái)源選擇合適的培養(yǎng)瓶進(jìn)行杉木資源的組織培養(yǎng)。
本發(fā)明中，將滅菌后的外植體插入裝有無(wú)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/l，優(yōu)選為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.6～0.8mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l+聚乙烯吡咯烷酮10mg/l。此配方的主要特點(diǎn)是，在ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上只添加細(xì)胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤，不添加生長(zhǎng)素，以充分誘導(dǎo)芽的分化和形成，同時(shí)添加聚乙烯吡咯烷酮，抑制杉木外植體材料酚類(lèi)物質(zhì)的分泌，預(yù)防外植體材料的褐化過(guò)程。采用此配方得到的外植體材料芽的誘導(dǎo)率為1～5倍。本發(fā)明在不定芽的誘導(dǎo)過(guò)程中，優(yōu)選插入的外植體長(zhǎng)度為3.0～3.5cm，每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?yōu)選接種1～2段外植體材料。將培養(yǎng)瓶加蓋密封后放于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，獲得無(wú)菌芽。
本發(fā)明中，將得到的無(wú)菌芽切割成合適大小的芽段后，接種到裝有無(wú)菌增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明中，增殖培養(yǎng)基的配方為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.05～0.2mg/l+萘乙酸0.005～0.02mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l，優(yōu)選為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.1mg/l+萘乙酸0.01mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l。第一代組培，以快速出苗為目的，所以此配方主要是促進(jìn)芽的高生長(zhǎng)，配方中細(xì)胞分裂素含量較低，同時(shí)添加了生長(zhǎng)素，經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)比后以細(xì)胞分裂素：生長(zhǎng)素＝10:1的效果最好，芽的增殖倍數(shù)為1～2倍，高生長(zhǎng)明顯。本發(fā)明中，優(yōu)選芽段的長(zhǎng)度為1.5～2.5cm，更優(yōu)選為2.0cm，每個(gè)培養(yǎng)瓶中優(yōu)選接種10～12個(gè)芽段。加蓋密封后放于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
本發(fā)明中，將得到的有效芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。所述有效芽為長(zhǎng)度超過(guò)3cm、生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠的杉木芽。剪取有效芽帶頂梢部分，插入裝好無(wú)菌生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明中，生根培養(yǎng)基配方為1/2ms+萘乙酸0.3～0.8mg/l+蔗糖20～30g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l，優(yōu)選為1/2ms+萘乙酸0.5mg/l+蔗糖25g/l+卡拉膠7g/l。此配方中只添加了生長(zhǎng)素，不添加細(xì)胞分裂素，目的是促進(jìn)芽苗根系的形成和生長(zhǎng)，生根率達(dá)到80％～85％。本發(fā)明中，優(yōu)選每個(gè)培養(yǎng)瓶接種10～12個(gè)芽，加蓋密封后放于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
本發(fā)明的組織培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)培養(yǎng)基的配制方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基配制方法進(jìn)行配制。本發(fā)明對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所用的原料來(lái)源沒(méi)有特殊限定，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的組織培養(yǎng)原料，采用市售商品即可。
本發(fā)明將杉木組織培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶置于無(wú)菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)。本發(fā)明中，優(yōu)選組織培養(yǎng)的溫度控制在23～27℃，優(yōu)選為25℃，相對(duì)濕度為50％～60％，優(yōu)選為53％～57％；光照強(qiáng)度為1500lx～3000lx，優(yōu)選為2000lx～2500lx；光照時(shí)間為每天12～16h，更優(yōu)選為13～14h。
生根培養(yǎng)15～25天的苗木，會(huì)在基部形成腫脹的愈傷組織或者根系呈“露白”狀，為生根苗。
將生根苗進(jìn)行煉苗處理。優(yōu)選煉苗在塑料大棚中進(jìn)行。煉苗過(guò)程采用自然光照和濕度，溫度控制在25～30℃，更優(yōu)選為26～28℃。煉苗過(guò)程中，為了使每瓶苗都有自然光照射，優(yōu)選將培養(yǎng)瓶單層擺放。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的苗根系長(zhǎng)至1.0～1.5cm時(shí)，在培養(yǎng)瓶中注入清水，使水面超過(guò)培養(yǎng)基表面0.5～1.0cm，開(kāi)蓋煉苗2～5天，優(yōu)選為3～4天后進(jìn)行苗木移栽。
將煉苗后的生根苗木進(jìn)行移栽。優(yōu)選先將生根苗木移栽至育苗袋中進(jìn)行養(yǎng)殖，再將移栽成活的苗木移栽至圃地中。
本發(fā)明中，將煉苗后的生根苗木移栽至育苗袋中。優(yōu)選將生根苗木附著的培養(yǎng)基洗凈后，移栽入裝有紅泥的育苗袋中。如遇晴天，移栽應(yīng)在下午4：00后進(jìn)行，陰雨天可全天移栽，清洗后的苗木要在當(dāng)天全部移栽完。苗木移栽后可加蓋薄膜和75％蔭網(wǎng)，移栽第一個(gè)星期內(nèi)，苗木生長(zhǎng)環(huán)境濕度保持在90％左右，第二個(gè)星期后濕度保持在75％～85％左右，一個(gè)月后可撤掉薄膜只保留蔭網(wǎng)，此時(shí)苗木可按常規(guī)育苗措施進(jìn)行管護(hù)。
將移栽成活的苗木移栽至圃地中。本發(fā)明中，優(yōu)選苗木高達(dá)10～15cm時(shí)，剝掉育苗袋栽植到圃地中。本發(fā)明對(duì)杉木苗在圃地的移栽和種植方式?jīng)]有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的移栽種植方式即可。本發(fā)明優(yōu)選移栽的圃地要平坦，適合于杉木的種植。
本發(fā)明對(duì)圃地的整地方式?jīng)]有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的整地方式即可。在整地后的圃地中作畦，作畦方式依圃地地形而定。在本發(fā)明中，優(yōu)選畦寬100～150cm，畦高20～30cm，畦距30～40cm，四周開(kāi)設(shè)排水溝。本發(fā)明中，將杉木苗采用雙行品字形栽植方法進(jìn)行移栽。優(yōu)選每個(gè)基因型杉木栽植30～50株，株距60～80cm。本發(fā)明中，優(yōu)選栽植前施復(fù)合肥做基肥，用量為15～20g/株。
當(dāng)圃地中的杉木苗長(zhǎng)至高80～100cm時(shí)，進(jìn)行壓干促萌。具體方法為：清除基部雜草和側(cè)枝，翻松苗木周邊土壤，壓彎苗木主干，然后用疏松土壤覆蓋苗木主干基部至中部，覆土厚度優(yōu)選為3～5cm，并裸露主干基部10～15cm。2～3個(gè)月后，苗木基部主干上即萌發(fā)出大量嫩芽。嫩芽數(shù)量多、長(zhǎng)勢(shì)一致、生理機(jī)能旺盛、形體發(fā)生能力強(qiáng)、滅菌容易、芽的誘導(dǎo)率高，是高品質(zhì)、幼態(tài)化的無(wú)性繁殖材料。
采集萌發(fā)的半木質(zhì)化萌條作為離體保存的外植體材料。本發(fā)明中，離體保存的方法優(yōu)選為：將萌發(fā)的半木質(zhì)化萌條保濕密封后，存放于4～10℃的環(huán)境中。本發(fā)明中，優(yōu)選用濕毛巾將萌條包好進(jìn)行保濕。本發(fā)明中，優(yōu)選將采集的萌條進(jìn)行編號(hào)后密封。本發(fā)明優(yōu)選采用密封袋密封的方式。將材料運(yùn)輸至保藏地點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選將采集的萌條置于裝有冰塊的泡沫箱里，泡沫箱內(nèi)溫度控制在4～10℃，要求冰塊不能與材料直接接觸。
本發(fā)明中，萌發(fā)的半木質(zhì)化的萌條也可以作為杉木繁育的無(wú)性材料。
作為一種可實(shí)施的方式，將半木質(zhì)化萌條作為組織培養(yǎng)的外植體，進(jìn)行杉木資源的再次繁育；或?qū)肽举|(zhì)化萌條作為扦插繁殖材料，進(jìn)行杉木資源的再次繁育。
本發(fā)明中，將采集的萌條進(jìn)行預(yù)處理和消毒滅菌，作為組織培養(yǎng)的外植體。材料的預(yù)處理按照上述預(yù)處理的方式進(jìn)行。將預(yù)處理后的外植體依次用70％酒精和0.5％次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒滅菌。其中，外植體用70％酒精溶液浸泡的時(shí)間優(yōu)選為20～50s，更優(yōu)選為30s。酒精浸泡后取出，用無(wú)菌水沖洗。本發(fā)明中優(yōu)選用無(wú)菌水沖洗1～2次。將沖洗后的外植體再用0.5％次氯酸鈉溶液浸泡，浸泡的同時(shí)輕微震蕩。本發(fā)明中，優(yōu)選0.5％次氯酸鈉溶液浸泡2次，每次浸泡的時(shí)間為5～6min，浸泡完后用無(wú)菌水沖洗，優(yōu)選無(wú)菌水沖洗2～3次。用無(wú)菌試紙吸去外植體材料上多余的水分后，進(jìn)行二代組織培養(yǎng)。
本發(fā)明在二代組織培養(yǎng)的不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.3～0.8mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/l，優(yōu)選為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.5mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l+聚乙烯吡咯烷酮10mg/l。此配方在ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上只添加細(xì)胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤，不添加生長(zhǎng)素，以充分誘導(dǎo)芽的分化和形成，同時(shí)添加聚乙烯吡咯烷酮抑制杉木外植體材料酚類(lèi)物質(zhì)的分泌，預(yù)防外植體材料的褐化過(guò)程，而且由于二代組織培養(yǎng)的外植體材料比一代的幼嫩，所以減少了6-芐氨基腺嘌呤的添加量。采用此配方外植體材料芽的誘導(dǎo)率為2～5倍。其余培養(yǎng)方式及條件同一代組織培養(yǎng)的不定芽誘導(dǎo)過(guò)程。
本發(fā)明在二代組織培養(yǎng)的芽增殖培養(yǎng)過(guò)程中，增殖培養(yǎng)基配方為dcr+6-芐氨基腺嘌呤0.8～1.5mg/l+苯基噻二唑基脲0.01～0.1mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉膠6.5～7.5g/l，優(yōu)選為dcr+6-芐氨基腺嘌呤1.0mg/l+苯基噻二唑基脲0.05mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l。二代組織培養(yǎng)的芽增殖培養(yǎng)過(guò)程以獲得最優(yōu)增殖系數(shù)為目的，此配方以促進(jìn)芽的分化和增殖為目標(biāo)，添加了2種細(xì)胞分裂素，同時(shí)去除生長(zhǎng)素，經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩選出的配方可有效誘導(dǎo)出叢生芽，平均增殖倍數(shù)為3倍，而且芽苗生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠，平均繼代周期1.5個(gè)月。其余培養(yǎng)方式及條件同一代組織培養(yǎng)的芽增殖培養(yǎng)過(guò)程。
增殖培養(yǎng)1.5～2.0個(gè)月后，即可形成叢生芽，增殖倍數(shù)可達(dá)2.5～3.0倍；當(dāng)芽長(zhǎng)為1.5～2.0cm時(shí)，即可進(jìn)行芽叢的分離和轉(zhuǎn)瓶。增殖培養(yǎng)基配方和接種方法保持不變，培養(yǎng)1.5～2.0個(gè)月后，再重復(fù)以上操作。經(jīng)過(guò)這樣的周期循環(huán)，即可快速實(shí)現(xiàn)芽的幾何倍數(shù)增殖，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)杉木野外優(yōu)異基因資源的高效離體保存。
利用增殖培養(yǎng)得到的有效芽繁殖杉木苗木。具體方法為，將有效芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)的方式及過(guò)程同一代組織培養(yǎng)過(guò)程中的生根培養(yǎng)。將生根培養(yǎng)得到的組培苗經(jīng)煉苗后進(jìn)行移栽。煉苗及移栽方式采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的操作技術(shù)。在本發(fā)明具體實(shí)施例中，采用同上述描述方法進(jìn)行煉苗及移栽。移栽至育苗袋中的成活苗木，即實(shí)現(xiàn)快速繁育高品質(zhì)的杉木組培苗木，實(shí)現(xiàn)杉木優(yōu)異基因資源的高效保存和利用。
應(yīng)用本發(fā)明的方法，自2010年起，成功從野外收集并保存和快速繁育了已進(jìn)入中齡期的5個(gè)速生優(yōu)質(zhì)杉木無(wú)性系，建立了“組培苗—采穗圃—扦插繁育”相互對(duì)接又相互促進(jìn)的生產(chǎn)模式，實(shí)現(xiàn)了資源的有效保存以及無(wú)性系苗木的規(guī)?；a(chǎn)。5個(gè)速生優(yōu)質(zhì)杉木無(wú)性系保存組培瓶苗總計(jì)近50萬(wàn)株，每年可生產(chǎn)生根苗木約20萬(wàn)株，利用移栽成活的組培苗木營(yíng)建扦插采穗圃近5畝，每年可生產(chǎn)扦插苗木約30萬(wàn)株，有效緩解了廣東省當(dāng)前杉木優(yōu)質(zhì)壯苗供不應(yīng)求的局面。此外，結(jié)合本方法，還規(guī)范了廣東省杉木無(wú)性系規(guī)?；?，極大促進(jìn)了杉木優(yōu)異基因資源的保存和研究成果的快速應(yīng)用，對(duì)加速我國(guó)商品林建設(shè)中杉木優(yōu)質(zhì)林建設(shè)步伐，以及提升杉木商品林建設(shè)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力具有積極作用。
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
下面分別以杉木速生優(yōu)質(zhì)無(wú)性系7號(hào)和tl5號(hào)為例，詳細(xì)列舉本發(fā)明的具體方法。
按以下離體保存和快速繁育的配套方法進(jìn)行：
實(shí)施例1
(1)2013年10月15日，從位于廣東省韶關(guān)地區(qū)的8年生杉木無(wú)性系測(cè)定林中采集7號(hào)無(wú)性系中上部側(cè)枝，適當(dāng)修剪枝條，保留帶頂梢部分，枝條長(zhǎng)度10～15cm，用干凈的濕毛巾包好，放入塑料封口袋中，然后放入帶冰塊的泡沫箱里，要求冰塊不能直接接觸芽條，箱內(nèi)溫度控制在4℃～10℃，于采集當(dāng)天把材料帶回實(shí)驗(yàn)室及時(shí)處理。
(2)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，把野外采集回來(lái)的枝條去除所有葉片，放入容積為2l的干凈量杯中，加入小半勺中性洗衣粉和2滴吐溫-80浸泡并震蕩3min，然后置于流水下沖洗25min，取出材料，剪除已經(jīng)木質(zhì)化的部分，保留半木質(zhì)化枝條，放入超凈工作臺(tái)上干凈碟子中備用。
(3)在超凈工作臺(tái)上，把預(yù)處理后的材料截成3.5cm長(zhǎng)的小段，然后用75％酒精溶液浸泡加震蕩30s，用干凈的鑷子取出材料，無(wú)菌水沖洗2次，再放入0.5％次氯酸鈉溶液中浸泡加輕微震蕩10min，取出材料用無(wú)菌水沖洗3次，然后用無(wú)菌試紙吸去側(cè)枝上多余的水分，放入干凈碟子中備用。
(4)在超凈工作臺(tái)上，采用干凈的器械，把已經(jīng)滅菌消毒處理過(guò)的材料兩端各截去0.5cm左右，使保留的材料每段長(zhǎng)度為3.5cm，然后插入裝有無(wú)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.8mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l+聚乙烯吡咯烷酮10mg/l，培養(yǎng)瓶的容積為240ml、高90mm、口徑62mm，每瓶接種1段材料，共接種50瓶，加蓋塑料密封蓋后，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
(5)2013年11月29日，在超凈工作臺(tái)上，選擇步驟(4)培養(yǎng)獲得的22瓶無(wú)菌不定芽作為增殖培養(yǎng)的材料，對(duì)長(zhǎng)度超過(guò)4cm的芽，切割為約2.0cm長(zhǎng)的芽段，然后接種到裝有無(wú)菌增殖培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶規(guī)格同步驟(4)所述，培養(yǎng)基配方為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.1mg/l+萘乙酸0.01mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l，每瓶接種10～12個(gè)芽，共接種了72個(gè)芽，加蓋塑料密封蓋后放于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
(6)2014年1月20日，在超凈工作臺(tái)上，對(duì)步驟(5)培養(yǎng)獲得的有效芽，選取長(zhǎng)度超過(guò)3cm、生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠的芽，剪取帶頂梢部分，插入裝好無(wú)菌生根培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基配方為1/2ms+萘乙酸0.5mg/l+蔗糖25g/l+卡拉膠7g/l，每瓶接種10～12個(gè)芽，加蓋塑料密封蓋后放于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
(7)2014年2月15日，當(dāng)苗木根系呈“露白”狀時(shí)，把培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入塑料大棚內(nèi)進(jìn)行煉苗處理；大棚采用自然光照和濕度，溫度控制在25℃左右；單層擺放培養(yǎng)瓶，使每瓶苗都有自然光照射。
(8)2014年3月3日，苗木根系長(zhǎng)至1.0～1.5cm，打開(kāi)瓶蓋，注入清水，使水面超過(guò)培養(yǎng)基表面0.5～1.0cm，開(kāi)蓋煉苗5天后可進(jìn)行苗木移栽。
(9)2014年3月8日，把開(kāi)蓋煉苗后的生根苗從瓶中取出(共226株)，用清水洗凈基部附著的培養(yǎng)基，移栽入裝有干凈紅泥的塑料育苗袋中，淋透水后遮蓋塑料薄膜以保持苗床的濕度和溫度；移栽第一個(gè)星期內(nèi)，保持苗木生長(zhǎng)環(huán)境濕度在90％左右，第二個(gè)星期后濕度保持在75～85％左右；2014年4月10日撤掉覆蓋的薄膜，移栽成活苗木有198株，成活率87.6％，此后苗木可按常規(guī)育苗措施進(jìn)行管護(hù)。
(10)2014年10月20日，從移栽成活的苗木中，挑選50株生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好，苗高超過(guò)10cm的苗木在圃地中定植；圃地全面整地后作畦，長(zhǎng)約15m，畦寬120cm，畦高20cm，四周開(kāi)設(shè)排水溝；采用雙行品字形栽植方法，株距60cm；栽植前施復(fù)合肥做基肥，用量為15g/株；2015年8月，當(dāng)苗高約80cm時(shí)，清除基部雜草和側(cè)枝，翻松苗木周邊土壤，壓彎苗木主干，然后用疏松土壤覆蓋苗木主干至約1/2苗高處，覆土厚度3～5cm，并保留長(zhǎng)約10cm的基部主干裸露在外；2～3個(gè)月后，苗木基部主干上即萌發(fā)出大量嫩芽(產(chǎn)量約為100條/年.株)；當(dāng)萌芽長(zhǎng)至10～15cm時(shí)，即可采集作為組培外植體材料，由此亦可有效解決了杉木成年大樹(shù)側(cè)枝作為外植體所面臨的生理年齡和位置效應(yīng)問(wèn)題。
(11)2015年10月16日上午，晴，于露水干后采集萌條，選擇長(zhǎng)度超過(guò)10cm、半木質(zhì)化狀態(tài)的萌條為外植體材料，材料的保存方法同上述步驟(1)，共采集萌條30條。
(12)2015年10月16日下午，進(jìn)行材料的預(yù)處理，方法同上述步驟(2)；然后在超凈工作臺(tái)上，用70％酒精溶液浸泡材料30s，取出用無(wú)菌水沖洗1次，再用0.5％次氯酸鈉溶液浸泡5min后取出用無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.5％次氯酸鈉溶液浸泡第二次，時(shí)長(zhǎng)5min，浸泡過(guò)程中需輕微震蕩，然后取出用無(wú)菌水沖洗5次，再用無(wú)菌試紙吸去芽條上多余的水分，放入干凈碟子中備用。
(13)2015年10月16日下午，對(duì)上述步驟(12)獲得的外植體材料進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)基采用ms+6-芐氨基腺嘌呤0.5mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l+聚乙烯吡咯烷酮10mg/l，其余措施同上述步驟(4)，共接種120個(gè)芽段。
(14)2015年12月20日，對(duì)上述步驟(13)獲得的無(wú)菌不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用dcr+6-芐氨基腺嘌呤1.0mg/l+苯基噻二唑基脲0.05mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l，其余措施同上述步驟(5)，共接種192個(gè)芽。
(15)2016年2月8日，經(jīng)步驟(14)培養(yǎng)1.5個(gè)月的芽已形成叢生芽，增殖倍數(shù)為2.5～3.0，無(wú)菌芽總數(shù)約430個(gè)；選擇芽長(zhǎng)超過(guò)1.5cm的叢生芽進(jìn)行分離和轉(zhuǎn)瓶，增殖培養(yǎng)基配方和接種方法保持不變，培養(yǎng)1.5個(gè)月后，無(wú)菌芽總數(shù)約為1160個(gè)，重復(fù)“增殖培養(yǎng)—芽叢分離—增殖培養(yǎng)”的操作，至2016年12月底，無(wú)菌芽總數(shù)約為6萬(wàn)株，實(shí)現(xiàn)了芽的幾何倍數(shù)增殖，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了杉木野外優(yōu)異基因資源的高效離體保存。
(16)2016年3月25日，對(duì)步驟(14)培養(yǎng)的叢生芽，選擇其中長(zhǎng)度超過(guò)3cm，生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠的無(wú)菌芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，重復(fù)實(shí)施例1中的步驟(6)～(9)，即可規(guī)模生產(chǎn)出高品質(zhì)的杉木無(wú)性系7號(hào)組培苗，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因資源的高效保存和利用。
實(shí)施例2
(1)2013年10月10日，從位于廣東省云浮市的7年生杉木無(wú)性系測(cè)定林中采集tl5號(hào)無(wú)性系中上部側(cè)枝，適當(dāng)修剪枝條，保留帶頂梢部分，枝條長(zhǎng)度10～15cm，用干凈的濕毛巾包好，放入塑料封口袋中，然后放入帶冰塊的泡沫箱里，要求冰塊不能直接接觸芽條，箱內(nèi)溫度控制在4℃～10℃，于采集當(dāng)天把材料帶回實(shí)驗(yàn)室及時(shí)處理。
(2)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，把野外采集回來(lái)的枝條去除所有葉片，放入容積為2l的干凈量杯中，加入小半勺中性洗衣粉和2滴吐溫-80浸泡并震蕩5min，然后置于流水下沖洗25min，取出材料，剪除已經(jīng)木質(zhì)化的部分，保留半木質(zhì)化枝條，放入超凈工作臺(tái)上干凈碟子中備用。
(3)在超凈工作臺(tái)上，把預(yù)處理后的材料截成4.0cm長(zhǎng)的小段，然后用75％酒精溶液浸泡加震蕩50s，用干凈的鑷子取出材料，無(wú)菌水沖洗2次，再放入0.5％次氯酸鈉溶液中浸泡加輕微震蕩15min，取出材料用無(wú)菌水沖洗5次，然后用無(wú)菌試紙吸去側(cè)枝上多余的水分，放入干凈碟子中備用。
(4)在超凈工作臺(tái)上，采用干凈的器械，把已經(jīng)滅菌消毒處理過(guò)的材料兩端各截去0.5cm左右，使保留的材料每段長(zhǎng)度為3.0cm，然后插入裝有無(wú)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.6mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l+聚乙烯吡咯烷酮15mg/l，培養(yǎng)瓶的容積為240ml、高90mm、口徑62mm，每瓶接種1段材料，共接種100瓶，加蓋塑料密封蓋后，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
(5)2013年11月25日，在超凈工作臺(tái)上，選擇步驟(4)培養(yǎng)獲得的56瓶無(wú)菌不定芽作為增殖培養(yǎng)的材料，對(duì)長(zhǎng)度超過(guò)4cm的芽，切割為約2.0cm長(zhǎng)的芽段，然后接種到裝有無(wú)菌增殖培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶規(guī)格同步驟(4)所述，培養(yǎng)基配方為ms+6-芐氨基腺嘌呤0.2mg/l+萘乙酸0.02mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠7g/l，每瓶接種10～12個(gè)芽，共接種了108個(gè)芽，加蓋塑料密封蓋后放于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
(6)2014年1月26日，在超凈工作臺(tái)上，對(duì)步驟(5)培養(yǎng)獲得的有效芽，選取長(zhǎng)度超過(guò)3cm、生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠的芽，剪取帶頂梢部分，插入裝好無(wú)菌生根培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基配方為1/2ms+萘乙酸0.6mg/l+蔗糖25g/l+卡拉膠6.5g/l，每瓶接種10～12個(gè)芽，加蓋塑料密封蓋后放于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
(7)2014年2月27日，當(dāng)苗木根系呈“露白”狀時(shí)，把培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入塑料大棚內(nèi)進(jìn)行煉苗處理；大棚采用自然光照和濕度，溫度控制在25℃左右；單層擺放培養(yǎng)瓶，使每瓶苗都有自然光照射。
(8)2014年3月11日，苗木根系長(zhǎng)至1.0～1.5cm，打開(kāi)瓶蓋，注入清水，使水面超過(guò)培養(yǎng)基表面0.5～1.0cm，開(kāi)蓋煉苗4天后可進(jìn)行苗木移栽。
(9)2014年3月15日，把開(kāi)蓋煉苗后的生根苗從瓶中取出(共536株)，用清水洗凈基部附著的培養(yǎng)基，移栽入裝有干凈紅泥的塑料育苗袋中，淋透水后遮蓋塑料薄膜以保持苗床的濕度和溫度；移栽第一個(gè)星期內(nèi)，保持苗木生長(zhǎng)環(huán)境濕度在90％左右，第二個(gè)星期后濕度保持在75～85％左右；2014年4月17日撤掉覆蓋的薄膜，移栽成活苗木有479株，成活率89.5％，此后苗木可按常規(guī)育苗措施進(jìn)行管護(hù)。
(10)2014年10月25日，從移栽成活的苗木中，挑選50株生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好，苗高超過(guò)15cm的苗木在圃地中定植；圃地全面整地后作畦，長(zhǎng)約15m，畦寬120cm，畦高30cm，四周開(kāi)設(shè)排水溝；采用雙行品字形栽植方法，株距60cm；栽植前施復(fù)合肥做基肥，用量為20g/株；2015年8月，當(dāng)苗高約80cm時(shí)，清除基部雜草和側(cè)枝，翻松苗木周邊土壤，壓彎苗木主干，然后用疏松土壤覆蓋苗木主干至約1/2苗高處，覆土厚度3～5cm，并保留長(zhǎng)約10cm的基部主干裸露在外；2～3個(gè)月后，苗木基部主干上即萌發(fā)出大量嫩芽(產(chǎn)量約為100條/年.株)；當(dāng)萌芽長(zhǎng)至10～15cm時(shí)，即可采集作為組培外植體材料，由此亦可有效解決了杉木成年大樹(shù)側(cè)枝作為外植體所面臨的生理年齡和位置效應(yīng)問(wèn)題。
(11)2015年10月25日上午，晴，于露水干后采集萌條，選擇長(zhǎng)度超過(guò)10cm、半木質(zhì)化狀態(tài)的萌條為外植體材料，材料的保存方法同上述步驟(1)，共采集萌條30條。
(12)2015年10月25日下午，進(jìn)行材料的預(yù)處理，方法同上述步驟(2)；然后在超凈工作臺(tái)上，用70％酒精溶液浸泡材料50s，取出用無(wú)菌水沖洗2次，再用0.5％次氯酸鈉溶液浸泡6min后取出用無(wú)菌水沖洗2次，然后用0.5％次氯酸鈉溶液浸泡第2次，時(shí)長(zhǎng)5min，浸泡過(guò)程中需輕微震蕩，然后取出用無(wú)菌水沖洗5次，再用無(wú)菌試紙吸去芽條上多余的水分，放入干凈碟子中備用。
(13)2015年10月25日下午，對(duì)上述步驟(12)獲得的外植體材料進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)基采用ms+6-芐氨基腺嘌呤0.5mg/l+蔗糖30g/l+卡拉膠6.5g/l+聚乙烯吡咯烷酮10mg/l，其余措施同上述步驟(4)，共接種106個(gè)芽段。
(14)2015年12月28日，對(duì)上述步驟(13)獲得的無(wú)菌不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用dcr+6-芐氨基腺嘌呤1.5mg/l+苯基噻二唑基脲0.01mg/l+蔗糖35g/l+卡拉膠7g/l，其余措施同上述步驟(5)，共接種212個(gè)芽。
(15)2016年2月13日，經(jīng)步驟(14)培養(yǎng)1.5個(gè)月的芽已形成叢生芽，增殖倍數(shù)為2.5～3.0，無(wú)菌芽總數(shù)約593個(gè)；選擇芽長(zhǎng)超過(guò)1.5cm的叢生芽進(jìn)行分離和轉(zhuǎn)瓶，增殖培養(yǎng)基配方和接種方法保持不變，培養(yǎng)1.5個(gè)月后，無(wú)菌芽總數(shù)約為1668個(gè)，重復(fù)“增殖培養(yǎng)—芽叢分離—增殖培養(yǎng)”的操作，至2016年12月底，無(wú)菌芽總數(shù)約為12萬(wàn)株，實(shí)現(xiàn)了芽的幾何倍數(shù)增殖，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了杉木野外優(yōu)異基因資源的高效離體保存。
(16)2016年3月29日，對(duì)步驟(14)培養(yǎng)的叢生芽，選擇其中長(zhǎng)度超過(guò)3cm，生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠的無(wú)菌芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，重復(fù)實(shí)施例1中的步驟(6)～(9)，即可規(guī)模生產(chǎn)出高品質(zhì)的杉木無(wú)性系tl5號(hào)組培苗，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因資源的高效保存和利用。
本發(fā)明的資源保存和快速繁育情況及其效果詳見(jiàn)表1。
表1杉木野外優(yōu)異資源離體保存和快速繁育方法的實(shí)施效果
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。