專利名稱：使用合成品9-β-L(+)腺苷刺激生長的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用化學方法制成(合成)的9-β-L(+)腺苷來刺激植物生長。本發(fā)明具體地涉及使用很少量的化學制成的9-β-L(+)腺苷來達到上述目的。
植物蠟中的一種天然成分蜂花醇(TRIA)是一個C30的伯醇，如Ries等人的美國專利4，150，970號;S.K.Ries的Critical Reviews in Plant Sciences 2∶239-285(1985);以及S.K.Ries，V.F.Wert，C.C.Sweely和R.H.leavitt的Science 195∶1339-1341(1977)等文章所述，它能增進多種農(nóng)作物生長，而且有時能提高產(chǎn)量。而且如中國科學院上海植物生理研究所在于1987年11月25-28日在中國鎮(zhèn)江舉行的關(guān)于蜂花醇的國際專題討論會上發(fā)表的論文摘要;Lim，ung-Kyu在Korean J.Ecol.4∶1(1982)的文章和C.Devakumav，S.Baskaran和S.K.Mukerjee在Indian J.Agr.Sci.56∶744-747(1986)的文章所述，它每年在亞洲施用于幾百萬畝的茶林、蔬菜和農(nóng)作物來提高產(chǎn)量。
按上面提到的S.K.Ries在CriticalReviewsinPlantSciences(1985)和S.K.Ries和V.F.Wert在J.PlantGrowthRegulation1∶117-127(1982)中所述，在用TRIA作用于玉米和稻子實生苗四十分鐘時，可以測量到葉表面積、干重、凱氏法測得的總含氮量、水溶性蛋白質(zhì)、還原糖和游離氨基酸都有所增加。如A.P.Lesniak和S.K.Ries在Physiol.Plant.68∶20-26(1986)所述，在大麥(Hordeum Vulgare)根的無細胞抽提液中加入2.3nm的TRIA，30分鐘內(nèi)依賴于Ca++和Mg++的腺苷三磷酸酶活性增加40-60%。按J.Jones，V.F.Wert和S.K.Ries在Planta 144∶277-292(1979)中所述，等摩爾濃度的二十八碳醇(OCTA，C28伯醇)和其他長鏈醇都能抑制TRIA的活性，而且如上面提到的S.K.Ries在Critical Reviews in Plant Sciences(1985)和J.Jones，V.F.Wert和S.K.Ries在Planta(1979)中所述，只要這些長鏈醇先于TRIA施用，即使這些醇和TRIA分別施于梢部和根部，也有抑制作用。
還有，如Ries等人的美國專利4150970號所述，施加1.0μg/L的蜂花醇(TRIA)，在10分鐘時增加了干重并改變了稻子(OryzasativaL.)和玉米(ZeamaysL.)實生苗的新陳代謝(也可參見上述的S.K.Ries的CriticalReviewsinplantSciences(1985))。如前面提到的S.K.Ries的CriticalReviewsinPlantSciences(1985)以及J.Jones，V.F.Wert和S.K.Ries的Planta(1979)等文章所討論的，在TRIA加入到實生苗某一部位前一分鐘在相反的根部或梢部施用OCTA可以抑制稻實生苗的上述響應。
在此處引為參考并構(gòu)成本文的一部分的Ries申請的美國專利4，741，754敘述了TRIA可以迅速誘導出第二個信使，稱作TRIM。TRIM在植株中迅速運動導致了刺激生長(干重增加)和水分吸收。OCTA也可誘導出第二個信使(OCTAM)，它抑制TRIA的活性，但是不抑制TRIM的活性。從未用TRIA處理的對照植物中，用提取TRIM的相同方法可以得到一個化合物，它對植物生長沒有作用。熔點、紅外(IR)光譜，質(zhì)譜(MS)和核磁共振譜(NMR)產(chǎn)生的結(jié)果是TRIM和脂肪烷基硫酸酯(TAS)看起來是相同的。但是這兩個化合物在生物活性方面顯著不同。在一段時期，對TRIM給化學法鑒別和活性成分的合成未能成功。
如Ries的美國專利4，741，754所述，在TRIA作用于植物后，只能從植物中分離和提純出微量的TRIM。從植物生長刺激素要達到商業(yè)水平的數(shù)量這一觀點出發(fā)，需要合成法制備其純物質(zhì)。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種用合成法制備的9-β-L(+)腺苷來刺激植物生長的方法，該物質(zhì)的效力至少和天然誘導生成的TRIM一樣，并且在某些場合明顯地更加有效。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員通過下面的說明和附圖可以明確本發(fā)明的這些目的與其它一些目的。


圖1和1A分別是天然得到的9-β-L(+)腺苷(TRIM)和9-β-D(-)腺苷(TAS)的1H核磁共振譜(300MHz，CD3OD)。從合成得到的9-β-L(+)腺苷和TRIM的譜圖相似。
圖2是天然得到的TRIM的化學離子化質(zhì)譜圖(MS)。天然得到的TAS，合成制備的9-β-D(-)腺苷和合成制備的9-β-L(+)腺苷的質(zhì)譜圖與TRIM的相似。
圖3a到3g展示了天然得到的TAS，天然得到的TRIM以及經(jīng)過和沒有經(jīng)過用腺苷脫氨酶去除9-β-D(-)腺苷而純化的合成制備的9-β-L(+)腺苷的圓二色性(CD)，其中的9-β-D(-)腺苷是有抑制作用的雜質(zhì)。圖3a和3b展示了純化的9-β-L(+)腺苷譜圖，圖3C顯示了用腺苷脫氨酶純化后的TRIM的譜圖。圖3d顯示的是用腺苷脫氨酶處理前的TRIM譜圖。圖3e展示的是用腺苷脫氨酶處理和再純化后的不純的9-β-D(-)腺苷的譜圖。圖3f展示處理和純化前的結(jié)果。圖3g顯示用腺苷脫氨酶處理前的TAS譜圖。
本發(fā)明涉及一種刺激植物生長的方法，它包含為了刺激植物生長而對植物施用有效量的合成法制備的9-β-L(+)腺苷。此腺苷可以基本上不含其它抑制植物生長刺激作用的物質(zhì)，合適的量是每升水溶液中含0.01-100微克，為了可潤濕植物表面所用的水溶液可施于植物的根、梢或葉部。
按照在此引為參考的和作為本文一部分的Ries的美國專利4，741，754，TRIM沒用化學方法鑒定，并且提取的費用昂貴。本發(fā)明鑒定了該活性物質(zhì)并且提供了其合成方法。如美國專利4，741，754所述，將從13-18天的在梢部用1.0微克/L的TRIA噴撒后的稻秧的根部提取到的微量的水溶性TRIM，施用到植株后24小時，與從未處理的植株得到的相似的提取物比較，稻秧生長增快約50%。OCTA和OCTAM二者都能抑制TRIA的活性，但是對TRIM不起抑制作用。在葉面施用TRIA1分鐘后，從稻根部分離出來TRIM，在用4mm水柱(乳膠管)與剪斷的梢部相連的稻根中發(fā)現(xiàn)了TRIM。將從TRIA處理過的植株上切下的莖浸在水中，從該水中可以回收到微量的TRIM，但是將未處理過的或經(jīng)表面活性劑處理過的切下的莖浸在水中，則從該水中找不到TRIM。
在本說明書中，TRIM和TAS指的是天然產(chǎn)物。合成產(chǎn)物照此鑒定。
合成的9-β-L(+)腺苷可以和各種適于農(nóng)用的，無干擾作用的載體(特別是水、水和表面活性劑及其它有機物或上述的混合物)合并使用。這樣的載體對專業(yè)人員來說很熟悉，含有例如象粉狀粘土，硅酸鹽，纖維素等物質(zhì)。產(chǎn)品可以液體和粉末形式噴在植物上。也可考慮制成緩慢釋放的顆粒，它能延長合成的9-β-L(+)腺苷的釋放時間。美國專利№4，741，754敘述了各種制劑。
9-β-L(+)腺苷可以用記載在NucleicAcidChemis-tryJ.Wiley&Sons，NewYork，ArticleNO.92，Part1∶527-532(1978)中的AntoninHoly的方法以純品的形式大量合成。N.J.Cusack，M.E.Hickman和G.V.R.Born的文章Proc.R.Soc.London，Ser.B206(1163)139-144(1979)也敘述了制備這一化合物的方法。用腺苷脫氨酶可以去除9-β-D(-)腺苷，使之成為肌苷。
例1和例2給出了TRIM的分離和純化方法，其純化合物鑒定為9-β-L(+)腺苷。雖然9-β-L(+)腺苷一般需要去除雜質(zhì)來純化，它作為一個合成的化合物在商業(yè)上是可行的。試驗表明合成的純9-β-L(+)腺苷比TRIM更有效力。對照例3顯示了合成的9-β-D(-)腺苷和其它的化學藥品在稻株上對于TRIM或合成的9-β-L(+)腺苷的影響。例4提供了對玉米的處理情況。例5提供了對黃瓜的處理情況。
在下面的例1至例3中，稻子(CVM-101，u.of Calif)的種植情況如Ries的美國專利4，741，754所述。對于每一個活性實驗，稻苗在含0.5濃度營養(yǎng)液(20ml)的試管(14.5cm×2.4cm)中生長24小時，白天溫度在30℃，夜間溫度在25℃，光照時間16小時，(PAR 300-350mol S-1m-2)。在試驗設(shè)計中，按所觀察的植株大小，將稻苗分劃成很多區(qū)組。在噴藥和把它們放回生長室前后的操作中，所有的處理按隨機數(shù)字表隨機處理各區(qū)組。所有的數(shù)據(jù)要經(jīng)過方差分析，用F試驗比較趨勢作用，用最小顯著差別法比較平均分離。
例1為了得到用于化學鑒別的純TRIM，將按R.G.Laughlin，R.L.Munyon，S.K.Ries和V.F.Wrt在Science 219∶1219-1221(1983)中所述配制的TRIA(1.0μg/L)膠體分散液噴在生長了21-24天的稻苗葉子上。對照苗用0.01μg/L的脂肪烷基硫酸酯(TAS)噴撒，這正是制劑中表面活性劑的濃度。在100分鐘后取下根部，在提取前要稱重和冷凍，在索氏提取器內(nèi)用150ml甲醇提取冷凍過的根部(20μg)2小時，將提取物在真空中干燥。剩余物用水(20ml)再溶解，離心(7900rpm)，所得上清液在減壓下蒸發(fā)干燥。在閃式層析柱中(35cm×20mm，C18鍵合硅膠，40μm)將提取物初步純化，用甲醇-水(30∶70V/V)淋洗，流速2ml/min，按每批5ml收集到二十個餾分。用稻株進行生物試驗顯示出僅第6-14個餾分有活性，將這些含活性物TRIM的餾分合并后蒸發(fā)至干。用相似的閃式層析柱純化對照的(TAS)提取物，對餾分的稻秧生物試驗表明無活性。
上述的含TRIM和TAS的餾分用C18CN-H2O(80∶20V/V，2ml/min)的流動相經(jīng)制備柱在60℃用高壓液相色譜法純化。在22.1分鐘流出的含有TRIM和TAS的餾分用相同溶劑進一步純化。最終的高壓液相色譜法純化是在相同的柱中在25℃用CH3OH-H2O(30∶70V/V，4ml/min)的流動相進行的。在19.4分鐘收集到的組分在真空下蒸發(fā)至干。所得化合物經(jīng)鑒定認為，從試驗物根部得到的是TRIM，從對照物根部得到的是無活性的TAS。
用甲醇重結(jié)晶純化的TRIM和TAS生成無色結(jié)晶、熔點都是230-234℃(用Kofler熱級裝置測量，未校正)。兩個化合物的1H-(
圖1)和13C-NMR譜相同。TRIM和TAS混合的1H-NMR譜是單個質(zhì)子譜的迭加。對純化后的TRIM和TAS，相同的CI和FAB MS(圖2)譜圖在m/Z 268處給出(M+H)，與NMR數(shù)據(jù)符合。這些結(jié)果使鑒定TRIM發(fā)生困難。
TRIM和TAS最終鑒定為都含有9-β-腺苷。TRIM和TAS分析的不同處僅在于使用JASCOModelJ600光譜儀得到的圓二色性(CD)(圖3a-3g)。購買到的9-β-D(-)腺苷與純化的TAS和TRIM的光譜比較證實，純的TAS和純的TRIM結(jié)構(gòu)分別為9-β-D(-)腺苷和9-β-L(+)腺苷。
按原先提到的N.J.Cusack，M.E.Hickman和G.V.R.Born在Proc.R.Soc.London(1979)中敘述的方法合成制備的并用腺苷脫氨酶處理過的9-β-L(+)腺苷與純的TRIM比較，在各方面包括在稻苗上的生物活性都是一致的，如表1所示。
表1生長17天的稻苗對TAS對照物;9-β-D(-)腺苷，純化的TRIM(9-β-L(+)腺苷)，合成制得的9-β-D(-)腺苷和合成的9-β-L(+)腺苷的響應。
24小時的增加量化學藥物(10.0μg/L)干重水分吸收(mg/植株)(ml/植株)對照(未處理)7.004.48TAS對照7.244.77純TRIM13.445.18發(fā)酵生成的9-β-D(-)腺苷7.604.84合成的9-β-L(+)腺苷(1)13.44 5.20LSD5%1.910.28LSD1%2.580.38(1)Sigma化學試劑公司位于St.Louis，Missouri.
當用表1中的組合物在稻苗上進行生物試驗、與葉面噴霧TRIM(100μg/L，為表1中數(shù)據(jù)的10倍)相比時，在20小時后，TRIM和9-β-L(+)腺苷明顯地增加了干重和水分吸收。在植株起始時重量為38.70mg的情況下，空白對照，TAS和TRIM三者的凈干重增值分別是8.45，6.98和13.04mg/全株。合成的9-β-L(+)腺苷產(chǎn)生與TRIM等價的結(jié)果。用來比較TRIM和另外兩種處理的F值在1%水平上顯著不同。
因不同的處理和對照植株按三種方案進行提取。從生長21-24天的稻苗根上獲得純TRIM的平均產(chǎn)量約為124μg/g干根重。從TAS(對照)植株獲得的腺苷產(chǎn)量約為96μg/g干根重。因此，用提取法生產(chǎn)很少量的TRIM需要很大數(shù)量的植株。而合成法得到的物質(zhì)可以大量制備。
例2從各種來源得到的9-β-L(+)腺苷與腺苷脫氨酶反應以檢測其純度。腺苷脫氨酶選擇性地與9-β-D(-)腺苷反應生成D-肌苷。9-β-L(+)腺苷不受此酶的影響。結(jié)果如表2a所示。
表2a將不同來源的腺苷加入腺苷脫氨酶后，經(jīng)HPLC(高壓液相色譜)分析得出剩余的9-β-L(+)腺苷含量，腺苷脫氨酶只對9-β-D(-)腺苷作用。樣品為100μg樣品/含0.1單位酶的100μl水。
時間(小時)9-β-L(+)腺苷的百分含量腺苷來源24689-beta-D(-)(1)0.55 0.45 0.47 -9-beta-L(+)(2)100.0 100，0 100.0 99.83TAS對照0.570.520.670.57TRIM6.025.735.855.63(1)Sigma化學試劑公司，位于St.Louis，Missouri(2)Cusack等人，前面提到過。
8小時后，測試這些物質(zhì)的圓二色譜(CD)。圖3a顯示用Cusack等人的方法制成的已知的純9-β-L(+)腺苷的譜圖。圖3b顯示經(jīng)腺苷脫氨酶處理后的TRIM的譜圖。圖3c顯示了用腺苷脫氨酶處理前的TRIM譜圖。圖3d顯示了經(jīng)腺苷脫氨酶處理后的商業(yè)生產(chǎn)的9-β-D(-)腺苷的譜圖。圖3e顯示了在用腺苷脫氨酶處理前的圖3d所用的購得的腺苷的譜圖。圖3f顯示了經(jīng)腺苷脫氨酶處理后的TAS譜圖。圖3g顯示了在用腺苷脫氨酶處理前的TAS譜圖。
從表2a和圖3a-3g可以看出，購得的9-β-D(-)腺苷含有一些9-β-L(+)腺苷，非常不純。同樣地，我們認為是純的TRIM，實際上是非常不純的。雖然試驗了幾種手性層析柱，若不經(jīng)腺苷脫氨酶作用而后用HPLC進一步純化，還是不能將TRIM進一步純化。但是若不使用酶，TRIM仍不能用已知的HPLC技術(shù)進一步純化。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)純的9-β-L(+)腺苷的效力相當于美國專利№4，741，754提供的高濃度的不純TRIM的效力。
表2b顯示了生長16天的稻苗接受用經(jīng)腺苷脫氨酶處理一段時間后再用HPLC純化的各種來源的腺苷處理后的響應。
表2b24小時后增加的干重腺苷來源(1.0ugL)(mg/植株)(相當對照的%)無8.16未處理的根7.6694TAS對照8.78108TRIM13.69168合成的L(+)腺苷13.80169購得的D(-)腺苷＊11.60 142(用腺苷脫氨酶處理一段時間)LSD5%1.90LSD1%2.55＊這顯示了商業(yè)產(chǎn)品含有顯著量的L(+)腺苷。
對比實例3腺苷半硫酸鹽，腺嘌呤，9-β-D-arabinosutanoside，腺苷5′-二磷酸葡糖二鉀，腺苷-5′-單磷酸，腺苷-3′-單磷酸-水合物，腺苷5-三磷酸和腺苷3′，5環(huán)單磷酸鈉鹽在濃度至少是100μg/L的情況下，在稻生物試驗中沒有活性。它們與純的TRIM和TAS不共同用色譜法分析。
合成生產(chǎn)出的9-β-D(-)腺苷在幾個稻生物試驗中有活性(增加干重)。但是，在三種物質(zhì)互相比較的同一試驗中，它從未如TRIM那么多地促進生長，也沒達到TRIM(1.0μg/L)那么低的濃度。因為從TAS(對照植株)得到的9-β-D(-)腺苷沒有顯示出明顯的活性，即使其濃度為表3中TRIM濃度的100倍也是如此，合成的9-β-D(-)腺苷從未達到TRIM那樣大的活性，這些結(jié)果是可疑的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)合成的9-β-D(-)腺苷含有一些9-β-L(+)腺苷對映體，這可以從例2看出。
表3分別用純TAS，9-β-D(-)腺苷和TRIM處理的生長了15天的稻苗的生長情況19小時后的增加(藥物)(μg/L)(mgDW/植株)O03.87TAS103.79TAS10003.19TRIM 10 8.44aLSD5%3.51
aF值，按1%水平與其它處理比較顯著性(F＝12.4)在這個試驗中，合成的9-β-L(+)腺苷與TRIM得到的結(jié)果相同。表4中顯示出用腺苷脫氨酶處理過的與TRIM相比可以說很純的9-β-L(+)腺苷作用于稻苗的結(jié)果。
表4生長了17天的稻苗對于不同濃度的合成產(chǎn)生的9-β-L(+)腺苷和TRIM的響應比較。此試驗的結(jié)果是兩個試驗的平均，每個試驗重復5次。零時間時TRIM對應的植株的平均干重為33.55mg，合成的9-β-L(+)腺苷對應的為33.36mg。
濃度TRIM相對于對照物合成相對于對照物(μg/L)DW增加的%DW增加的%06.95-5.77.0017.83137.4629.018.19188.19551.009.72409.8971100.011.34639.0855LSD5%1.871.95LSD1%2.512.61結(jié)果清楚地顯示出在濃度為0.0001-1.0微克/升之間，合成的純腺苷的效力比TRIM高許多。
例4表5顯示了“3780”地塊的玉米苗在溫室中種植后一周施用L(+)腺苷、并在處理后6天收獲所得到的響應。
表5L(+)腺苷干重相對于對照物(μg/L)(mg/嫩苗)增加%對照4020.01478a191.004389100.00438910000.0044511aF值，按5%水平顯示與對照物差別的顯著性。
此試驗顯出相對于對照物，使用9-β-L(+)腺苷后干重有明顯的增加，特別是在很低的濃度情況下是如此。
例5表6顯示在溫室中黃瓜在兩個不同光照強度下生長時施用兩次L(+)腺苷得到的響應。施用腺苷和對照物時與6摩爾尿素一起噴撒。腺苷溶在尿素中防止細菌破壞。在種植后的12天和17天施用，嫩苗在種植后22天收獲。
表6光強度(moles/m2/sec)9+beta- 低b高bL(+)腺苷 (120) (320) 平均a相對于對照物(μg/L)干重增加%mg/植株04907176040.014838007425%1.005437706569%100.004808236528%
aF值，在5%水平顯示對照物與處理物比較的顯著性。
bF值，在5%水平顯示低光強與高光強比較的立方趨勢顯著性。
此試驗顯示出使用9-β-L(+)腺苷相對于對照物有明確的增加，只要不對刺激生長產(chǎn)生干擾，各種已知的抗菌劑都可在制劑中使用。
同樣的情況，大豆、麥子，高粱和大麥，以及其它谷物用濃度0.01-100μg/L的9-β-L(+)腺苷處理以增加干重。
已知TRIA是一個非常親油的化合物，它能作用于細胞膜產(chǎn)生微量的TRIM，TRIM迅速遍及整個植株，引起一連串新陳代謝變化，結(jié)果能觀察到可溶性蛋白質(zhì)，還原糖和干重增加。因為9-β-L(+)腺苷尚未在對照物中發(fā)現(xiàn)，也未在文獻中報道，可以相信在植物膜上存在的腺苷包含一個開鏈核糖部分。通過TRIA與膜結(jié)合酶的作用，它可以轉(zhuǎn)變?yōu)?-β-L(+)腺苷，而在沒有TRIA的情況下，可以轉(zhuǎn)變?yōu)?-β-D(-)腺苷。按上面引用的S、K.Ries在CriticalReviewsinPlantSciences(1985)的文獻所述，將其它長鏈醇施加到植物的相反部位也會誘發(fā)第二信使，此信使在1分鐘內(nèi)能停止9-β-L(+)腺苷的生成。因此通過TRIA誘導使9-β-腺苷對映體轉(zhuǎn)化成9-β-L(+)腺苷和長鏈醇對這一活性的抑制表明在植物中存在著人們原先不知道的生長調(diào)節(jié)系統(tǒng)。
本發(fā)明提供了一個可以使作物每畝生長量大大提高的方法。如原先提到過的Cusack等人的論文和Jurovcik等人在FebsLetters18∶274-276(1971)的論文可知，因為9-β-L(+)腺苷對哺乳動物和細菌無活性作用，它對植物的活性是意想不到的。
所有類型的植物都可用本發(fā)明的方法施用。處理的范圍至少和TRIA和TRIM適用的范圍一樣廣泛。
如本文已經(jīng)用到過的，“合成”一詞的含義對生產(chǎn)9-β-L(+)腺苷來說，是指經(jīng)過體外方法，或是相對于植物體內(nèi)方法而言的。合成法可以是整個過程都是化學合成，也可以是涉及到通過活細胞合成的方法，例如在某一特定步驟利用了微生物方法。
愿意指出，上面的敘述僅是說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍僅只受在本文后面所提出的權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.一種剌激植物生長的方法，包括將有效量的合成法制備的9-β-L(+)腺苷施用于植物中，以剌激植物生長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的9-β-L(+)腺苷實際上是純化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的植物是稻實生苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中9-β-L(+)腺苷以水溶液形式施用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中每升水溶液含9-β-L(+)腺苷的量約為0.0001-100微克。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中9-β-L(+)腺苷和農(nóng)業(yè)上適用的載體合并使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中一種抗菌劑與腺苷混合使用。
全文摘要
敘述了一種通過使用合成的9-β-L(+)腺苷來刺激植物生長的方法。此方法用合成的化合物代替天然物，因為天然物的量極小，并且分離很困難。
文檔編號A01N43/90GK1046658SQ89106238
公開日1990年11月7日 申請日期1989年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月28日
發(fā)明者斯坦利·K·萊斯, 維奧萊特·F·沃特, 穆拉利哈蘭·G·內(nèi)爾 申請人:密歇根州州立大學托管委員會