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      通過原位抑制雜交對人個體中期和間期細(xì)胞染色體定位的制作方法

      文檔序號:151237閱讀:220來源:國知局
      專利名稱:通過原位抑制雜交對人個體中期和間期細(xì)胞染色體定位的制作方法
      染色體譜帶技術(shù)使特定的人染色體的識別得以簡化,目前它為染色體畸變的診斷提供了主要依據(jù)。但染色體譜帶圖的解釋需要熟練的專業(yè)人員,而且常常技術(shù)上較困難。特別是在檢測細(xì)小的結(jié)構(gòu)變化以及分析復(fù)雜的核型,例如那些高度非整倍體腫瘤細(xì)胞的核型時更是如此。另一復(fù)雜之處在于,可讀的中期擴(kuò)展染色體有時很難或根本不可能由一定的細(xì)胞型或組織制得。其他識別染色體畸變的方法是有價值的,因?yàn)樗鼈冊鰪?qiáng)了現(xiàn)行的細(xì)胞形成分析法,尤其是如果這些方法適用于有絲分裂和間期細(xì)胞群時更是如此。
      在過去的幾年里,已得到相當(dāng)多的證據(jù)表明個體染色體DNA占據(jù)著哺乳動物間期核中的焦點(diǎn)區(qū)域或空間粘性結(jié)構(gòu)域。Cremer,T.等人,Hum.Genet.,6046-56,1982;Hens,L.等人,Exp.CellRes.149257-269,1983;Schardin,M.等人,Hum.Genet.71281-287,1985;Manuelidis,L.,Hum.Genet.71288-293,1985;Pinkel,D.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA832934-2938,1986。這些研究指出可以用染色體特異探針套來檢測非有絲分裂細(xì)胞中染色體結(jié)構(gòu)域的數(shù)量或結(jié)構(gòu)畸變,這就是所謂的“間期細(xì)胞形成”法。Cremer,T.等人,Hum.Genet.74346-352,1986。事實(shí)上,最近的原位雜交研究已經(jīng)證明,用染色體特異的重復(fù)DNA作探針,可以利用間期細(xì)胞對三體-18(trisomy-18)進(jìn)行產(chǎn)前診斷并對腫瘤細(xì)胞系中的染色體數(shù)目畸變進(jìn)行檢查。Cremer,T.等人,Hum.Genet.74346-352,1986;Cremer,T.等人,Exp.CellRes.176119-220,1988。至今所報道的所有染色體特異的重復(fù)DNA均位于每個染色體的分開的亞區(qū),因此這些DNA探針不適宜對多種染色體畸變(例如易位和缺失)進(jìn)行分析。倘若能夠?qū)Κ?dú)特的、包括特異染色體的順序圖譜進(jìn)行檢測,則有可能對非有絲分裂細(xì)胞中的染色體結(jié)構(gòu)域畸變進(jìn)行分析。此外,這種常用的標(biāo)記方法使我們有可能對有關(guān)間期核中染色體DNA的空間組織這一基本問題給出答案。
      本發(fā)明的主題涉及一種通過染色體原位抑制(CISS)雜交對所選的哺乳動物有絲分裂或間期細(xì)胞中的個體染色體進(jìn)行檢查、識別和/或定量的方法,以及該方法在分析細(xì)胞中與某種條件或疾病有關(guān)的染色體、染色體片段或染色體畸變中的用途。在本發(fā)明的方法中,染色體特異性探針(DNA或RNA)與要分析的試樣結(jié)合,從而標(biāo)記本發(fā)明的個體染色體,檢查包括該染色體的順序的復(fù)雜圖譜。本發(fā)明方法中所用的探針具有較高的遺傳復(fù)合性,它是經(jīng)過適當(dāng)選擇的克隆的DNA或RNA片段(個別使用或結(jié)合使用均可)或染色體DNA文庫。
      本發(fā)明的方法稱為CISS雜交,它特別有用,這是因?yàn)樗茉诩?xì)胞周期中的任一時刻對個體哺乳動物染色體進(jìn)行特異染色??梢杂盟鼇矸治鋈旧w含量,特別是染色體畸變(例如缺失、重排、染色體數(shù)目變化),而在本發(fā)明以前,要想進(jìn)行這些檢測即使可能的話也是既費(fèi)時又困難的。本方法在需要進(jìn)行這類測定的任一場合(例如診斷和/或監(jiān)視遺傳或疾病狀態(tài))提供了一種快速和具有高度特異性的個體哺乳動物染色體測定方法。
      附圖簡述


      圖1代表本發(fā)明的CISS雜交法的主要過程。
      圖2表示不同濃度的人競爭DNA對來自染色體7的DNA文庫中的交叉反應(yīng)順序的抑制。在與中期擴(kuò)展染色體雜交并用經(jīng)FITC標(biāo)記的抗生物素蛋白檢查之前,將用生物素標(biāo)記的染色體7DNA插段(20μg/ml)與人基因組DNA預(yù)雜交20分鐘。人DNA濃度為A,0μg/ml;B.5.0μg/ml;C.100μg/ml;D.200μg/ml;E.1000μg/ml;F.與E中用DAPI后染色的中期擴(kuò)展一樣。向每一種試樣中加入鮭魚基因組DNA,將最后的DNA濃度調(diào)至1.0mg/ml(參見詳細(xì)描述部分)。箭號表示靶染色體7,箭頭表示非7染色體上的其他強(qiáng)信號。所有印刷底片的曝光、顯影均在相同的光學(xué)條件下進(jìn)行。
      圖3表示預(yù)退火時間對雜交信號特異性及強(qiáng)度的影響。使200μg/ml人競爭DNA與用生物素標(biāo)記的染色體7DNA插段(20μg/ml)預(yù)退火下列時間A.0分鐘;B.2分鐘;C.5分鐘;D.20分鐘。然后與中期雜交。
      圖4表示對正常人淋巴細(xì)胞中的A染色體1,B染色體7,C染色體4,D染色體18,E染色體13和F染色體20的修飾。只有染色體13插段DNA庫在經(jīng)過預(yù)雜交抑制步驟以后能顯著地與其他染色體雜交,用整個染色體文庫(包括λ噬菌體臂)檢查染色體20(F),并用氮藍(lán)四唑/5-溴-4-氯-3吲哚磷酸酯(NAT-BCP)作為酶底物混合物,用抗生物素蛋白-堿性磷酸酶進(jìn)行檢測。用Pinkel等人(1986)的夾層法將染色體1(A)的信號放大。
      圖5表示通過與染色體DNA文庫插段預(yù)退火定位的人淋巴細(xì)胞核中的染色體結(jié)構(gòu)域。用與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)結(jié)合的抗生物素蛋白(A-E)或與堿性磷酸酶相連的抗生物素蛋白(F)對與核的雜交(用乙酸甲醇固定)進(jìn)行檢測。圖中示出了染色體1(A、B),染色體7(C、D)和染色體18(E、F)的結(jié)構(gòu)域。在染色體7結(jié)構(gòu)域中可以看到著絲粒區(qū)域被優(yōu)先染色,這說明染色體7特異性白斑樣(alphoid)重復(fù)DNA發(fā)生了優(yōu)先雜交;在該特定實(shí)驗(yàn)中,還可以看到在中期染色體上的類似的信號分布。
      圖6表示染色體1插段與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的中期擴(kuò)展物的原位抑制(CISS)雜交,用抗生物素蛋白-FITC(A、C)檢測,并用4,6-二咪基-2-苯吲哚二氫氯酸(DAPI)(B、D)進(jìn)行后染色。A,BTG620顯示出兩條表觀完整的1染色體(B中小箭號)和兩條標(biāo)記易位染色體(箭頭),它們均被這些插段特異修飾(A)。這兩種標(biāo)記染色體之一含有1p(左下方),另一條則含有1q臂(右下方),兩條正常染色體及亞中間著絲粒標(biāo)記物中的1p端(GC較豐富區(qū))定位不夠完全。1q12區(qū)域與大多數(shù)實(shí)驗(yàn)相比幾乎沒有修飾。X950。C,D典型TC593中期擴(kuò)展物顯示出6個特異修飾的染色體。三個具近端著絲粒的標(biāo)記染色體(均帶有1p平截)顯示出特別強(qiáng)的重復(fù)熒光,該重復(fù)位于1q12(C中箭號)中。其中有兩個其1q臂似乎是完整的,而在第三個中則有明顯的大缺失(D中箭號),第四個修飾的染色體(C、D中小箭頭)也明顯缺失末端1q,但它保持一個表觀完整的1p臂。第5個亞中間著絲粒染色體(大箭頭)含有一個表觀完整的1p臂,其短臂的DNA還沒有鑒別。注意該標(biāo)記物和上述TC620(1p)的標(biāo)記染色體是相似的。由DAPI譜帶(空心箭頭)可以證實(shí)第6個完全被修飾的染色體是一種異構(gòu)(1p)。X1200。
      圖7表示染色體4文庫插段的CISS雜交過程,用抗生物素蛋白-FITC進(jìn)行檢測;TC593的間期核(A-C)和TC620的間期核(D)。注意B中的兩個表觀完整的間期結(jié)構(gòu)域彼此靠近,但在A和C中它們則分開較遠(yuǎn)。TC620間期核(D)表現(xiàn)出四個大小很不同的染色體4間期結(jié)構(gòu)域,TC593(E)的中期擴(kuò)展物顯示出兩個表觀完整的4染色體,而在亞中間著絲粒染色體中則顯示出一個較小的修飾區(qū)域(箭號)。在大約30%的擴(kuò)展物中可以看到這種具有易位的4染色體的標(biāo)記物。TC620中期擴(kuò)展(F)顯示出一個表觀完整的染色體4和3個含有不同數(shù)量染色體4物質(zhì)的易位標(biāo)記物(t)。G-J表示用生物素化染色體7插段與一種經(jīng)氨基乙酰芴(AAF)修飾的7-特異性白斑樣重復(fù)進(jìn)行雙雜交。G,染色體7插段描述了5個完全修飾的中期染色體,其中有四個是完整的染色體7,第5個(箭號)是一種異構(gòu)(7p)(參見圖3E)。H,區(qū)域和G相同,它只在4個被修飾的染色體上顯示出AAF-7白斑樣信號,而在異構(gòu)(7p)上則檢不到信號。I,TC593的間期核顯示出5個由染色體7插段定位的結(jié)構(gòu)域,其中有4個被7白斑樣探針標(biāo)記(J),I中的箭號代表間期中的異構(gòu)(7p)標(biāo)記物。
      圖8表示將染色體7和18的插段文庫與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的中期擴(kuò)展物進(jìn)行CISS雜交(用抗生物素蛋白-FITC測定),XS75。A,B,TC620與染色體7插段雜交。A中大箭頭表示3個表觀正常的7染色體和另一個含有7順序的易位染色體。B中小箭號表示被DAPI染色的完整染色體。其他研究(見正文)表明在標(biāo)記染色體中7pter-qll發(fā)生易位(大箭頭),D.用DAPI復(fù)染的相應(yīng)骨架,E.假四倍體TC593的中間擴(kuò)展顯示出5個被7文庫插段照亮的染色體,中間著絲粒染色體(m)代表異構(gòu)(7p)標(biāo)記物(該細(xì)胞系的典型代表)(參見圖2G)。插段染色體(小箭號)表示被DAPI染色的正常的和中間著絲粒的7染色體。標(biāo)記譜帶7q21和在7q11處的一塊組成異染色質(zhì)在正常的染色體7插段上均很顯著(箭號),但在標(biāo)記染色體上均不存在。而是標(biāo)記染色體的兩條臂顯示一種鏡面似的染色圖,且在7p21處帶有一個模糊的末端譜帶。F.G.TC593,與染色體18插段的雜交。F中示出了4個被修飾的18染色體,而G中有3個被DAPI染色的染色體已明顯易位(t)。
      圖9是對完整的和畸變的染色體的概括性描述,這些染色體均通過與神經(jīng)膠質(zhì)瘤TC620(左邊)和TC593(右邊)中染色體1、4、7、18和20的文庫插段作CISS雜交而測定。G-譜帶(黑)顯示出由我們的數(shù)據(jù)獲得的近似斷點(diǎn),帶有波紋的陰影區(qū)是由其他的、組成部分標(biāo)記易位染色體的染色體得到的。在兩個TC620易位的4片段旁邊的黑點(diǎn)表明染色體4物質(zhì)的分配取決于間接證據(jù)(例如大小測量)。在大約20%TC593分裂中期擴(kuò)展(+)中的染色體18物質(zhì)的細(xì)小移位尚不能進(jìn)一步識別。注意7p在兩種細(xì)胞系中均含有過分的圖象。
      圖10表示有代表性的前期(A)和間期核(B-F),用它們來表示神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的中期異常(參見
      圖1-3)。A.測定前期TC620核中的7p移位(t),X1000;B.5個在TC593中檢測到的良好分開的染色體7結(jié)構(gòu)域,X1240;C.TC620中的兩個大的和一個很小的18結(jié)構(gòu)域(用箭頭表示),X1450;D.在TC593中檢測到的4個染色體18結(jié)構(gòu)域,這些信號(箭號)中有一個顯得較小,X1450;E.TC620中的4個染色體1結(jié)構(gòu)域(參見
      圖1A、B),X1200;F、TC593中至少5個染色體1結(jié)構(gòu)域,其中有1個(箭頭)比其他的小很多,X1250;G.H.對技術(shù)上劣質(zhì)的TC593中期擴(kuò)展(用DAPI后染色,G)的雜交仍然顯示了帶有18順序的4個不同染色體(H),X1000。
      圖11通過CISS雜交圖示了染色體7(A、C)、22(D)和4(E)的間期和/或中期數(shù)目。間期計數(shù)用150個良好雜交的制備物的核進(jìn)行,中期計數(shù)時,對25個以上的完整的、經(jīng)DAPI染色的擴(kuò)展進(jìn)行評價。A-C,7特異性的白斑樣重復(fù)(白柱)與7文庫插段(陰影柱)相比的計數(shù)A.受植物凝集素激活的人淋巴細(xì)胞的間期核(46,XY);B.TC620間期核(7特異性的白斑樣重復(fù))和中期擴(kuò)展(7文庫插段);C.TC593間期核(7特異性的白斑樣重復(fù))和中期擴(kuò)展(7文庫插段)。7白斑樣重復(fù)的高度嚴(yán)格性雜交(參見材料和方法)可用來避免與其他的染色體交叉雜交。對于用7文庫插段和白斑樣重復(fù)進(jìn)行的雙雜交來說(圖2G-I中所示),利用50%甲酰胺的標(biāo)準(zhǔn)條件就足以避免交叉雜交,這可能是因?yàn)橛腥烁偁嶥NA存在的緣故。D.TC620中期擴(kuò)展中(黑柱)和TC593中期擴(kuò)展中(陰影柱)染色體22的計數(shù)。為了比較,同時用7文庫插段進(jìn)行CISS雜交(參見CD和圖7)作為內(nèi)對照。E.與用染色體4插段雜交的TC593相比的間期計數(shù)(白柱)和中期計數(shù)(陰影柱)。注意在中期和間期中的信號制劑比率是相同的,均為2∶3。
      圖12表示在用染色體7和22插段進(jìn)行雙雜交后的TC620中期擴(kuò)展,上述兩種染色體均用生物素標(biāo)記,并用抗生物素蛋白-FITC檢測。還可以看到兩條被高度修飾的22染色體(箭號),3條完整的7染色體,以及含有7pter-qll的中間著絲粒的標(biāo)記染色體。
      圖13圖示了在典型的、來自神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TC593和TC620的中期擴(kuò)展中的被修飾的正常的和畸變的染色體4、7和18的相對大小。將各個區(qū)域正規(guī)化,從而用區(qū)域1表示完整的染色體(參見表1的注釋)。所有附加的信號均代表所存在的特異染色體當(dāng)量數(shù)。白色區(qū)域?qū)?yīng)于表現(xiàn)正常的染色體,黑色區(qū)域則表示較小的、完全被特異文庫插段修飾的游離染色體片段,易位的片段則為陰影區(qū)。用這種度量法,TC593中3個易位的18染色體之一就代表一個完整的染色體(用黑點(diǎn)表示),而其他兩個易位稍小些,這可能是由于試樣較少的緣故。
      圖14表示通過用生物素化的DNA探針套進(jìn)行CISS雜交對人染色體21進(jìn)行特異標(biāo)記。A.與正常淋巴細(xì)胞中期擴(kuò)展雜交的質(zhì)粒pPW519-1R(6Kb插段)。經(jīng)DAPI譜帶(未示出)驗(yàn)證,這些信號位于21q端部(參見插圖中被4,6-二咪基-2-苯吲哚(DAPI)染色的染色體)。B和C.與94千堿基質(zhì)粒庫探針套雜交后的正常人淋巴細(xì)胞中期(B)和核(C)。端部譜帶21q22.3被特異標(biāo)記。D和E.在與94千堿基探針套(D)或染色體21文庫DNA插段進(jìn)行CISS雜交過程(14)后,在三體21(47,+21)淋巴細(xì)胞中期擴(kuò)展上的信號。(E)3個染色體21被文庫插段完全定位;其他一些次要信號(見正文)用箭頭表示(也見于G中)。(F-J)用文庫插段標(biāo)記三體21淋巴細(xì)胞核(F和G;與E相比)。
      本發(fā)明是以一種雜交方案為基礎(chǔ)的,在該方案中,通過在重退火過程(以快速重組動力學(xué)為基礎(chǔ))中使用整個DNA,使來自普遍存在的重復(fù)DNA順序的雜交信號得到抑制。本發(fā)明的雜交方法由于能選擇性抑制這類信號,故被稱為染色體原位抑制(CISS)雜交。該方法能在細(xì)胞周期中的任一時刻對一種或多種選擇的個體染色體,特別是人染色體進(jìn)行特異細(xì)胞染色,該方法可用來檢查、識別和定量有絲分裂細(xì)胞和間期細(xì)胞(即間期核)中的染色體畸變。
      下述實(shí)例將對本發(fā)明作更詳細(xì)描述。
      1.通過本發(fā)明的方法(CISS雜交)對有絲分裂和間期細(xì)胞中的個別人染色體進(jìn)行特異染色,采用染色體特異性探針套(即染色體DNA文庫,克隆的DNA片段),該探針套具有較高的遺傳復(fù)合性。
      2.利用染色體特異性文庫探針,通過CISS雜交對中期和間期腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異染色。
      3.利用CISS雜交對有絲分裂和間期細(xì)胞中的多種來源的人染色體(染色體21)畸變進(jìn)行快速檢查,這些染色體畸變與某種遺傳疾病(唐氏先天愚癥,DownSyndrome)有關(guān)。
      4.證實(shí)套裝的染色體特異性獨(dú)特順序探針可用于識別染色體畸變,以及檢查遺傳性疾病(如唐氏先天愚癥)。
      個別人染色體的特異染色利用CISS雜交法,可以將有絲分裂和間期細(xì)胞中的個別(如X和Y染色體或染色體1-22中的同源對)人染色體特異染色。該過程已經(jīng)在中期擴(kuò)展物和間期核中進(jìn)行過,而且已用來染色或標(biāo)記一種預(yù)選的(個別)染色體,以及用來同時染色或標(biāo)記多種預(yù)選的(個別)染色體,分別采用信號-探針CISS雜交法以及多探針CISS雜交法,并與適當(dāng)?shù)臋z查方法相聯(lián)系。該方法簡示于
      圖1中。
      利用基因組DNA文庫和克隆的DNA進(jìn)行特異染色體染色采用市場上可得到的基因組DNA文庫(來自經(jīng)流式細(xì)胞光度術(shù)選出的人染色體)和克隆的DNA片段,按下述進(jìn)行CISS雜交,從而對個別人染色體進(jìn)行特異染色。VanDilla,M.A.等人,Biotechnology4537-552,1986。通過在重退火過程(以快速重組動力學(xué)為基礎(chǔ))中采用整個人體DNA,使來自普遍存在的重復(fù)順序(如Alu和KPnI成分)的雜交信號得到抑制。其他人也利用了類似原理,以促進(jìn)Southern印跡分析及原位雜交實(shí)驗(yàn)中與來自柯斯質(zhì)粒DNA克隆的獨(dú)特順序亞組的選擇性雜交。Sealey,P.G.等人,NucleicAcids131905-1922,1985;Landegent,J.E.等人,Hum.Genet.77366-370,1987。以下列方式(在實(shí)例1中作詳細(xì)描述)對中期擴(kuò)展物和間期核中的個別染色體進(jìn)行特異標(biāo)記。已經(jīng)證明,對染色體結(jié)構(gòu)域的3維重建結(jié)構(gòu)采用與CISS雜交法相結(jié)合的計算機(jī)輔助的光學(xué)分區(qū),從而進(jìn)行核拓?fù)鋱D象的分析是切實(shí)可行的。
      開始時,先由預(yù)選的一個或多個染色體制備基因組DNA,以作為探針DNA。基因組DNA可以由多種渠道獲得,舉例來說,可以用一種或多種基因組DNA文庫(每種文庫含有感興趣的染色體,即染色體產(chǎn)生的文庫)制備所需的DNA探針。這些文庫可以是由市場上獲得的基因組DNA文庫,該基因組DNA文庫來自經(jīng)流式細(xì)胞光度術(shù)分選的人染色體。它們可以由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)獲得。如實(shí)例1中所述,來自人染色體1、4、7、8、9、12、13、14、16、17、18、20、21、22和X染色體的這種DNA文庫已用于本發(fā)明的方法中。其他從市場上獲得的基因組DNA文庫或非商業(yè)來源的基因組DNA文庫也可使用。此外,個體質(zhì)粒、噬菌體、酵母、帶有非酵母DNA插段的人造染色體以及柯斯質(zhì)粒DNA克隆也可作為預(yù)選個體染色體或多重預(yù)選染色體的DNA探針源。當(dāng)DNA來自基因組文庫時,則該DNA在用可測信號標(biāo)記之前,由含有它的載體上以庫形式分離,也可不必與該載體分離。
      探針用一種可測信號標(biāo)記,該可測信號可以是一種熒光指示物,特異結(jié)合對(如生物素-抗生物素蛋白或配體-抗體)中的一個成員或一種酶。由該載體上獲得的DNA可以通過制品翻譯(例如用Bio-11-dUTP)、用Amersham多引物DNA標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行隨機(jī)引物擴(kuò)展(如3′尾端),用Bio-11-dUTP取代dTTP或其他合適的方法標(biāo)記。當(dāng)DNA未從載體上分離時,就可用標(biāo)準(zhǔn)方法通過制品翻譯直接進(jìn)行生物素標(biāo)記。Brigati等人,Virology12632-50,1983。其他標(biāo)記可以同樣方式加入(如2,4-二硝基苯酚,地谷新)。
      探針大小需要精心選擇并調(diào)整,以使探針容易穿透,并使重退火雜交過程最佳化。通常使用的標(biāo)記DNA片段小于500核苷酸,更常用的大多數(shù)探針的長度為150-250核苷酸。這種長度的探針是由更長的核苷酸順序,采用公眾可得到的限制酶或用于制備和回收大小合適的片段的已知技術(shù)制得的。如果預(yù)選染色體的核苷酸順序是已知的,則也可以采用已知方法人工合成具有該順序的寡核苷酸。經(jīng)過標(biāo)記,這類寡核苷酸就可用來修飾特定的染色體區(qū)域。舉例來說,已經(jīng)鑒別到與哺乳動物染色體末端順序特異雜交的寡核苷酸探針。Moyuif等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Sep.1988。
      競爭DNA能抑制普遍存在的重復(fù)順序的雜交信號,它將按需要選擇(例如根據(jù)其染色體需要分析的哺乳動物)。在分析人染色體時,競爭DNA是完整的人DNA,它能抑制普遍存在的重復(fù)順序如Alu和KpnI成分的雜交信號。它可以由多種渠道獲得,例如,可以用已知方法,例如Davis等人所述的,Davis,L.G.等人,Basicmethodsinmolecularbiology,Elsevier,N.Y./Amsterdam(1986),由胎盤或白血細(xì)胞獲得人基因組DNA。用標(biāo)準(zhǔn)方法(如用DNA酶)將它消化,從而產(chǎn)生大小分布和探針DNA相同的競爭DNA片段。
      如果需要,還應(yīng)包括來自別的渠道的DNA,它僅與一小部分人DNA競爭,必要時用它來調(diào)整雜交混合物的總(最終)DNA濃度。此DNA可稱為載體DNA。用標(biāo)準(zhǔn)方法制備或處理這種DNA,使其大小分布與探針DNA相同。
      開始時,將載有可測標(biāo)記的探針DNA與競爭DNA在適宜發(fā)生預(yù)退火的條件下結(jié)合。將與競爭DNA結(jié)合的探針DNA的數(shù)量調(diào)整至反映該染色體靶的相對DNA量。例如,染色體1含有相當(dāng)于染色體215.3倍的DNA。探針濃度分別為30μg/ml和5μμg/ml。當(dāng)用整個基因組文庫DNA作為探針混合物(而不是純化的DNA插段時),則需加入約10倍的標(biāo)記DNA以補(bǔ)償大量存在的載體順序。對于文庫LAOXNLOI(X染色體)和LA16NLOZ(染色體16)只需加入2倍的標(biāo)記文庫DNA,這是因?yàn)樵撊薉NA插段差不多構(gòu)成了總文庫DNA的一半。必要時可以加入載體DNA,如鮭魚睪丸DNA,使總的DNA濃度達(dá)到預(yù)定數(shù)值。如這里所述,加入足夠量的鮭魚睪丸DNA,就能使該雜交混合物中的最終DNA濃度達(dá)到1.0mg/ml,上述雜交混合物中含有3種DNA探針DNA,競爭DNA,以及不能有效競爭的DNA。
      將所得到的雜交混合物處理(如加熱)從而使存在的DNA變性,并將該混合物在約37℃下保溫足夠時間以促進(jìn)部分重退火。
      將含有要識別(特異標(biāo)記的)的染色體DNA的試樣也進(jìn)行處理,使其中的DNA可與互補(bǔ)順序雜交,例如通過加熱使DNA變性。將雜交混合物與試樣在一定條件下結(jié)合,并保持足夠的進(jìn)行雜交的時間。在經(jīng)過足夠的時間后,用標(biāo)準(zhǔn)方法對染色體靶上的特異標(biāo)記進(jìn)行檢測。例如,如實(shí)例中所述,用由熒光素標(biāo)記的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白-堿性磷酸酶復(fù)合物檢測生物素化的探針。為了進(jìn)行熒光檢測,使試樣與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)結(jié)合的抗生物素蛋白DCS保溫(參見實(shí)例1)。如有必要,可以通過用與生物素結(jié)合的山羊抗抗生物素蛋白D抗體保溫、沖洗、并與FITC結(jié)合的抗生物素蛋白進(jìn)行第2次保溫將FITC信號放大。為了通過酶活性進(jìn)行檢測,需使試樣與鏈生物素保溫、沖洗、與生物素結(jié)合的堿性磷酸酶保溫、再沖洗及預(yù)平衡(如在AP緩沖液中,如實(shí)例1中所述)。在含有氮藍(lán)四唑及5′-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽的AP緩沖液中進(jìn)行酶反應(yīng),并通過在2×SSC中保溫而終止反應(yīng)。
      用CISS雜交檢測染色體畸變利用上述步驟,可以對任何一種或多種預(yù)選的個體染色體(稱為靶染色體)或其亞區(qū)域進(jìn)行特異染色或標(biāo)記。正如實(shí)例中所述的那樣,已證明本發(fā)明方法可用于多種細(xì)胞,有絲分裂(如中期、前期)和間期細(xì)胞均可。如實(shí)例2中所詳細(xì)描述的那樣,本發(fā)明的CISS雜交法能將有絲分裂和間期非整倍體腫瘤細(xì)胞中復(fù)雜的個體染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變(如染色體數(shù)目的變化、缺失、重排或易位)快速篩選出來。
      在本文中,將生物素化的文庫DNA插段用于CISS雜交法中,從而制備能用已知方法檢測的雜交分子。用兩種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系作為非整倍體細(xì)胞,特別是腫瘤細(xì)胞的一般模型。一種是少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,另一種則為膠質(zhì)纖維素瘤細(xì)胞系。利用生物素化的、對染色體1、4、7、18和22特異的DNA探針分析這些細(xì)胞系。對染色體(從pter到qter)作特異標(biāo)記就可能使我們目測中期擴(kuò)展物及較早的前期和間期核中染色體的數(shù)目變化、缺失和重排。人們就能將這些細(xì)胞非常復(fù)雜的核型中的完整染色體、缺失染色體和易位染色體片段很快地定位。其他的亞區(qū)域探針可用來進(jìn)一步確定畸變的染色體。用數(shù)字圖象分析來定量各種細(xì)胞系的單個中期和間期細(xì)胞中全套特異染色體DNA。觀察到染色體21的不足以及染色體7(尤其是7p)的過分圖象。這些與以前其他人采用常規(guī)的細(xì)胞遺傳譜帶法進(jìn)行的研究結(jié)果是一致的。Bigner,S.H.等人,CancerGenet.Cytogenet.22121-135,1987;Shapiro,J.R.,Semin.Oncol.134-15,1986。
      所用的兩種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的幾種細(xì)胞遺傳特性與許多神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞是一樣的。因此,有理由推測,CISS雜交法也能以相同的方式對其他染色體進(jìn)行特異修飾以及檢查膠質(zhì)腫瘤中的染色體。所分析的兩種細(xì)胞型均是高度非整倍體(即它們具有100個染色體,而不是正常的46個)。因此,有理由推測CISS雜交法也能用于分析任何一類非整倍體(腫瘤)細(xì)胞。
      因此,CISS雜交法可用來分析與癌癥有關(guān)的染色體畸變,既可診斷疾病又可觀察病人的狀態(tài)(如治療后的好轉(zhuǎn)、惡化或變化)。在此用途中,可以測定單個染色體或多個染色體及其亞區(qū)域。也可以用兩種DNA探針(每種帶有不同的標(biāo)記)進(jìn)行雙雜交。也就是說,可以用生物素化的染色體7文庫DNA插段和對染色體7(Pa7t1)〔用氨基乙酰芴(AAF)修飾〕上白斑樣重復(fù)特異性的探針來測定兩種腫瘤細(xì)胞(TC593、TC620)的中期擴(kuò)展和間期核中的染色體7含量/特性。雜交以后,用抗生物素蛋白-FITC測定生物素化的染色體7插段,用與四甲基fhodamine異硫氰酸鹽(TRITC)結(jié)合的第二種抗體檢查對染色體7特異的白斑樣AAF標(biāo)記的順序。用CISS雙雜交檢查染色體8和14間的易位,即Burkitt淋巴瘤細(xì)胞(一種高度惡性B淋巴腫瘤細(xì)胞),它在中期擴(kuò)展和間期細(xì)胞中均可觀察到。
      這就使我們能檢查這兩種細(xì)胞中染色體7之間的相同與差別在含有可測7著絲粒信號的TC593中只發(fā)現(xiàn)四個完整的7染色體,較小的中間著絲粒7染色體缺少7白斑樣順序以及在7q11處的一小塊異源染色質(zhì)(這表明它缺少特定著絲粒區(qū)域)。與其相反的是,TC620的4個染色體7均被7白斑樣探針標(biāo)記。雙CISS雜交還使得區(qū)別某種細(xì)胞系(TC593)中的染色體7成為可能,并且能證實(shí)其他細(xì)胞系(TC620)中染色體7的相似性(至少就能測定的性能而言)。
      雙CISS雜交可用來檢查Burkitt淋巴瘤細(xì)胞中染色體8和染色體14間的易位,Burkitt淋巴瘤是一種高度惡性的B淋巴細(xì)胞腫瘤。在中期擴(kuò)展及間期細(xì)胞中均檢到易位。
      通過使用適當(dāng)選擇的探針和/或標(biāo)記,就可以增加不同染色體的數(shù)量以及在某些或全部染色體上的亞區(qū)域數(shù)量,后一種染色體可以通過多CISS雜交同時進(jìn)行分析。舉例來說,可以一次使用一個以上的探針(每個探針特異于靶染色體上的一個亞區(qū)域)來分析在該單個染色體上的多個亞區(qū)域。還可以用不同的熒光染料或不同的指示分子標(biāo)記每一個探針套(DNA或RNA片段套),上述熒光染料或指示分子在探針-靶染色體雜交后能通過已知方法(如利用特定的熒光或酶試劑)彼此區(qū)分。
      此外,也可用CISS雜交法的“組合”變型來提高能同時測定的染色體的數(shù)量。也就是說,可以使用一種雜交探針混合物,該混合物由單獨(dú)一套探針順序制成,而該探針順序由兩個部分組成,每一部分用不同的熒光染料(如熒光素和若丹明)標(biāo)記,經(jīng)過雜交,能產(chǎn)生第3種熒光“顏色”或信號,它們能從光學(xué)上與原熒光染料分開。兩種不同的熒光染料以這種形式配對,使得識別3種不同染色體成為可能。例如,僅用熒光素標(biāo)記的探針套在雜交后將產(chǎn)生一種顏色,僅用若丹明標(biāo)記的相同探針套經(jīng)過雜交將產(chǎn)生第二種(不同的)顏色,當(dāng)該探針套中的一半用這兩種物質(zhì)中的一種標(biāo)記時,則兩種順序亞組能以相等的幾率與靶雜交,并可觀察到第三種(不同的)顏色(與混合色不一定不同)。這里重要的一點(diǎn)是并沒有將兩種熒光染料引入相同的分子中,其目的在于將E傳遞的可能性減至最小,E傳遞是一種已知過程,在該過程中,由一種熒光染料(其光譜與其他熒光染料的光譜相重迭)發(fā)出的光被第二種熒光染料吸收。被傳遞的電子被第二種熒光染料射出,這將使第一種熒光染料淬滅。光譜特性經(jīng)過選擇的3種不同的熒光染料的成對結(jié)合,可以單獨(dú)使用以及以類似的形式成對結(jié)合使用。這就可能產(chǎn)生6種不同的熒光顏色或信號(如3對加上3種單色熒光染料)。將4種不同的熒光染料類似地結(jié)合就會產(chǎn)生10種不同的熒光顏色或信號,而5種不同的熒光染料則會產(chǎn)生15種不同的顏色或信號,如此等等。結(jié)合熒光(結(jié)合兩種或多種熒光染料以標(biāo)記相同的探針套)原則適用于中期和間期染色體分析,因?yàn)槊恳环N染色體都是物理學(xué)上獨(dú)立的實(shí)體,因此是一種不同的靶。復(fù)合探針標(biāo)記(其中使用了三種不同熒光染料的混合物)會產(chǎn)生更大的顏色或信號差異性,這種差異性可用于同時進(jìn)行多參數(shù)分析。
      另一種提高能同時分析的染色體數(shù)量的方法是一種熒光探測“時間分辨”法。在該方法中,用與特定的鑭系元素(如銪Eu,鋱Tb)結(jié)合的螯合“室”標(biāo)記DNA9或RNA探針??梢允惯@類金屬螯合物發(fā)出熒光。它們的激發(fā)態(tài)壽命比大多數(shù)普通熒光染料(其半衰期在毫微秒范圍內(nèi))要長好多(微秒至毫秒)。其波長和熒光壽命均受所用的鑭系金屬離子性能的影響。如果采用一種脈沖門系統(tǒng),該系統(tǒng)用光激發(fā)試樣幾毫微秒,然后關(guān)閉,則就有可能使壽命短的熒光染料衰減至基態(tài),在激發(fā)后的某個特定時間(即1-100微秒)打開該檢測系統(tǒng),從而只檢測壽命長的熒光染料??梢杂眠@種方法來識別兩種光譜相同但壽命不同的熒光染料,從而使熒光染料識別增加一個時間因子。
      另一種增加能同時分析的不同染色體數(shù)量的方法是以一種檢測系統(tǒng)為基礎(chǔ)的,該檢測系統(tǒng)根據(jù)附著的熒光染料的柔韌性或剛度來區(qū)分染色體。這時可以用相同的熒光染料標(biāo)記兩種單鏈探針套,在一個探針套中,熒光染料被引入到DNA順序體中,該DNA順序?qū)⑴c感興趣的靶DNA形成雜交分子。在第二個探針套中,該熒光染料被引入到不與靶DNA雜交的DNA順序中(例如,利用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶加入了尾端聚dA-熒光染料,將用熒光染料標(biāo)記的異源DNA與探針DNA連接,或者通過其他本領(lǐng)域已知的常用的二次標(biāo)記方法)。在形成探針-靶染色體雜種的DNA體中的熒光染料將被固定化,因此不能在溶液中自由轉(zhuǎn)動。與其相反的是,在單鏈的、不參加雜種形成的DNA中的熒光染料則不會固定,能在溶液中很自由地轉(zhuǎn)動。通過測定熒光染料自由轉(zhuǎn)動的速度(即通過測定用偏振光照耀時熒光消偏振的速度),就可以辨別這兩套探針。
      用CISS雜交法及區(qū)域性確定的探針套對與遺傳疾病有關(guān)的染色體畸變及染色體損傷進(jìn)行快速分析已經(jīng)證實(shí)CISS雜交法能用于對與遺傳疾病(例如對于染色體21,唐氏先天愚癥)有關(guān)的染色體畸變(如染色體21的數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變)進(jìn)行快速分析。實(shí)例3中描述了特異標(biāo)記末端譜帶21q22.3或修飾中期和間期細(xì)胞中整個染色體21畸變的DNA探針套,克隆的、來自人染色體21的DNA片端可用來特異標(biāo)記多種細(xì)胞的中期擴(kuò)展或間期該中的同源染色體區(qū)域。也就是說,采用染色體21探針套的CISS雜交法能有效地標(biāo)記/識別淋巴細(xì)胞,絨膜毛胚細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(TC620)中的染色體21DNA。來自譜帶21q22.3的獨(dú)特的探針套還可用于檢測染色體固體組織(“正常”人腦組織”),因此很顯然,CISS雜交法以及使用獨(dú)特順序庫探針的雜交法對于診斷唐氏先天愚癥及其他與染色體畸變有關(guān)的遺傳疾病或其他疾病均是有潛力的。
      實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三體核型在間期細(xì)胞中是很容易被診斷出來的,這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)核(55-65%)呈現(xiàn)出3種不同的雜交中心。與之相反的是,在具有二體核型的淋巴細(xì)胞中,只有0.2%以下的核顯示出3種核信號;有趣的是,在正常的CV細(xì)胞中,這類核的比例較高,但仍低于5%。通常,只需20-30個細(xì)胞就足以清楚地區(qū)分二體和三體細(xì)胞群。但是考慮到臨床試樣中染色體21鑲嵌水平的不確定性,進(jìn)行明確診斷所需的細(xì)胞數(shù)量通常要多些。此外,還需進(jìn)行臨床聯(lián)系以確定絕對數(shù)目。不管怎么說,該分析方法使我們不必培養(yǎng)細(xì)胞或獲得中期擴(kuò)展就能診斷唐氏先天愚癥。它還縮短了診斷時間,由日前的10-14天減到1天或更少。
      雖然我們在這里僅選用只含有獨(dú)特的人DNA順序的質(zhì)??寺?,含有重復(fù)順序的柯斯質(zhì)??寺∫材苡脕韺χ衅诤烷g期細(xì)胞中的同源基因組區(qū)域進(jìn)行特異標(biāo)記。例如采用類似CISS雜交法的雜交工藝,使重復(fù)順序成分的信號作用受抑。因此,單一的成套裝的柯斯質(zhì)粒可以以這里所述的形式用來作為診斷其他遺傳疾病的工具。染色體13、18和21的三體性以及染色體X和Y的數(shù)量變化是引起絕大多數(shù)染色體數(shù)目異常的原因,這些異常是在產(chǎn)前核型分析中識別的。隨著多型非同位素探針標(biāo)記和檢測系統(tǒng)的不斷發(fā)展,人們經(jīng)過原位雜交就可以同時目測3種或更多的染色體。前面各部分中所述的,用來增加染色體數(shù)目和/或能同時分析的染色體區(qū)域數(shù)目的CISS雜交法的一些變化形式也可用來檢測與遺傳疾病有關(guān)的染色體畸變和染色體損傷。因此,發(fā)展快速、自動的篩選測試方法,從而直接在來自羊水或絨膜毛細(xì)胞的間期細(xì)胞中檢測大多數(shù)三體性疾病將是未來可行的目標(biāo)。通過原位雜交對特定的人染色體進(jìn)行分析,這一方法已被用來補(bǔ)充對高度非整倍體腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行的傳統(tǒng)細(xì)胞形成研究(實(shí)例2),并被批準(zhǔn)擴(kuò)大到產(chǎn)前診斷。
      對具有染色體21易位的核型進(jìn)行分析,結(jié)果表明區(qū)域探針套甚至可用于對很小的易位進(jìn)行快速識別和特征測定(通過中期染色體上的清楚信號),從而避開通過高分辨率譜帶進(jìn)行的擴(kuò)大分析。與其相反,該文庫插段探針更適用于確定易位的染色體21DNA的相對數(shù)量。通過分析間期核,就可以確定是否存在平衡的或不平衡的染色體區(qū)域數(shù)量。但是直接在核中檢測易位的染色體需要用雙標(biāo)記法來識別受體染色體(即染色體21物質(zhì)所易位到的染色體)。采用以往的染色體技術(shù),可以通過測定核信號的并列情況來分析易位過程。
      Rappoid,G.A.等人,Hum.Genet.67317-325,1984。
      覆蓋染色體X上整個肌肉萎縮位點(diǎn)的柯斯質(zhì)??寺∫驯挥脕碜R別染色體X和染色體4之間的易位。
      含有6千堿基順序的探針被高效定位于中期擴(kuò)展和間期細(xì)胞中。這種用非同位素試劑的檢測靈敏度與最近的其他報道相似。將非同位素原位雜交法與DAPI或BrdUrd譜帶法、或用DNA文庫探針進(jìn)行染色體整體修飾相結(jié)合,就能為基因圖譜測定提供簡單通用的方法。結(jié)合熒光法還使同時檢測幾種染色體區(qū)域成為可能,從而能夠通過原位雜交進(jìn)行遺傳連鎖分析。它還可以用較小的DNA探針快速確定易位染色體上的斷點(diǎn),它還有助于確定唐氏先天愚癥的關(guān)鍵性基因組片段。利用CISS雜交法識別并分離染色體特異順序本發(fā)明的CISS雜交法還可用于識別染色體特異順序,從而用已知的方法將它們與重復(fù)順序分離。這些由非特異性或重復(fù)性順序分離并被標(biāo)記的染色體特異順序,可用于(例如)在診斷過程中進(jìn)行雜交分析,從而識別、檢查和/或定量感興趣的染色體或染色體區(qū)域(例如與某種遺傳疾病有關(guān)的,或引起傳染疾病的)。將待測定所選靶核苷酸順序的試樣與由重復(fù)順序分離的、經(jīng)過適當(dāng)選擇標(biāo)記的染色體特異順序(例如對該染色體上順序特異的順序,通常稱為靶核苷酸順序,它將在試樣中被檢測和/或定量)在適當(dāng)條件下結(jié)合起來,就會導(dǎo)致與試樣中的互補(bǔ)順序的雜交。當(dāng)然如果試樣中沒有互補(bǔ)順序就不會發(fā)生雜交。
      這些分離的染色體特異核苷酸順序被包括在一種藥盒中,可采用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù),用該藥盒對所述的染色體或其區(qū)域進(jìn)行識別、檢查和/或定量分析。例如,將標(biāo)記的、對染色體21特異的(或?qū)Σ糠秩旧w21特異的)、用CISS雜交法識別的并由染色體21上重復(fù)順序分離的核苷酸順序與其他試劑,例如緩沖液、競爭DNA、載體DNA和檢測標(biāo)記的、由染色體21產(chǎn)生的核苷酸順序(與試樣中存在的染色體21順序雜交)所需的物質(zhì)一起裝入藥盒中。很顯然,這類藥盒可以制備成包括由一種或多種感興趣的染色體獲得的核苷酸順序。競爭DNA、載體DNA以及檢測雜交順序用的物質(zhì)如前所述。實(shí)例1用基因組DNA文庫,通過CISS雜交對單個人染色體進(jìn)行細(xì)胞特異染色DNA文庫下列人染色體基因組文庫是由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的LA01NS01(染色體1),LL04NS01(染色體4),LA07NS01(染色體7),LL08NS02(染色體8),LA13NS03(染色體13),LL14NS01(染色體14),LL19NS01(染色體18),LL20NS01(染色體20),LL21NS02(染色體21),LA22NS03(染色體22),LA0XNL01(染色體X),用標(biāo)準(zhǔn)工藝,在瓊脂平面上使這些噬菌體文庫擴(kuò)增(用LE392細(xì)胞作為細(xì)菌宿主),純化λ噬菌體以及提取噬菌體DNA庫。Maniatis,T.等人,MolecularCloningALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NJ(1982)。
      中期擴(kuò)展和成纖維細(xì)胞的制備將來自正常成年男子(46,XY)的、經(jīng)植物凝集素激活的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在McCoy5A介質(zhì)(GIBCO)中,用乙酰甲基秋水仙堿停滯、用0.075MKCl低滲溶液處理,固定于乙酸甲醇中,中期擴(kuò)展用標(biāo)準(zhǔn)工藝制備。將低代正常人前皮成纖維細(xì)胞(46,XY)生長在顯微鏡載片上,用多聚甲醛固定,并如前述使之滲透,即制備更完整的三維結(jié)構(gòu)制劑的方法。Manuelidis,L.Ann.NYAcad.Sci.450205-221,1985。
      制備原位雜交用的DNA插段DNA探針通過用適當(dāng)?shù)南拗泼浮睧coRi(LA文庫)或HindⅢ(LL文庫)〕消化,然后在0.6%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行制備型電泳,將來自染色體DNA文庫的基因組DNA片段以庫形式與Charon21A載體臂分離。通過電洗脫到Elutrap(Schleicher和Schuell)中將該插入片段與凝膠切片分離,并進(jìn)一步用Elutip-d柱層析提純(Schleicher和Schuell)。然后用苯酚/氯仿(1∶1)將DNA萃取并用乙醇沉淀。通過用Bio-11-dUTP進(jìn)行缺口翻譯,或者用多引物DNA標(biāo)記系統(tǒng)(其dTTP被0.5mMBio-11-dUTP取代)(Amersham)進(jìn)行隨機(jī)引物擴(kuò)展將該DNA片段庫標(biāo)記。Langer,P.R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA786633-6637,1981以及Brigati,D.J.等人,Virology12632-50,1983。此外,可直接(載體臂不分離)通過缺口翻譯,用生物素標(biāo)記染色體特異性的DNA文庫。
      探針大小為了便于探針穿透并使重退火雜交最佳化,最好使標(biāo)記的DNA片段小于500核苷酸;而大多數(shù)探針長度一般為150-250核苷酸。DNA酶在缺口翻譯反應(yīng)中的濃度靠經(jīng)驗(yàn)確定,從而產(chǎn)生大小范圍合乎需要的片段,這可以通過瓊脂糖凝膠電泳來檢驗(yàn)。隨機(jī)引物擴(kuò)展還可以在能產(chǎn)生類似的DNA大小分布的條件下進(jìn)行。
      競爭DNA將人基因組DNA(來自胎盤或白血細(xì)胞,制備如前所述)以及鮭魚睪丸基因組DNA(Sigma)用DNA酶消化,從而得到大小分布與探針DNA相同的片段,然后用苯酚/氯仿萃取,并用乙醇沉淀。Davis,L.G.等人,“Basicmethodsinmolecularbiology”,Elsevier,NewYorkAmsterdam(1986)。如圖2所示,可用競爭DNA改變與探針順序的比率。
      預(yù)退火和雜交在標(biāo)準(zhǔn)條件下,將5μg/ml到30μg/ml用生物素標(biāo)記的DNA(代表文庫插段)與不同量的競爭DNA結(jié)合,用乙醇沉淀并兩次懸浮于甲酰胺中。將探針濃度調(diào)整到反映每種染色體靶的相對DNA含量。舉例來說,染色體1含有約5.3倍于染色體21的DNA,因此,所用的探針濃度應(yīng)分別為30μg/ml和5μg/ml,Mendelsohn,M.L.等人,Science1791126-1129(1973)。當(dāng)將整個DNA文庫用作探針混合物,而不是純化的DNA插段時,需加入多達(dá)10倍的標(biāo)記DNA,以補(bǔ)償大量的載體順序。對于X染色體文庫LAOXNLO1,只需使用2倍多的標(biāo)記文庫DNA,這是因?yàn)樵撊薉NA插段構(gòu)成了約一半的整體DNA。為了進(jìn)行比較,人競爭DNA在雜交混合物中的濃度可以從1~1.0μg/ml,鮭魚睪丸DNA按需要加入,使其在50%甲酰胺、1×SSC(0.15M氯化鈉,0.015M乙酸鈉,pH7.0)及10%硫酸葡聚糖中的最終DNA濃度達(dá)到1.0mg/ml。將這些溶液在75℃加熱5分鐘,使DNA變性,然后在37℃下培養(yǎng)不同的時間以促進(jìn)部分重退火。在向該樣品中加入雜交混合物之前在Eppendorf管中進(jìn)行預(yù)退火步驟。將載片上的核和擴(kuò)展染色體在70℃下,在70%甲酰胺,2×SSC中保溫2分鐘,從而使染色體DNA變性,然后在一系列冰冷的乙醇(70%,90%,100%,每種3分鐘)中脫水。將預(yù)退火的探針混合物(2.5μl/cm2)放到預(yù)熱至42℃的載片上后,加上頂蓋,并用橡膠粘結(jié)劑密封,然后立即將試樣在潮濕的腔室中,在37℃下培養(yǎng)10-20小時。
      當(dāng)采用多聚甲醛固定液以更好地維持試樣的三維結(jié)構(gòu)時,將載片平衡于50%甲酰胺,1×SSC(2×5分鐘)中,除去過量的流體但不使試樣干燥,加入探針混合物(5μl/cm2),加上頂蓋,并用橡膠粘結(jié)劑密封。Manuelidis,L.,Ann.NY Acad.Sci.450205-221,1985。在75℃下將探針及細(xì)胞DNA變性5分鐘,隨后在37℃下雜交過夜。
      檢測雜交后,用50%甲酰胺,2×SSC(3×5分鐘,42℃)沖洗載片,隨后在0.1×SSC(3×5分鐘,60℃)中洗滌。然后在37℃下,用牛血清蛋白(BSA),4×SSC將載片培養(yǎng)約30分鐘。用經(jīng)熒光素標(biāo)記的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白-堿性磷酸酶復(fù)合物對生物素化的探針進(jìn)行檢測。所有的檢測試劑均在4×SSC,0.1%Tween20,1%BSA中制成,而所有洗滌均在4×SSC,0.1%Tween20中進(jìn)行(3×3分鐘,42℃)。為了進(jìn)行熒光檢測,用5μg/ml與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)結(jié)合的抗生物素蛋白DCS(VectorLaboratories)將載片在37℃下保溫30分鐘,然后洗滌。在少數(shù)情況下,與5μg/ml與生物素相結(jié)合的山羊抗抗生物素蛋白D抗體(Vector Laboratories)在37℃下保溫30分鐘,然后洗滌,再與5μg/ml與FITC結(jié)合的抗生物素蛋白進(jìn)行二次培養(yǎng)(37℃,30分鐘),并最后沖洗,從而將FITC信號放大。Pinkel,D.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA832934-2938,1986。為了檢測酶活性,試樣需用2.5μg/ml鏈球菌抗生物素蛋白培養(yǎng)、沖洗,用2μg/ml與生物素結(jié)合的堿性磷酸酶(Vector Laboratories)培養(yǎng),再次沖洗,并在室溫下預(yù)先平衡于Ap緩沖液9.5(100mM Tris-HCl pH9.5,100mM NaCl,50mM MgCl2)中達(dá)2×5分鐘。酶反應(yīng)在含有330μg/ml氮藍(lán)四唑(NBT)和165μg/ml5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽(BCIP)的Ap緩沖液9.5中,在37℃下進(jìn)行0.5~1小時,并通過在2×SSC中保溫而終止。對所有制備物在室溫下用200ng/ml4,6-二咪基-2-苯吲哚二氫氯化物(DAPI),2×SSC復(fù)染色5分鐘,并將它們置于20mM Tris-HCl pH8.0,90%含有2.3%DAPCO抗衰素、1,4-二氮雙環(huán)-2(2,2,2)辛烷的甘油中。Johnson,G.D.等人,J.Immunol.Methods 55231-242,1982。
      光密度測定如Manuelidis,L.和J.Borden在Chromosoma96397-410(1988)中所述,采用一個制圖工作臺(VAXStationⅡ/GPX,DigitalEquipmentCorporation),該工作臺帶有一個抓手架(ITEXFG-101,ImagingTechnology)和一架帶有ZeissS-Planar60mm鏡頭的Dage-MTI-65電視攝象機(jī),直接由底片上的數(shù)據(jù)制圖,并將圖貯存在磁盤上。去掉背景,確定每個染色體周圍的多角區(qū)域,用臨界密度值劃出在所確定的多角區(qū)內(nèi)的染色體區(qū)域輪廓。在這些劃出的染色體區(qū)域R內(nèi)的平均密度值由總信號∫I(X,Y)dR/面積R確定,其中∫I(X,Y)是區(qū)域R內(nèi)任一點(diǎn)的函數(shù)密度(0-225),從該平均區(qū)域密度中去掉臨界背景密度,上述兩種密度分別是標(biāo)記的染色體7的和背景染色體的。信噪比由平均染色體7信號/平均背景染色體信號計算出。
      下面描述的是上述研究的結(jié)果,它清楚地證實(shí)了對所示的個體染色體的特異標(biāo)記。第一部分描述了用生物素標(biāo)記的染色體文庫插段的用途,第二部分描述了DNA插入片段的用途。
      圖2顯示了如下所述用不同的濃度對染色體7產(chǎn)生的DNA文庫中的交叉反應(yīng)順序的信號進(jìn)行抑制。
      圖2A表示染色體7文庫插段的情況,該插段用生物素標(biāo)記并與正常人淋巴細(xì)胞(無人競爭DNA)的中期擴(kuò)展雜交,可以看到兩個7染色體被優(yōu)先標(biāo)記;此外,在大多數(shù)其他染色體上可以看到不同的雜交帶狀圖,而且兩個E組染色體被特別明亮的染色。該總?cè)旧w譜帶圖類似R譜帶,它提示背景交叉雜交信號的主要部分來源于Alu重復(fù)順序。以前的研究顯示,該Alu順序確定了R譜帶圖,而Giemsa陽性譜帶輪廓由KpnI散開的重復(fù)部分照亮。Manuelidis,L.和C.D.Ward,Chromosoma9128-38,1984。
      建立除去重復(fù)組分雜交信號的實(shí)驗(yàn)過程采用一些先行的研究結(jié)果來建立實(shí)驗(yàn)參數(shù)以去除來自這類重復(fù)組分的雜交信號。核苷酸在溶液中進(jìn)行重組的動力學(xué)取決于核苷酸的總濃度(Co,大約每升幾摩爾核苷酸)以及復(fù)活時間(t,幾秒)。當(dāng)組合條件如溫度(考慮到甲酰胺濃度)、陽離子濃度、緩沖系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化以后,重組動力學(xué)就可以用Cot值來比較。在一定條件下,含有高度重復(fù)DNA的哺乳動物基因組中的快速重組部分在Cot值為1×10-1~5×10-1之間完全重退火,而含有中等重復(fù)性DNA的中間部分則在Cot值為1×102時復(fù)活。Britter,R.J.和D.E.Kohne,Science 161529-540,1968。因此,在人DNA濃度為1.0mg/ml(對應(yīng)于3×103摩爾核苷酸/升)時,快速部分約在10秒內(nèi)復(fù)活。而中等重復(fù)性DNA則需要9小時以上的時間才能達(dá)到完全的重退火。由于重組DNA的快速部分中含有大多數(shù)或全部的、會引起交叉雜交信號的普遍存在的重復(fù)性DNA,因此使用的DNA總濃度應(yīng)為1.0mg/ml,而且在加到樣品中之前,可使探針混合物部分重退火。最佳復(fù)活時間憑經(jīng)驗(yàn)確定(參見下面)。這一點(diǎn)是非常重要的,因?yàn)樵浑s交條件是由確定重組動力學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)條件導(dǎo)出的(例如,在37℃下,在50%甲酰胺中雜交則對應(yīng)于0%甲酰胺,70℃,硫酸葡聚糖還可顯著增加重組時間)。此外,尚不清楚,中等重復(fù)性DNA能提供非特異性信號到何種程度,因此應(yīng)當(dāng)通過預(yù)退火過程防止雜交。
      重退火和原位雜交試驗(yàn)的嚴(yán)格性是在37℃下,50%甲酰胺(據(jù)標(biāo)準(zhǔn)原位雜交工藝)及1×SSC(此0.165M的陽離子濃度接近Britten和Kohne進(jìn)行動力學(xué)研究所用的濃度,Britten,R.J.和D.E.Kohne,Science161529-540,1968)中確定的。在重組過程中加入人競爭DNA,從而得到合乎要求的DNA高濃度,并使需預(yù)退火的DNA順序保持較高的重復(fù)量。當(dāng)人總基因組DNA代表所有的、要由預(yù)退火除去的高重復(fù)性DNA時,則它還應(yīng)含有靶染色體順序。因此,加入過量的人DNA有可能減小染色體特異信號。故要首先確定用作競爭DNA的人總DNA的最佳濃度。為了保持總DNA濃度在110mg/ml不變,需按需要加入鮭魚基因組DNA。鮭魚DNA含有一定的重復(fù)性DNA成分,如與人DNA類似的多dCdA,但它缺少其他成分,即最有代表性的Alu和KpnI重復(fù)。Hamada,H.等人,Proc.Natl.Acad.Sci,USA796465-6469,1982。這會使后一種順序隨著鮭魚DNA在重組反應(yīng)中數(shù)量增加而頻率降低。
      圖2表示了典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,這些結(jié)果是用20μg/ml染色體7探針套與50μg/ml(B),100μg/ml(C),200μg/ml(D)或1000μg/ml(E)經(jīng)DNA酶消化的人基因組DNA(已被預(yù)退火20分鐘)一起變性獲得的。如前所述,用抗生物素FITC進(jìn)行雜交和檢測。對每一種制劑,在標(biāo)準(zhǔn)的光譜條件下攝取10張黑白相片以供光密度研究用(參見下面)。當(dāng)沒有人基因組競爭DNA(A)存在時,信號幾乎不顯示染色體特異性。但采用50和100μg/ml人競爭DNA后,標(biāo)記特異性增加相當(dāng)明顯(圖2B、C)。用100和200μg/ml人競爭DNA可以獲得帶有一個信號密度峰的染色體7的特異性染色(圖2C、D)。人DNA濃度較高時,就會使信號密度明顯降低。特別是在人DNA濃度為1000μg/ml時(圖2E)。但在該條件下得到的信號仍然相當(dāng)明亮,但這時需要暴露在不同的最佳光照下(未示出)。
      也可用計算機(jī)輔助法進(jìn)行光密度定量分析(參見上面),從而建立完整的標(biāo)記特異性。熒光信號(來自所述的靶染色體)與背景熒光噪聲(由非靶染色體放出)的比例由DNA滴定實(shí)驗(yàn)的多光學(xué)底片的數(shù)字圖象(如圖2中所示)確定。由每一種人競爭DNA濃度獲得的信噪比示于表1中。
      表1人競爭DNA濃度對交叉雜交信號的抑制的密度分析DNA濃度(μg/ml)信噪比人競爭DNA 信號噪聲可信間距C濃度 Pixalaη Pixelaη (99%)071.48854.66261.31±0.045074.50837.43281.99±0.07100162.64820.06238.11±0.35200147.35820.53267.18±0.3750089.78818.63214.82±0.28100094.37830.51173.09±0.12a.靶染色體Pixel強(qiáng)度的平均值。
      b.非靶染色體Pixel強(qiáng)度的平均值(取自同樣的中期擴(kuò)展)。
      c.用Fieller氏原理計算可信間距(Finney,D.J.,StatisticalmethodsinbiologicalaSSay,2ndedn.,HafnerPress,NY1971)。
      η由其測定平均值的染色體數(shù)。
      抑制非特異信號的最佳退火條件(采用20μg/ml的染色體7探針和100-200μg/ml的人基因組DNA),產(chǎn)生的信噪比大約為8∶1。通過增加雜交嚴(yán)格度(如60%甲酰胺或0.2×SSC)以改善信噪比的償試未能取得明顯效果,而故使信號密度全部降低。
      由于大約100-200μg/ml的人競爭DNA具有最佳特異性,所以采用200μg/ml用于信號特異性與復(fù)性時間的其他分析(參見上文)。如前文所述,預(yù)退火0,2,5,10,20,40和50分鐘后,將等分試樣用于原位雜交試驗(yàn)。正如圖3所表示的,對于所有預(yù)退火時間都得到了特異性標(biāo)記。將復(fù)性時間由零增加到20分鐘,信號有微小的改善。將復(fù)性時間增加到高達(dá)60分鐘,對信號強(qiáng)度或染色體特異性沒有顯著改善(未出示)。用上述的密度測定分析不能確定預(yù)退火20分鐘的信號改善的主觀印象(圖3D),這是因?yàn)槟苡^察到的不同預(yù)退火時間內(nèi)的信噪比沒有明顯差異(數(shù)據(jù)未示出)。因而,在所有的后期試驗(yàn)中,標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)性時間為10-20分鐘。由于復(fù)性時間為0時信號是清晰可見的,所以將探針混合物移到顯微鏡載片上的幾秒鐘,似乎就足以有效地通過交叉雜交使引起非特異性標(biāo)記的多個順序預(yù)退火。而且在雜交反應(yīng)期間,大量過剩的單鏈競爭DNA可有效地和生物素化的探針順序競爭普遍存在的染色體靶部位。這些結(jié)果表明,能夠有效地抑制大部分高度重復(fù)的DNA順序,以通過原位雜交達(dá)到對染色體的特異標(biāo)記。
      在不同的實(shí)驗(yàn)中,在一定情況下整個染色體上的信號分布有些改變。當(dāng)所有信號被降低時,某些染色體亞區(qū)顯示更明亮的染色;這些信號熱點(diǎn)通常構(gòu)成了含有已知染色體特異性重復(fù)順序的染色體部位。在圖2和圖3所示的實(shí)驗(yàn)中,可以看到染色體7的中心著絲區(qū)域的優(yōu)先染色,該染色對應(yīng)于白斑樣重復(fù)DNA的染色體特異性信號。參見Waye,J.S.等人,Mol.CellBiol.7349-356,1987和實(shí)例2。顯然,在此處使用的條件下,為了防止重復(fù)順序的抑制,這些重復(fù)順序的豐度是足夠低的。用上述的抗體夾層技術(shù)放大全部信號,可以克服信號的不均勻分布。而且,在標(biāo)記的染色體1中,可以常常觀察到相應(yīng)于衛(wèi)星DNA的染色體部位的1q12區(qū)域的優(yōu)先染色。參見Cooke,H.J.和J.Hindley,NucleicAcidsRes.63177-3197,1979和Gosden,J.R.等人,Cytogenet.CellGenet.2932-39,1981和實(shí)例2。經(jīng)過這種放大步驟得到的均衡的信號分布示于圖4A中。
      在上述的標(biāo)準(zhǔn)退火條件下,并如上述根據(jù)染色體大小調(diào)節(jié)探針濃度,對幾種市售的DNA文庫(每種DNA文庫代表一種人染色體)進(jìn)行檢驗(yàn),測定它們對所代表的染色體進(jìn)行特異標(biāo)記的能力。某些試樣(如圖4所示的染色體1、4、7、13、18和20)清楚地表明,用大多數(shù)的染色體文庫可以實(shí)現(xiàn)特異標(biāo)記。表2列出了所測試的文庫及其標(biāo)記特異性的相對值。所有值都是正的,這是因?yàn)楦信d趣的染色體總是被染色。當(dāng)觀察到與其他染色體的交叉雜交不顯著時就用最高值(4+),而交叉雜交順序的量增加時則降低該值(3+到1+)。
      表2使用預(yù)退火的生物素化的文庫DNA插段原位標(biāo)記的特異染色體的相對量染色體所用文庫原位雜交信號的(ATCC命名) 相對特異性a1LAO1NSO13+4LLO4NSO14+7LAO7NSO14+8LLO8NSO24+13LA13NSO31+14LL14NSO12+18LL18NSO14+20LL20NSO14+21LL21NSO23+22 LA22NSO3 3+bXLAOXNLO14+a.參見正文對值的定義b.在標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)退火條件下,染色體22文庫的值為+1,只有當(dāng)人競爭DNA濃度≥700μg/ml(總DNA濃度為1.0mg/ml)時得到的值為+3。
      通過改變實(shí)驗(yàn)條件(用染色體22的實(shí)驗(yàn)除外)以降低其他染色體的附加信號的所有努力都失效了;在這種情況下,較高濃度的人競爭DNA(700μg/ml)使得信號的特異性有了顯著改善。染色特異性最低的文庫是染色體13的文庫(圖4E)。我們觀察到在其他染色體上有多個次要的結(jié)合部位以及非常明亮染色的Yq12;使用女性或男性人DNA作為競爭源時,可以看見Y染色體上的信號。所測的實(shí)驗(yàn)參數(shù)中沒有一個參數(shù)對文庫的總特異性有所改進(jìn)。
      值得注意的是,在某些染色體(參見染色體4和8,圖4C、D)的中心著絲粒區(qū)域只觀察到弱的信號,甚至觀察不到信號。與染色體1和7(該染色體包括染色體特異性的重復(fù)元素)相反,染色體4和18的中心著絲粒區(qū)域明顯包括重復(fù)順序(很可能是白斑樣衛(wèi)星DNA),這些重復(fù)順序的量很大,因而可以用退火技術(shù)抑制。然而,這些染色體的區(qū)域非常小,只有將相應(yīng)的染色體相當(dāng)延長時才能觀察到效果。
      生物素化的總文庫DNA(包括噬菌體載體順序)也被作為探針,其濃度調(diào)節(jié)到人DNA插段(參見上文)。圖4F為用染色體20文庫所示的一個實(shí)例。盡管通??梢詫?shí)現(xiàn)感興趣的染色體較好的染色,但是整個載片上顯著的非特異性本底是個共同問題。使用含有來自λ噬菌體文庫的人DNA亞克隆的質(zhì)粒文庫得到了類似結(jié)果。與此相反,總的染色體文庫LAOXNLO1不存在本底問題,這是因?yàn)槿薉NA插段非常大,而在探針混合物中該文庫所含有的載體順序比例非常小。
      通過這種退火技術(shù)進(jìn)行重復(fù)順序的抑制,使得能夠使用流式分類的染色體文庫檢測間期核內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)域。對醋酸-甲醇固定后的正常人淋巴細(xì)胞與染色體1、染色體7和染色體18探針套的雜交得到的典型實(shí)例的結(jié)果示于圖5中。用所有的文庫都觀察到雜交信號的不連續(xù)的焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)域,其值為2+或2+以上(參見表2)。
      大多數(shù)的核(每次測定n≥100)有兩個結(jié)構(gòu)域(60-70%);而有顯著的數(shù)量表明只有單個結(jié)構(gòu)域(20-30%),或者完全沒有信號(5-10%)。因此,將X染色體文庫DNA作為探針時,大約95%的男性核有雜交信號,而大約5%的男性核沒有雜交信號。值得注意的是,用任何一個染色體探針套測試沒有發(fā)現(xiàn)具有3個結(jié)構(gòu)域的核。相反,所有的中期擴(kuò)展都無一例外地表明了兩個同源染色體的染色。這種間期變化可能部分地反映某些細(xì)胞內(nèi)兩個結(jié)構(gòu)域的緊密并列,或反映出使用二維成象法(參見圖5D,有關(guān)討論參見Cremer等人,Exp.CellRes.176199-220,1988)檢驗(yàn)時沒有分辨出,但卻實(shí)際上占有核內(nèi)不同區(qū)域的結(jié)構(gòu)域。少量的核沒有雜交信號,可能反映了雜交條件不太好。值得注意的是,核內(nèi)結(jié)構(gòu)域的大小與同源中期染色體的相對大小很相關(guān)。這些觀察提供了一個明確的證據(jù),就是個體染色體DNA在正常的人細(xì)胞間期核中有清晰的區(qū)域組織。
      醋酸-甲醇固定的核擴(kuò)展(如圖5所示)明顯保留了每個被檢驗(yàn)的染色體的區(qū)域組織;但是沒有最好地保存核的結(jié)構(gòu)。我們用具有保存較好的三維結(jié)構(gòu)的試樣進(jìn)行了進(jìn)一步研究,此研究是用多聚甲醛固定的人雙倍體成纖維細(xì)胞和用于三維成象再現(xiàn)的激光掃描共焦點(diǎn)熒光顯微鏡機(jī)組進(jìn)行的。如Manuelidis所述將細(xì)胞固定并使之滲透,并如上述用染色體文庫探針雜交。Manuelidis,L.,Ann.NYAcad.Sci.450205-221,1985。將探針競爭DNA混合物直接放到載片上,并用與細(xì)胞DNA相同的時間使之變性。結(jié)果表明了核內(nèi)染色體7結(jié)構(gòu)域的排列,并經(jīng)常能觀察到染色體結(jié)構(gòu)域內(nèi)標(biāo)記的染色體螺旋結(jié)構(gòu)。目前正在觀察,這種螺旋性反映真實(shí)結(jié)構(gòu)域亞結(jié)構(gòu)的程度或者還是僅僅反映了制備和固定過程的偽跡。盡管如此,這種初步的觀察確立了用染色體特異探針分析間期細(xì)胞內(nèi)染色體結(jié)構(gòu)域拓?fù)鋱D象的可行性。
      實(shí)例2用染色體特異性文庫探針通過CISS雜交檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)染色體的畸變細(xì)胞TC593是由人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤建立的假四倍體細(xì)胞系(模型染色體數(shù),83);TC593以平板擴(kuò)散的形式生長,并且包括許多過程。TC620是具有64個模型染色體數(shù)的假三倍體細(xì)胞系,是由人少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤建立的。TC620以上皮狀生長。對兩種細(xì)胞系都已有詳細(xì)介紹。Manuelidis,L.和E.E.Manuelidis,InProgressinNeuropathology,Vol4,235-266,RavenPress,NY,1979。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)使用亞克隆C2B(TC593)和C2B(TC620),它們是通過Manuelidis和Manuelidis(參見上文)以前描述的方法,對原初腫瘤細(xì)胞系的單細(xì)胞重復(fù)亞克隆約180代后產(chǎn)生的。采用了標(biāo)準(zhǔn)的低滲透處理和酸/甲醇固定細(xì)胞。Cremer等,Exp.CellRes.176199-220,1988。
      DNA探針和文庫由美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到來自分選的人染色體的噬菌體DNA文庫LAO1NSO1(染色體1),LLO4NSO1(染色體4),LAO7NSO1(染色體7),LL18NSO1(染色體18)和LA22NSO3(染色體22)。如實(shí)例1所描述的方法,將這些文庫擴(kuò)增,分離人DNA插段并使之生物素化。用于染色體7(Pa7t1)上白斑樣重復(fù)的特異探針是由H.Willard贈送的,并且在高度嚴(yán)格的條件(60%甲酰胺)下,將探針特異染色染色體7的亞中心著絲粒的異染色質(zhì)。Waye等,Mol.CellBiol.7349-356,1987;Cremer等人,Exp.CellRes.176199-220,1988。某些DNA探針是用氨乙酰芴(AAF)修飾的;并且用Cremer等人所述的雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測。Landegent等人,Exp.CellRes.15361-72,1984;CremerR.等人,Exp.CellRes.176199-220,1988。原位雜交和雜交探針的檢測在實(shí)例1所述的標(biāo)準(zhǔn)條件下,用生物素化的文庫DNA插段進(jìn)行CISS雜交及檢測雜交分子。在用生物素化的染色體7文庫DNA插段和AAF修飾的7白斑樣探針的雙CISS雜交中,將后一個探針單獨(dú)加熱變性,并僅僅在退火步驟結(jié)束時以10μg/ml的最終濃度將其加到雜交混合物中(參見實(shí)例1)。
      中期和間期染色體特異染色的數(shù)字圖象分析如上文所述,采用一個制圖工作臺(VAXStationⅡ/GPX,DigitalEquipmentCorporation),它帶有一個抓手架(ITEXFG100-Q,ImagingTechnology)和一架帶有ZeissS-Planar60mm鏡頭的Dage-MTI65電視攝象機(jī)。Manuelidis,L.和J.Borden,Chromosoma96397-410,1988。使中期擴(kuò)展和間期核底片的圖象數(shù)字化,將本底除去并將多角形區(qū)域限定到特異染色的中期染色體或間期結(jié)構(gòu)域(參見實(shí)例1)。用掃描線算法計算多角形區(qū)域內(nèi)的直方圖。由于限定區(qū)域內(nèi)特定強(qiáng)度(范圍為0-255)的直方圖H(i)的值為強(qiáng)度i處的Pixel的數(shù)目,落入強(qiáng)度范圍i0-i1區(qū)域內(nèi)的面積是i0-i1直方圖的微積分。同樣地,為了大概描述染色的染色質(zhì),從本底區(qū)域中區(qū)別出這個面積,對每個雜交選擇由強(qiáng)度范圍i0-i1等于∑H(i)·i·i。所限定的區(qū)域中的二維微積分。為了記錄上限以上的整個強(qiáng)度范圍,定義i1最大值為255。
      測定總信號強(qiáng)度與面積,是為了控制間期核內(nèi)可能存在的可變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)域的伸展。在間期核中,也許可見到更為伸展的染色體結(jié)構(gòu)域,并具有更大的面積(或體積),但每單位面積的熒光信號強(qiáng)度卻更低。如果恒定量的雜交DNA相應(yīng)于恒定量的總熒光,那么總信號強(qiáng)度則為標(biāo)記DNA含量的一個量度。也能測定核內(nèi)三維雜交體積和三維微積分的總雜交信號。Manuelidis,L.和J.Borden,Chromosoma96397-410,1988。從標(biāo)記的區(qū)域R內(nèi)不連續(xù)的二維積分∫∫I(X、Y)dA中減去本底b,即得到總的信號Sigt=∫∫I(x、y)dA-b∫∫dA,其中dA為單個pixel。同樣地,用二維積分/面積或∫∫I(x、y)dA/∫∫dA計算該區(qū)域內(nèi)的平均強(qiáng)度。
      下面是根據(jù)適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù),對以上工作的結(jié)果進(jìn)行了描述。這些結(jié)果清楚地表明,人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系內(nèi)結(jié)構(gòu)和量的變化,這些變化包括失去和獲得的整個個體染色體和染色體亞區(qū)。這些結(jié)果還表明,能夠在每個細(xì)胞系中分析次要和主要的核型特征。至今測試的所有染色體(即1,4,7,18和22)很清楚地表現(xiàn)出數(shù)目和/或結(jié)構(gòu)的畸變,其中的某些畸變是細(xì)微的。
      對中期擴(kuò)展中的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變進(jìn)行了檢測。
      圖6-8和12出示了用人染色體1,4,7,18和22每一種生物化的DNA插段進(jìn)行CISS雜交后,惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TC620和593具有典型的中期擴(kuò)展。用抗生物素蛋白熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合物(FITC)檢測染交的插段,并且用4,6-二氨基-2-苯氮二氫氯化物(DAPI)復(fù)雜細(xì)胞。將具有表觀正常的大小、中心著絲粒指數(shù)和DAPI染色圖的染色體規(guī)定為“完整的”。盡管作了這樣的規(guī)定,這些完整染色體可包括只有通過附加的研究(見下文)才能檢測的微小結(jié)構(gòu)畸變。在TC620和TC593中都明顯地觀察到了完整的染色體1,4,7,18和22。另外,這些染色體的其他同源物表現(xiàn)出顯著的重排和紊亂,包括易位和缺失。這些細(xì)胞系中的每一個細(xì)胞所表現(xiàn)的數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變?nèi)缦挛乃?。對每個神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和每個染色體進(jìn)行測定,對于良好的中期擴(kuò)展來說測定數(shù)最少為25。圖9總結(jié)了這些數(shù)據(jù)。
      染色體1在TC620(少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤系)中,染色體1插段染色兩個表觀完整的1染色體和兩個標(biāo)記易位染色體(圖6A,6B,9)。一個標(biāo)記是偏中心的而且包括完全染色的1q臂,但它的p臂取自另一個染色體(一個未知的源)。另一標(biāo)記染色體是近偏心的,并且顯示一個附著到1p臂上的另一個染色體的小片段。在兩個標(biāo)記染色體中,析點(diǎn)定位于接近1p11或1q11的中心著絲粒處。用DAPI譜帶法(圖6B)、5′-溴-2′-脫氧尿核苷(BrdU)譜帶法和與1p36.3探針的雜交(數(shù)據(jù)未示出)進(jìn)行1p片段的鑒別;該1p36.3探針還顯示出表觀完整的1染色體中此亞區(qū)的缺失。全部圖象表示染色體1是接近三體的,具有共同的折點(diǎn)以及后續(xù)的易位。
      在TC593(成膠質(zhì)瘤系)中,還觀察到了更為復(fù)雜模式的染色體1數(shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變。在試樣為50的中期擴(kuò)展中,大多數(shù)(52%)的中期擴(kuò)展顯示出被染色的六個畸變?nèi)旧w;14%的中期顯示出五個畸變的染色體,34%顯示出較高數(shù)目的染色體1片段(高達(dá)14)。圖6C、D和9出示了最典型、最主要的核型,并表明可以很快地確定這個細(xì)胞系中異常的染色體1?;儼ㄈ齻€具有一致的1p1中的折點(diǎn)的近端著絲粒染色體、缺失1q遠(yuǎn)側(cè)部分的染色體、喪失完全1q的亞中心著絲粒易位染色體,以及異構(gòu)(1p)標(biāo)記染色體(參見圖9)。
      染色體4在TC620中,染色體特異性插段染色了一個表觀完整的染色體4,和三個帶有包括染色體4DNA片段的附加染色體(參見圖7F、9)。僅僅采用譜帶法是難以快速而清楚地限定易位染色體上的這些片段的。最小的易位染色體4片段形成了部分中心著絲粒染色體。在總大小不同的亞中心著絲粒染色體上發(fā)現(xiàn)了兩個較大的片段。在較小的染色體中,短臂和4的長臂部分在4q2(即4pter-4q2)處有明顯的折點(diǎn)。在較大的亞中心著絲粒染色體中,呈現(xiàn)出代表4的其余部分(4q2-qter)的區(qū)域。因此,TC620的優(yōu)先核型只比兩個當(dāng)量的染色體4稍多一些。(也可參見下文所述的面積測定)。非4區(qū)域還沒有作進(jìn)一步限定。
      在TC593中,通常只有兩個經(jīng)染色體4DNA插段染色的染色體,這兩個染色體與正常的4染色體相容。在TC593中,大約30%的中期擴(kuò)展顯示出帶有染色體4物質(zhì)的附加亞中心著絲粒染色體(參見圖7E)。因此,盡管兩個染色體4都是表觀正常的,但在這個假四倍體系中這個染色體是明顯不足的。
      染色體7在TC620中期擴(kuò)展中(圖8A,9)通常發(fā)現(xiàn)三個完整的7染色體,和一個包括易位的7物質(zhì)的較小的中心著絲粒染色體。易位的染色體7物質(zhì)包括染色體7的短臂(通過DAPI譜帶所示,參見圖8B)和在7q1中具有折點(diǎn)的近中心著絲粒異染色質(zhì)(參見下文)。
      在TC593中,有規(guī)律地觀察到經(jīng)染色體7插段探針完全染色的五個染色體(圖7G,8E)。其中4個似乎是完全數(shù)目的7染色體,而另一個是較小的和中心著絲粒的。DAPI譜帶法(圖8E,插入)和大小測量(
      圖13)與異構(gòu)(7p)一致。這個結(jié)論通過用生物素化的染色體7插段(用抗生物素蛋白FITC檢測)和染色體7特異的白斑樣AAF標(biāo)記的順序(由四甲基若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)結(jié)合的第二抗體檢測)的雙原位雜交實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步的證實(shí)。這些實(shí)驗(yàn)表明,只有四個完整的7染色體含有可檢測的7中心著絲粒信號(中期如圖7G,H;間期如圖7I,J)。因此,該異構(gòu)(7p)標(biāo)記染色體沒有具特征性的中心著絲粒區(qū)域,這是由于該染色體缺少了白斑樣順序和7q11處小塊異染色質(zhì)(參見圖8E,插入)。相反,用7白斑樣探針標(biāo)記了TC620的所有4個7染色體(數(shù)據(jù)未示出)。
      染色體18
      在TC620中,兩個表觀完整的18染色體和截斷的小染色體被完全染色(圖8C、D、9)。這個截斷的染色體是18q-(也可能是18p-)。我們從未檢測到染色體18的其他區(qū)域。
      在TC593中期擴(kuò)展中,通常檢測到3個涉及染色體18的易位染色體和表觀正常的染色體18(圖8F、G,9)。另外還觀察到小部分的中期中有小的易位。通過DAPI染色不能精確分辨出由此易位的18物質(zhì)產(chǎn)生的染色體區(qū)域。因此,在此細(xì)胞系中,18的主要核型是接近四倍體的,而在假三倍體TC620中該核型是不足的。
      將TC620中的18q標(biāo)記的染色體和TC593中的3個易位18染色體都牢固地與染色體18特異性的白斑樣重復(fù)順序雜交。于是,用這個中心著絲粒探針進(jìn)行原位雜交后,也能計算出完整的和畸形的18染色體數(shù)。Cremer,T.等人,Exp.CellRes.176199-200,1988(見下文)。DAPI譜帶法和與18特異性的白斑樣重復(fù)的雜交表明,這些易位染色體包括整個18q區(qū)域和在18p中具有折點(diǎn)的中心著絲粒。
      染色體22在大多數(shù)TC620和TC593中期擴(kuò)展中(
      圖10E)觀察到兩種表觀正常的22染色體。由于用染色體22插段進(jìn)行雜交導(dǎo)致了對其他染色體的某些交叉雜交,所以難以確定這個染色體的小型易位。某些交叉雜交可能是由于核組織者區(qū)域共用順序(在5個正常的近端著絲粒人染色體上)和中心著絲粒處的共用序列所致。McDermid,H.E.等人,Chromosoma94228-234,1986且參見實(shí)例1。最后,值得注意的是與傳統(tǒng)的譜帶分析相反,當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)研究清楚描述了在極小量的中期擴(kuò)展(
      圖10G,H)中或較早的前期核(
      圖10A)中數(shù)目和結(jié)構(gòu)的染色體畸變。由于染色體彼此之間較大的重迭,這些制備物對于譜帶分析而言是不容易達(dá)到的。
      測定間期核中染色體結(jié)構(gòu)域原位法的一個顯著優(yōu)點(diǎn)是可以直接觀察個體人染色體,即看到間期核內(nèi)獨(dú)立的區(qū)域,因此這種方法對分析固態(tài)腫瘤試樣是有價值的。Manuelidis,L.,Hum.Genet.71288-293,1985;Schardin,M.等人,HumGenet.71281-287,1985;Pinkel,D.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA832934-2938,1986.這個核拓?fù)鋱D象的特性同樣存在于(圖7A-D,I,10B-F)本文所檢驗(yàn)的惡性細(xì)胞中,以此用它來確定其精確度和用于診斷的可行性。
      圖10A表明在前期TC620核中有三個表觀完整的7染色體和一個易位的7p臂。正如在中期擴(kuò)展中所述的,圖3和
      圖10B表明了TC593的間期核中有5個染色體7結(jié)構(gòu)域。
      圖10C出示了大小可與正常的二倍體核中所見相比較的具有兩個18結(jié)構(gòu)域的TC620間期核(參見實(shí)例1)。相當(dāng)小的第三個染色的18結(jié)構(gòu)域也能檢測到,并且代表如上所述的中期擴(kuò)展中截斷的18染色體。
      圖10D出示TC593的間期核中4個染色體18結(jié)構(gòu)域,它也可與中期核中的數(shù)目相比較。
      圖10E出示了具有4個染色體1結(jié)構(gòu)域的TC620間期核,而
      圖10F出示了至少具有5個獨(dú)立的染色體1結(jié)構(gòu)域(分別與圖6A,B和C,D比較)的TC593核。
      雖然
      圖10中所示的核的雜交圖對每個細(xì)胞系有突出的特征,但計數(shù)間期染色體結(jié)構(gòu)域具有一些固有的困難。如圖所示,
      圖11A(黑柱)顯示了對隨機(jī)選擇的與7文庫插段雜交的二倍體人淋巴細(xì)胞核中的標(biāo)記的間期結(jié)構(gòu)域的計數(shù)分析。盡管在大部分核中可以精確地確定染色體特異性結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和相對大小,但不是所有核都能產(chǎn)生染色體組成的可靠指數(shù),因?yàn)榇蟛糠趾酥挥幸粋€被染色的結(jié)構(gòu)域,有時則顯示不出信號。而且,在這些二維制備物中,并不是所有的結(jié)構(gòu)域總是清晰可分的。
      圖11出示了這些制備物的代表性計數(shù)。與染色體4的TC593中期計數(shù)一致,核計數(shù)常常顯示出兩個清晰獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(
      圖11E)。但是,間期所得到的雙信號制劑的百分率比中期低(45.3%比64%)。這種人為降低主要是因?yàn)橄鄳?yīng)地增加了只有一個染色結(jié)構(gòu)域或完全沒有信號的核的百分率。在中期擴(kuò)展中不存在0或一個結(jié)構(gòu)域的計數(shù)。19.3%的間期TC593核顯著地表現(xiàn)出三個清晰獨(dú)立的染色體4結(jié)構(gòu)域,而在同樣條件下(
      圖10A,實(shí)例1),在雜交到這個或其他文庫上的二倍體人淋巴細(xì)胞間期核中沒有額外的結(jié)構(gòu)域。最后,中期細(xì)胞和間期細(xì)胞中,兩個與三個結(jié)構(gòu)域的比值是相同的。因此,間期核能可靠地用于檢測多余拷貝的單染色體或染色體片段,但檢測染色體拷貝的喪失的可靠性卻有限。
      用取自間期染色體亞區(qū)的探針進(jìn)行原位雜交比用文庫探針更能準(zhǔn)確地反映染色體組成的一般計數(shù)(
      圖11A),前提是它們是在高度嚴(yán)格的條件下進(jìn)行的。Rappold,G.等人,Hum.Genet.67317-325,1984;Cremer,T.等,Hum.Genet.74346-352,1986;Cremer,T.等,Exp.CellRes.176199-220,1988。但是,這種區(qū)域性片段探針不能確定缺乏此片段的易位元素或畸變?nèi)旧w。因此,這類探針也不是很精確的。例如,用1q12特異性探針在TC620和TC593中檢測的染色體1的計數(shù)比用本文所示的CISS雜交的1染色體計數(shù)少(圖9)。Cremer,T.等,Exp.CellRes.176199-220,1588。僅用中心著絲粒順序的染色體7的計數(shù)進(jìn)一步突出了這一點(diǎn)(見上文)。用AAF修飾的7白斑樣探針和生物素化的染色體7文庫插段進(jìn)行雙原位雜交通常表明間期核有5個結(jié)構(gòu)域,其中只有4個是由中心著絲粒探針同時標(biāo)記的(圖7I,J,11C)。但在TC620中,兩個探針都得到了同樣的結(jié)果(
      圖11B)。
      過分和不足的特異染色體測定這些神經(jīng)膠質(zhì)瘤系中的相對染色體劑量特別感興趣的是測定染色體7,它通常在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中是過分的。Bigner,S.H.等,CancerGenet.Cytogenet.29165-170,1986;Shapiro,J.R.,Semin.Oncol.134-15,1986。為了進(jìn)行比較,將其他個體染色體探針作為對照。中期染色體計數(shù)表明TC620是具有64個染色體模數(shù)的假三倍體,而TC593是具有83個模數(shù)的假四倍體。Manuelidis,L.和Manuelidis,E.E.,InProgressinNeuropathology,Vol4,235-266,RavenPress.NY,1979。因此,如果在TC620中有3個完整拷貝,而TC593中有4個,那么在平衡狀態(tài)下將有染色體和染色體片段同時存在。如果能夠表明多于這些相關(guān)的拷貝數(shù)目,那么所表現(xiàn)的染色體是相對過分的。如果數(shù)目比所期望的(三體或四體)值低,則表明核型中染色體是不足的。當(dāng)附加的DAPI譜帶法信息足以限定選擇性染色的異常染色體時,將經(jīng)過染色體特異性插段標(biāo)記的染色體一起進(jìn)行分析(圖9)。在第二個方案中,用計算機(jī)分析單獨(dú)鑒定這些結(jié)果(見下文)。
      經(jīng)譜帶分析的TC620出示了3個等效的1染色體,因此表明這個染色體是平衡態(tài)的。對于有四個拷貝的TC593中的1p臂同樣是正確的。但是,TC593中,遠(yuǎn)側(cè)的1q部分是表現(xiàn)不足的(詳見以上描述)。在兩種神經(jīng)膠質(zhì)瘤系中,7q似乎呈現(xiàn)出平衡態(tài),而7p一次在TC620中,兩次在TC593中表現(xiàn)出是過分的。另外,在兩個神經(jīng)膠質(zhì)瘤系中,染色體22明顯表現(xiàn)不足。為了證實(shí)這個發(fā)現(xiàn),進(jìn)行與染色體7和22插段的原位雜交。這個例子示于
      圖12中,表明在相同的細(xì)胞中,7DNA是過分的,而22DNA是不足的。在兩個細(xì)胞系中,用這個分析法對染色體7所得的中期計數(shù)示于
      圖11B,C(黑柱),對染色體22所得的中期計數(shù)示于
      圖11E。總之,這兩個神經(jīng)膠質(zhì)瘤都表明染色體22是不足的而7p臂是過分的。在TC593中染色體4是顯著不足的,TC620中的部分染色體4也是顯著不足的。
      數(shù)字成象也用于定量測定中期制備物和染色體結(jié)構(gòu)域可良好分辨的間期細(xì)胞中的染色面積。定量測定染色體的當(dāng)量(表3)表明,6個試樣中有5個間期與中期數(shù)目高度一致;只是在TC593中用18插段染色時有所不同。這可能是由于試樣太少的緣故。
      表3將顯示用染色體4、7和18文庫的DNA插段優(yōu)先染色的染色體數(shù)目的24個中期擴(kuò)展與用同樣探針并具有良好分開的結(jié)構(gòu)域的28個間期核進(jìn)行比較。在相同的條件下成象(帶狀膠片)并使之?dāng)?shù)字化。在每個中期擴(kuò)展中,由每個正常的和畸變的染色體所得到的面積被除以幾個表觀完整的染色體的平均面積。在間期核中,假設(shè)最大的n標(biāo)記的結(jié)構(gòu)域代表完整(正常)的間期染色體,在這樣的基礎(chǔ)上比較結(jié)構(gòu)域。因此,這些標(biāo)準(zhǔn)值的總數(shù)代表在單一細(xì)胞中特異染色體當(dāng)量數(shù)目的量度。好幾種細(xì)胞在每種情況下都給出了平均值。由間期和中期細(xì)胞得到的染色體當(dāng)量的平均數(shù)量顯示很強(qiáng)的總相關(guān)系數(shù),即r=+0.95。與面積測定比較,由二維強(qiáng)度積分確定的染色體當(dāng)量的平均數(shù)(參見上文)表明總相關(guān)系數(shù)為r=+0.99。
      表3CISS雜交后在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中用數(shù)字成象分析測定的染色體當(dāng)量的平均數(shù)染色體當(dāng)量染色體細(xì)胞系間期中期期望值4TC5932.02.04.0TC6202.52.43.07TC5934.44.64.0TC6203.53.33.018TC5933.03.64.0TC6202.52.33.0由數(shù)字成象分析得到的染色體當(dāng)量獨(dú)立地證實(shí)了兩個神經(jīng)膠質(zhì)瘤系通過DAPI譜帶記錄的靶染色體相對值。
      圖13進(jìn)一步出示了含有總的中期信號的片段。計算機(jī)分析對涉及易位片段而不能清楚限定的折點(diǎn)特別適用。用計算機(jī)也可以定量測定間期-中期相關(guān)的值,和大小明顯不等的正常和畸變的染色體的值。
      實(shí)例3通過原位雜交快速測定人染色體21的畸變DNA探針?biāo)械馁|(zhì)粒都含有定位于21q22.3上的人染色體21插段。Moisan,J.P.,Mattei,M.G.,Baeteman-Volkel,M.A.,Mattei,J.F.,Brown,A.M.C.,Garnier,J.M.,Jeltsch,J.M.,Masiakowsky,P.,Roberts,M.andMandel,J.L.(1985)Cytogenet。CellGenet.40701-702(摘要)。Tanzi,R.,Watkins,P.,Gibons,K.,F(xiàn)aryniarz,A.,Wallace,M.,Hallewell,R.,Conneally,P.M.&amp;Gusella,J.(1985)Cytogenet.CellGenet.40760(摘要)。VanKeuren,M.L.,Watkins,P.C.,Drabkin,H.A.,Jabs,E.W.,Gusella,J.F.&amp;Patterson,D.(1986)Am.J.Hum.Genet.38793-804。Nakai,H.,Byers,M.G.,Watkins,P.G.,Watkins,P.A.&amp;Shows,T.B.(1987)Cytogenet.CellGenet.46667(摘要)。Munke,M.,F(xiàn)oellmer,B.,Watkins,P.G.,Cowan,J.M.,Carroll,A.J.,Gusella,J.F.&amp;Fracke,U.(1988)Am.J.Hum.Genet.42542-549。通過Southern印跡分析,了解或證實(shí)了所有插段都是單拷貝DNA除質(zhì)粒pS2外,都是由入噬菌體文庫或柯斯質(zhì)粒文庫得到的亞克隆。VanKeuren,M.L.,Watkins,P.G.,Drabkin,H.A.,Jabs,E.W.,Gusella,J.F.&amp;Patterson,P.(1986)Am.J.Hum.Genet.38793-804.Masiakowski,P.,Breathnach,R.,Bloch,J.,Gannon,F(xiàn).,Krust,A.&amp;Chambon,P.(1982)NucleicAcids.Res.107895-7903。Watkins,P.G.,Tanzi,R.E.Gibbons,K.T.,Tricoli,J.V.,Landes,G.,Eddy,R.,Shows,T.B.&amp;Gusella,J.F.(1985)NucleicAcidsRes.136075-6088。Watkins,P.C.,Watkins,P.A.,Hoffman,N.&amp;Stanislovitis,P.(1985)Cytogenet.CellGenet.40773-774(摘要)。質(zhì)粒都使用HumanGeneMappingWovkshop符號和大致的插段長度列于表4中。Kaplan,J.G.和Carrit,B.(1987)Cytogenet.CellGenet.46257-276。
      表4帶有21q22.3插段的質(zhì)粒質(zhì)粒插段長度KbBCEIps2(23)0.6D21S3pPW231F0.8pPW231G0.7D21S23pPW244D1.0
      表4(續(xù))質(zhì)粒插段長度KbD21S53pPW512-6B3.0pPW512-8B3.8pPW512-1H2.9pPW512-16P2.7pPW512-18P1.6pPW512-4R4.7pPW512-12R2.0D21S55pPW518-4H1.6pPW518-10P2.9pPW518-5R5.2D21S56pPW520-5B5.0pPW520-6B1.0pPW520-10R4.6pPW520-11R1.8D21S57pPW523-10B6.5pPW523-1H7.0pPW523-5R2.2pPW523-10R3.8pPW523-19R2.5D21S64pPW551-8P1.9pPW551-12P4.2
      表4(續(xù))質(zhì)粒插段長度KbD21S71pPW519-10P0.8pPW519-11P3.0pPW519-1R6.0pPW519-8R2.9pPW519-9R1.7pPW519-14R4.0pPW519-22R1.8根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的記錄制備質(zhì)粒DNA。Maniatis,T.,F(xiàn)ritsch,E.F.和Sambrook,J.(1982)MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarborLab.,ColdSpringHarbor,NY)。通過合并質(zhì)粒(等摩爾量)制備各種探針套,得到95Kb(所有列出的質(zhì)粒)、75Kb(用星號標(biāo)記的質(zhì)粒)或29Kb(用劍號標(biāo)記的質(zhì)粒)的DNA探針復(fù)合物。
      從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得人染色體21基因文庫LL21NS02,根據(jù)推薦的方法在培養(yǎng)基平板上擴(kuò)增。用HindⅢ制備和消化噬菌體DNA,通過0.6%的瓊脂糖凝膠電泳將DNA插段從載體臂中分離出來。通過電泳從凝膠切片上分離DNA;用Elutip-d層析純化DNA(Schleicher和Schuell);用1∶1(V/V)的苯酚/三氯甲烷萃取;用乙醇進(jìn)行沉淀。
      個體細(xì)胞用(ⅰ)正常的個體淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(46,XY),(ⅱ)個體唐氏(Down)綜合癥(47,+21)的淋巴細(xì)胞,(ⅲ)產(chǎn)前診斷培養(yǎng)的絨膜毛試樣(ⅱ和ⅲ是由T.Yan-Geng,YaleUniversityCytogeneticsLaboratory提供的),和(ⅳ)TC620的培養(yǎng)物(一種衍生的少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤的假三倍體細(xì)胞系)制備中期擴(kuò)展和間期核。Manuelidis,L.和Manuelidis,E.E.(1979)inProgressinNeuropathology,ed.Zimmerman,H.M.(RavenPress,NewYork),Vol.4,235-266。本發(fā)明使用了乙酰甲基秋水仙堿處理、低滲處理和甲醇/乙酸固定的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。如所描述的方法,將“正?!比舜竽X(46,XY)的皮質(zhì)區(qū)域的活組織檢查物質(zhì)固定,切開并且滲透。
      Manuelidis,L.和Borden,J.,Chromosoma,96397-410,1988。
      原位雜交將經(jīng)缺口轉(zhuǎn)譯用Bioll-dUTP標(biāo)記的各種質(zhì)粒DNA的結(jié)合物用于雜交,其濃度范圍為2-15μg/ml,它是由庫的大小決定的。Brigati,D.J.,Myerson,D.Leary,J.J.,SPalholz,B.,Travis,S.Z.,F(xiàn)ong,C.K.Y.Hsiung,G.D.和Ward,D.C.(1983)Virology12632-50。例如,當(dāng)探針混合物含94Kb的插段DNA時,使用的濃度為15μg/ml;探針濃度與探針混合物的順序復(fù)合度成正比降低。通過改變?nèi)笨谵D(zhuǎn)譯反應(yīng)中的DNA酶濃度將探針DNA的大小根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)到150-250核苷酸的長度。雜交混合物還含有50%的甲酰胺,0.30MNaCl,0.03M檸檬酸鈉(pH7),10%(wt/vol)的硫酸葡聚糖,有時也含有0.5mg/ml的聲處理鮭魚精子DNA。使探針和靶DNA同時在75℃變性6分鐘(中期擴(kuò)展)或在94℃下變性11分鐘(組織切片)。在37℃下將雜交反應(yīng)保溫過夜。
      用如上文所述的CISS雜交法,用分選的人染色體產(chǎn)生的DNA探針測定個體染色體。簡而言之,就是在雜交溶液中將生物素化的染色體21文庫DNA插段(5μg/ml),DNA酶消化的人基因組DNA(200μg/ml),和鮭魚精子DNA(800μg/ml)結(jié)合,加熱變性,并在分離變性樣品之前于37℃下局部預(yù)雜交10-30分鐘。
      如實(shí)例1所述進(jìn)行雜交后洗滌,用堿性磷酸酶結(jié)合的抗生物素蛋白或熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的抗生物素蛋白檢測雜交探針,和在相同的條件下進(jìn)行攝影。當(dāng)所用的探針套含有29Kb或少于靶順序時,通常如實(shí)例1描述的那樣,通過一個周期的信號放大來增強(qiáng)熒光素異硫氰酸鹽的檢測。
      通過使用10個來自獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的載片對間期信號進(jìn)行所有的定量分析,每個載片上待分析的核數(shù)目在100以上。用盲目研究(blind-study)方式將正常的和三體的試樣信號進(jìn)行對比。
      這個工作表明,在所述的條件下,CISS雜交導(dǎo)致了快速檢測中期和間期細(xì)胞中染色體21的數(shù)值和結(jié)構(gòu)畸變。
      利用人染色體21的克隆DNA片段特異性標(biāo)記淋巴細(xì)胞中期擴(kuò)展和間期核中的染色體探針套中最大量的獨(dú)特順序DNA約為94Kb;這個探針套能清楚可見地標(biāo)記染色體21同源物的兩個染色單體的末端區(qū)域(參見
      圖14B)。這些信號明顯地可以看見,對所有的中期擴(kuò)展,甚至是低質(zhì)量擴(kuò)展或前期細(xì)胞(未示出)也毫無例外。在正常的間期細(xì)胞中,大部分的(65-75%)核有兩個信號(參見
      圖14C),25-30%顯示出一個信號;5%以下沒有信號。我們發(fā)現(xiàn)具有三個信號的核是很少的(<0.2%),并且可能反映了與試樣中少數(shù)四倍體細(xì)胞的不完整雜交。用含29或75Kb的DNA探針套得到了類似結(jié)果。采用插入DNA含量低于20Kb的探針套時,具有兩個以下信號的細(xì)胞數(shù)增加。因此,我們認(rèn)為這些探針套不適于診斷目的。但是,這類探針對大部分染色體21都產(chǎn)生特異信號,甚至用6Kb單拷貝DNA(參見
      圖14A),特別是使用信號放大時仍然產(chǎn)生特異信號。
      利用染色體文庫DNACISS雜交檢測染色體21盡管在其他近端著絲粒染色體的中心著絲粒區(qū)域或其附近,特別是染色體13(正常的核型未示出;
      圖14F)中可以看到一些附加的次要結(jié)合部位,但在正常的淋巴細(xì)胞中期擴(kuò)展中染色體21被特異性地完全染色。用包括質(zhì)粒L1.26的附加DNA(該附加DNA檢測主要位于染色體13和21的中心著絲粒區(qū)域的重復(fù)DNA)進(jìn)行抑制,不能有效地抑制次要的非21染色體信號。Devilee,P.,Cremer,T.,Slagboom,P.,Bakker,E.,Schoil,H.P.,Hager,H.D.Stevenson,A.F.G.,Cornelisse,C.J.和Pearson,P.L.(1986)Cytogenet.CellGenet.41193-201。定量測定間期核信號再一次表明,具有3個信號的部分核可忽略不計;然而,觀察到具有兩個以下信號的核明顯增加(50-60%的兩個信號,35-45%的一個信號,5-10%沒有信號)。用兩個不同的探針觀察到的數(shù)值差異,可以將其解釋成部分是由于后來分析中未計算在內(nèi)的核數(shù)目(多達(dá)三分之一)造成的,因?yàn)檫@些核具有較大的和更多的擴(kuò)散信號,這些擴(kuò)散信號很可能是由于有一個以上的染色體在二維圖象中不能明顯分辨為兩個分離的染色體結(jié)構(gòu)域。上述的次要交叉雜交部位造成了第二個實(shí)驗(yàn)的難度,但它并不影響對于數(shù)據(jù)的解釋。
      測定含染色體21畸變的細(xì)胞通過使用含染色體21畸變的細(xì)胞,進(jìn)一步測定最佳(94Kb)質(zhì)粒庫以及使用染色體21文庫插段的CISS雜交。兩種探針套都能快速而明顯地識別唐氏綜合癥淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(參見實(shí)例14D和E)的所有中期擴(kuò)展的三體21。而且,在如上述進(jìn)行分析時,在同一制備物的間期核中雜交信號的定量分布用任一種探針都是類似的〔<5%的細(xì)胞沒有信號,5-15%的有一個信號,25-35%有兩個信號,55-65%有三個信號(
      圖14F-J)〕。雖然文庫DNA插段給出四個信號的核高達(dá)15%(比較
      圖14F和G),但這很可能是由于其他染色體的次要結(jié)合部位所致,質(zhì)粒庫只揭示出其百分比可以忽略的具有四個信號的核(<0.2%)。這些結(jié)果表明,用少量非有絲分裂細(xì)胞即可以對診斷有意義的方式檢測三體21。胚胎絨膜毛細(xì)胞中染色體21DNA的定位在本文具有相互t(4∶21)易位的情形中,用94Kb的質(zhì)粒探針套也研究了胚胎絨膜毛(CV)細(xì)胞。與CV細(xì)胞的中期擴(kuò)展進(jìn)行的雜交表明,易位染色體(4pter→4q3321q11.2→21qter)的確是經(jīng)胎兒遺傳的(參見
      圖13L和M)。在CV細(xì)胞的間期細(xì)胞核(見
      圖14K)中的信號分布與正常核型細(xì)胞的信號分布相同,這表明21q22.3是處于平衡態(tài)的,并且排除了唐氏綜合癥的可能。還觀察到具有三個和四個信號的核少量超過了正常淋巴細(xì)胞的,這也許與這類CV細(xì)胞試樣中較高比例的四倍體細(xì)胞有關(guān)。
      神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞中的染色體21DNA的定位通過使用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TC620(該細(xì)胞系被認(rèn)為是具有高度重排基因組的假三倍體)進(jìn)一步測定染色體21探針的診斷潛力。Cremer,T.等,Exp.CellRes.176199-220,1988;Cremer.T.等,Hum.Genet.,InPress,1988;Manuelidis,L.和E.E.Manuelidis.InProgressinNeuropathology,4235-266(ed.Zimmerman,H.M.)(1979)。中期擴(kuò)展顯示出兩個表觀正常的染色體21和一個易位染色體(參見
      圖14N和O)。有趣的是,在用文庫探針標(biāo)記的易位染色體上的染色體21DNA的大小等同于正常的21q區(qū)域,因此提示發(fā)生了Robertsonian易位現(xiàn)象。但是,用這種分析不能排除21q微小的結(jié)構(gòu)畸變(即少量缺失等)。用質(zhì)粒探針套和文庫插段所看到的間期信號分別與三體21q22.3和三體21是一致的。
      固態(tài)組織中DNA順序的染色體21的定位還評價了94Kb質(zhì)粒探針套定位固態(tài)組織中染色體21DNA順序的能力。兩個染色體21都被探針清楚標(biāo)記,并且被定位在核附近;這個核定位與這樣的事實(shí)是一致的即染色體21所含的核糖體基因組通常被定位在核中。這種觀察提示,這些探針還可能用于估計特異細(xì)胞或組織中染色體21鑲嵌性的頻率。另外值得注意的是,與唐氏綜合癥表型相結(jié)合的各種核型變化,是否會在神經(jīng)元組織中改變?nèi)旧w21的核拓?fù)鋱D象。
      等效替換那些本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員能夠用一般的常規(guī)實(shí)驗(yàn)對本文專門描述的本發(fā)明的具體實(shí)例進(jìn)行等效替換,這類替換被規(guī)定為包括在以下權(quán)利要求的范圍中。
      權(quán)利要求
      1.標(biāo)記個體哺乳類染色體的方法,在有絲分裂的細(xì)胞或間期細(xì)胞內(nèi)通過用染色體特異性探針的原位雜交產(chǎn)生染色體特異信號。
      2.標(biāo)記個體人染色體的方法,在有絲分裂的細(xì)胞或間期細(xì)胞內(nèi)通過用染色體特異性探針的原位雜交產(chǎn)生染色體特異信號。
      3.產(chǎn)生個體人靶染色體高度特異性染色的方法,包括原位抑制標(biāo)記DNA探針的雜交,該探針對人有絲分裂的細(xì)胞或人間期細(xì)胞中的染色體DNA是特異性的。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中DNA探針是選自以下一組全重組體文庫DNA、由染色體產(chǎn)生的重組體DNA文庫純化的DNA插段,以及來自染色體的特異性DNA片段。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其中標(biāo)記的DNA探針選自以下一組至少用一種熒光染料標(biāo)記的DNA探針;至少用特異性結(jié)合對的一個成員標(biāo)記的DNA探針;以及用酶標(biāo)記的DNA探針。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中的熒光染料選自以下一組熒光素,若丹明,得克薩斯紅,金星(Lucifer)黃,藻膽蛋白和花青染料,而特異結(jié)合對的成員是生物素。
      7.用染色體原位抑制雜交確定人細(xì)胞染色體畸變的方法。
      8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中人細(xì)胞選自中期細(xì)胞、前期細(xì)胞和間期細(xì)胞。
      9.檢測人非整倍體細(xì)胞中染色體畸變的方法,包括a)在適于使互補(bǔ)的核酸順序發(fā)生雜交的條件下結(jié)合1)經(jīng)過處理的人非整倍體細(xì)胞,使之產(chǎn)生適于與互補(bǔ)核酸順序雜交的核酸順序,和2)雜交混合物,它含有來自特異染色體的標(biāo)記的人探針;競爭DNA;和非人基因組DNA;以及b)檢測與非整倍體細(xì)胞的核酸順序雜交的來自特異染色體的標(biāo)記的人DNA。
      10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法,其中非整倍體細(xì)胞是人腫瘤細(xì)胞。
      11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法,其中人腫瘤細(xì)胞選自中期細(xì)胞、前期細(xì)胞和間期細(xì)胞。
      12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法,其中人腫瘤細(xì)胞是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
      13.檢測存在于試樣中的人染色體數(shù)目改變的方法,包括a)在適于使互補(bǔ)的核酸順序發(fā)生雜交的條件下結(jié)合1)經(jīng)過處理的試樣,使之產(chǎn)生適于與互補(bǔ)的核酸順序雜交的核酸順序;和2)一種雜交混合物,它含有來自選擇的染色體的標(biāo)記的人DNA;競爭DNA;和非人基因組DNA;和b)檢測與存在于試樣中的核酸順序雜交的來自選擇的染色體的標(biāo)記DNA。
      14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法,其中選擇的人染色體是選自以下染色體13、18、21、X和Y。
      15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法,其中選擇的人染色體是染色體21,而來自選擇的染色體的標(biāo)記的人DNA是由染色體產(chǎn)生的重組DNA文庫純化的DNA插段。
      16.測定人腫瘤細(xì)胞中選擇的染色體或其部分的過量或不足的方法,包括如下步驟a)在適于使互補(bǔ)的核酸順序發(fā)生雜交的條件下結(jié)合1)處理的人腫瘤細(xì)胞,使存在于細(xì)胞中的核酸順序適于與互補(bǔ)核酸順序雜交;和2)一種雜交混合物,它含有來自選擇的染色體的標(biāo)記DNA片段;競爭DNA;和非人基因組DNA;和b)檢測與腫瘤細(xì)胞核酸順序雜交的標(biāo)記的人染色體特異性DNA片段。
      17.鑒定存在于選擇的哺乳動物染色體中的染色體特異性DNA的方法,包括a)在適于使互補(bǔ)的核酸順序發(fā)生雜交的條件下結(jié)合以下物質(zhì)1)選擇的哺乳動物染色體;2)具有可探測標(biāo)記的來自哺乳動物染色體的DNA片段;3)競爭DNA;和4)載體DNA,以形成具有可測標(biāo)記DNA片段和選擇的哺乳動物染色體的復(fù)合物;和b)檢測步驟(a)中形成的復(fù)合物。
      18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法,進(jìn)一步包括通過分離步驟(a)的剩余順序形成的選擇復(fù)合物,以分離選擇的哺乳動物染色體中的染色體特異性DNA。
      全文摘要
      通過染色體原位抑制雜交以特異性染色選擇的哺乳動物的染色體以及檢測、識別和/或定置單個染色體的方法。該方法可用于分析出現(xiàn)多染色體、染色體片段或單染色體畸變的細(xì)胞。
      文檔編號C12N15/09GK1046392SQ89109258
      公開日1990年10月24日 申請日期1989年11月15日 優(yōu)先權(quán)日1988年11月15日
      發(fā)明者戴維·C·沃德, 彼得·利希特, 托馬斯·格雷默, 勞拉·曼紐里迪斯 申請人:耶魯大學(xué)
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