一種新型氧化還原聚合輔助信號放大用于分子診斷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型的通過氧化還原聚合輔助信號放大來檢測生物分子的方法，并用于檢測基因特征序列及其單堿基突變，屬于分子診斷及信號放大技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著越來越多的疾病被證實與基因或蛋白質(zhì)的變異密切相關(guān)，分子診斷這一領(lǐng)域的相關(guān)研究也越來越受到研究者的重視。在疾病的預(yù)防、早期診斷、治療等領(lǐng)域中，通過分子生物學(xué)方法來檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)是如今臨床診斷的重要手段。目前，發(fā)展迅速并得到廣泛應(yīng)用的疾病分子診斷技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫實驗(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因測序(DNA sequencing)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、基因及蛋白質(zhì)芯片(gene chip)等。其中，應(yīng)用PCR相關(guān)技術(shù)衍生的分子診斷手段是臨產(chǎn)疾病基因檢測的主要方法；生物芯片技術(shù)由于其高通量及普適性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)也成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。這些技術(shù)手段的應(yīng)用范圍廣泛、生物特異性良好、靈敏度高、檢測時間短，在疾病的早期預(yù)診、治療、愈后檢驗中發(fā)揮了重要作用，這些方法提供的患者基因定性數(shù)據(jù)有助于建立患者的數(shù)據(jù)庫，為相關(guān)診斷提供可靠有效的信息指導(dǎo)。但是這些技術(shù)亦具有開發(fā)難度高、成本昂貴、操作繁雜、對高精密儀器依賴性強(qiáng)等限制，而且這些技術(shù)往往對操作者的科學(xué)素養(yǎng)有較高要求。因此，研究具有高選擇性、高特異性、高靈敏性，同時快速便捷及可視化的分子診斷新技術(shù)是及其必要，且有廣闊的應(yīng)用前景的。
[0003]DNA分子雜交反應(yīng)與抗體-抗原之間的特異性反應(yīng)是表面分子檢測的基礎(chǔ)。以DNA的診斷為例，所有有關(guān)DNA診斷的研究都是建立在這樣一個理論上:目標(biāo)序列與其完全匹配的互補(bǔ)序列可以進(jìn)行高特異性的雜交反應(yīng)，而這種高特異性的反應(yīng)無論在溶液中還是在固體表面上都是極其高效的。
[0004]在分子診斷體系中，往往分為分子識別系統(tǒng)及信號放大系統(tǒng)兩大部分。附圖1是常用的分子診斷體系的示意圖:末端巰基修飾的探針(也稱為捕獲探針)與金表面連接，其序列與一部分目標(biāo)探針完全互補(bǔ)，通過雜交反應(yīng)可以將目標(biāo)探針連接于表面，而信號標(biāo)記分子修飾在另一段與部分目標(biāo)探針互補(bǔ)的信號標(biāo)記探針上(該探針也稱為信標(biāo)探針)，通過雜交反應(yīng)將信標(biāo)分子特異性的連接在表面上，從而將信號放大部分與分子識別部分聯(lián)系起來。
[0005]本發(fā)明的重點(diǎn)在于發(fā)明了一種新型的氧化還原聚合輔助信號放大體系。
[0006]目前分子診斷領(lǐng)域常用的技術(shù)如生物芯片具有應(yīng)用廣泛、檢測靈敏度高、生物特異性好的優(yōu)點(diǎn)，在疾病的早期診斷及治療中發(fā)揮了巨大的作用，但是這些技術(shù)亦具有開發(fā)難度高、成本昂貴、操作繁雜、對高精密儀器依賴性強(qiáng)等限制。本發(fā)明所涉及的氧化還原聚合輔助信號放大用于分子診斷體系的目的是提供一種成本低廉、高靈敏度、快速便攜及檢測效果裸眼可視的新型分子診斷技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)及實際檢測的需要，本發(fā)明的目的是提供一種新型氧化還原聚合輔助信號放大用于分子診斷的方法，以達(dá)到成本低廉、高靈敏度、快速便攜及檢測效果裸眼可視的新型分子診斷技術(shù)。
[0008]特異性的檢測微量目標(biāo)生物分子并將其信號放大是通過如下手段達(dá)到的。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是將富含還原性基團(tuán)的物質(zhì)通過化學(xué)修飾與待檢測生物體系中所用的信號標(biāo)記分子連接，通過還原劑與對應(yīng)氧化劑在常溫、常壓及水環(huán)境下產(chǎn)生的活性自由基引發(fā)單體原位聚合，達(dá)到放大被檢測物信號的目的。
[0010]一種氧化還原聚合輔助信號放大新方法，其特征是:將還原劑連接在待檢測生物體系中所用的信號標(biāo)記分子上，然后加入可與其產(chǎn)生活性自由基從而形成氧化還原對的氧化劑，并同時加入單體，對應(yīng)的氧化劑還原劑組成可通過反應(yīng)產(chǎn)生的活性自由基引發(fā)單體原位聚合，放大被測物質(zhì)信號，達(dá)到裸眼檢測的目的。
[0011]在加入單體和氧化劑的時候還可加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑用量微量，相對于單體的物質(zhì)的量為0.5-2%。
[0012]氧化劑、單體溶液直接滴加到與還原劑連接后的信號標(biāo)記分子物質(zhì)上。
[0013]所述的氧化還原聚合輔助信號放大方法的應(yīng)用范圍，其特征是:待檢測生物分子為DNA序列片段或RNA序列片段或及其單點(diǎn)突變序列，或微量蛋白質(zhì)。尤其可用于疾病相關(guān)微量DNA、RNA序列片段或及其單點(diǎn)突變序列，或疾病相關(guān)微量蛋白質(zhì)。
[0014]還原劑如富含羥基類聚合物物質(zhì)或維生素C，對應(yīng)的可產(chǎn)生活性自由基的氧化劑為四價鈰鹽、過氧化氫，在室溫、常壓、水溶液，在極其溫和的條件下即可產(chǎn)生自由基，可進(jìn)一步引發(fā)單體進(jìn)行聚合。
[0015]富含羥基類聚合物物質(zhì)組成，結(jié)構(gòu)中富含大量活性氨基及羥基的富含羥基類聚合物物質(zhì)，或人工合成的重復(fù)單元富含羥基的聚合物。
[0016]當(dāng)還原劑為天然大分子物質(zhì)殼聚糖時，其化學(xué)修飾的步驟包括如下:
[0017](I)將生物素、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，其中N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)相對于生物素過量，(如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、相對于生物素按摩爾比1.1:1.1:1),40-60 0C (優(yōu)選50°C)下反應(yīng)至少24h，然后趁熱過濾，向濾液中加入大量無水乙醚，攪拌至白色沉淀不再明顯出現(xiàn)時將之放入冰浴中靜止至少2h后過濾，收集得到白色沉淀，再將以上粗產(chǎn)物置于熱的異丙醇中攪拌溶解后置于冰箱中，過濾收集結(jié)晶，再次重結(jié)晶后真空干燥，得到末端NHS化的生物素；
[0018](2)將殼聚糖分散在DMSO溶液中，加入單元糖摩爾當(dāng)量1-10% (優(yōu)選5% )的生物素活性酯，并加入與活性酯相同摩爾當(dāng)量的無水三乙胺，室溫下攪拌至少48h，所得粗產(chǎn)物用滲析袋在乙酸水溶液中滲析，滲析未反應(yīng)的小分子，待滲析至溶液透明時，再用去離子水充分滲析后冷凍干燥，得到生物素修飾的殼聚糖。
[0019]將上述生物素修飾的殼聚糖與末端生物素修飾的信號標(biāo)記分子反應(yīng)。在末端生物素修飾的信號標(biāo)記分子物質(zhì)上滴加鏈霉親和素反應(yīng)后，再滴加生物素修飾的殼聚糖進(jìn)行反應(yīng)，滴加生物素修飾的殼聚糖溶液可根據(jù)需要調(diào)節(jié)PH值進(jìn)行優(yōu)化。
[0020]本發(fā)明所述信號放大方法用于分子診斷具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0021](I)氧化還原聚合具有活化能低，引發(fā)聚合誘導(dǎo)期短，在室溫或較低溫度條件下亦可快速發(fā)生的優(yōu)點(diǎn)，而且該類反應(yīng)不需要加入額外能量，一定量的氧化劑和還原劑混合在一起就能引發(fā)單體聚合，從而使分子診斷過程方便、快捷；
[0022](2)經(jīng)由氧化還原聚合輔助信號放大方法對生物分子進(jìn)行檢測，可以達(dá)到裸眼分辨的效果。
【附圖說明】
[0023]圖1本發(fā)明所述分子診斷中分子識別部分組成示意圖，其中，末端巰基修飾的捕獲探針直接固定于金表面上，通過分子雜交反應(yīng)與待檢測的目標(biāo)探針連接，再與末端標(biāo)記有信標(biāo)分子的信標(biāo)探針通過分子雜交反應(yīng)連接。
[0024]圖2本發(fā)明所述的殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號放大體系用于P53基因特征序列檢測的示意圖、結(jié)果及其薄膜厚度表征；
[0025]其中，圖示依次為:
[0026]a、金表面+捕獲探針+互補(bǔ)序列+鏈霉親和素(SA)+生物素修飾殼聚糖(CS-b1tin)+聚合點(diǎn)樣液；
[0027]b、金表面+捕獲探針+非互補(bǔ)序列+鏈霉親和素(SA)+生物素修飾殼聚糖(CS-b1tin) +聚合點(diǎn)樣液；
[0028]C、金表面+捕獲探針+互補(bǔ)序列+生物素修飾殼聚糖(CS-b1tin) +聚合點(diǎn)樣液；
[0029]d、金表面+捕獲探針+鏈霉親和素(SA)+生物素修飾殼聚糖(CS-b1tin) +聚合點(diǎn)樣液。
[0030]圖3本發(fā)明所述的殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號放大體系用于檢測不同濃度的目標(biāo)P53基因特征序列的結(jié)果及其薄膜厚度表征圖。
[0031]圖4本發(fā)明所述的殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號放大體系用于P53基因特征序列單堿基突變檢測的示意圖。
[0032]圖5本發(fā)明所述的殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號放大體系用于P53基因特征序列單堿基突變檢測的表面聚合物薄膜厚度表征圖。
[0033]圖6本發(fā)明所述的殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號放大體系用于P53基因特征序列單堿基突變檢測的表面結(jié)果圖，上為單堿基錯配DNA序列，下排為全互補(bǔ)DNA序列。
[0034]圖7本發(fā)明所述的生物素修飾大分子殼聚糖的核磁氫譜。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0036]實施例1:殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號放大體系對p53基因特征序列及非互補(bǔ)序列檢測對照實驗
[0037](I)稱取生物素(Immol，2.44g)和 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (1.1mmol，1.26g)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (1.lmmol, 2.26g)溶于50mL的N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF)中，50°C下反應(yīng)24h。趁熱過濾除去白色沉淀后，向濾液中加入大量無水乙醚，攪拌至白色沉淀不再明顯出現(xiàn)時將之放入冰浴中靜止2h后過濾，收集得到白色沉淀。再將以上粗產(chǎn)物置于熱的異丙醇中攪拌溶解后置于冰箱中，過濾收集結(jié)晶。重復(fù)以上步驟得到白色固體，真空干燥即得末端NHS化的生物素，產(chǎn)率70%。
[0038](2)粘均分子量為50萬的殼聚糖分散在DMSO溶液中，配制成10mg/mL的分散液，加入單元糖當(dāng)量5%的生物素活性酯，并加入與活性酯相同當(dāng)量的無水三乙胺，室溫下攪拌48h。所得粗產(chǎn)物用截留分子量為14000的滲析袋在1%的乙酸溶液中滲析，待滲析至溶液透明時，再用去離子水充分滲析后冷凍干燥，得到富含羥基的生物素修飾殼聚糖CS-b1tin。
[0039](3)超聲清洗后的金基片在室溫下用濃硫酸:雙氧水(v/v = 7:3)浸泡Ih后晾干，于4°C用1uM的5’末端巰基修飾的捕獲探針DNA點(diǎn)樣3uL，過夜反應(yīng)，清洗干燥后用100ug/mL的BSA溶液于室溫下浸泡30min后干燥。在上述基片上分別點(diǎn)樣目標(biāo)探針濃度為IuM的雜交點(diǎn)樣液(點(diǎn)樣液組成:5乂33(:，20%去離子甲酰胺)31^，42°(:下分別反應(yīng)801^11后清洗干燥，再點(diǎn)樣信標(biāo)探針濃度為5uM的雜交點(diǎn)樣液(點(diǎn)樣液組成:5XSSC，20%去離子甲酰