三七不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物的不定根組織培養(yǎng)及生產(chǎn)方法，特別是涉及一種三七不定根 的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 三七（Panaxnotoginseng)是五加科人參屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥和云南 省重要的特色資源，也是發(fā)展中藥和天然藥物產(chǎn)業(yè)的重要原料。三七在心血管、腦血管、神 經(jīng)、免疫等系統(tǒng)具有多方面的藥理活性，還具有對(duì)肝損傷的保護(hù)作用和抗腫瘤、抗炎等作 用。以三七皂苷為主要原料開(kāi)發(fā)的中成藥除血塞通外，還有血栓通、復(fù)方丹參滴丸、片仔癀 和云南白藥等多種品牌的中成藥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)醫(yī)藥健康產(chǎn)品中，用三七為原料的產(chǎn)品 至少有200種，其年銷售額在50億元以上。三七產(chǎn)業(yè)在我國(guó)醫(yī)藥健康事業(yè)中具有重要的意 義。然而，三七為多年生植物，適宜于冬暖夏涼的氣候，喜半陰和潮濕的生態(tài)環(huán)境。三七的 自然屬性決定了適于其生長(zhǎng)的范圍僅限于少數(shù)特殊環(huán)境條件的地區(qū)，導(dǎo)致三七資源嚴(yán)重缺 乏，對(duì)以三七為原料的產(chǎn)業(yè)存在著潛在的威脅。
[0003] 通過(guò)組織培養(yǎng)的方法可以獲得有效成分含量高、生長(zhǎng)周期短的三七培養(yǎng)物，已解 決土地及三七資源嚴(yán)重缺乏的問(wèn)題。具有重要的經(jīng)濟(jì)意義與社會(huì)意義。其中不定根培養(yǎng) 是80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。不定根是由植物的愈傷組織誘導(dǎo)出來(lái)的根，和藥用植物 的懸浮細(xì)胞相比，其活性成分的含量穩(wěn)定；和大田栽培生長(zhǎng)的植物相比，其生長(zhǎng)速度要快上 千百倍且其活性成分含量高。因此，比較適合藥用植物的組織培養(yǎng)以獲取有效成分或作為 替代原料，特別是用藥部位為其根部的藥用植物。
[0004] 中國(guó)專利號(hào)為CN103923874A公開(kāi)的三七懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法所獲得的 皂苷含量為2. 31±0. 35。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供三七不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方 法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0007] -種三七不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0008] (1)三七不定根的誘導(dǎo)：取三七的愈傷組織，接種于固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、 23-25°C及避光的條件下培養(yǎng)3-5周，得到帶有愈傷組織的三七不定根；
[0009] (2)三七不定根的繼代培養(yǎng)：將帶有愈傷組織的三七不定根轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基 中，在轉(zhuǎn)速為110_130r?mirT1的搖床上，在無(wú)菌、23-25°C及光照條件下連續(xù)培養(yǎng)4-5周；繼 代3-5次。
[0010] 固體培養(yǎng)基為在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和瓊脂，使吲哚丁酸的 終濃度為3. 0-5.Omg/L、萘乙酸的終濃度為0. 5-1.Omg/L、蔗糖的終濃度為30-40g/L、瓊脂 的終濃度為 6-7g/L，pH= 5. 8-6. 0。
[0011] 液體培養(yǎng)基為在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖，使吲哚丁酸的終濃 度為3. 0-5.Omg/L、萘乙酸的終濃度為0? 5-1.Omg/L、蔗糖的終濃度為30-40g/L，pH= 5. 8~6. 0〇
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0013] 本發(fā)明利用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)三七不定根，其生長(zhǎng)速率與三七自然生長(zhǎng)相比較 快，并且其活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量高且比較穩(wěn)定，培養(yǎng)物較均一，同時(shí)，培養(yǎng)條件在人工 控制下不受外界多變天氣及病蟲(chóng)害的影響。工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低廉，誘導(dǎo)率高，重復(fù)性好， 不定根生長(zhǎng)速率快。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0015] 實(shí)施例1
[0016] 固體培養(yǎng)基的制備：在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和瓊脂，使吲哚丁 酸的終濃度為3.Omg/L、萘乙酸的終濃度為1.Omg/L、蔗糖的終濃度為40g/L、瓊脂的終濃度 為6g/L，混合加熱至完全溶解，調(diào)pH= 5. 8,在121 °C，0.IMP壓力下滅菌25分鐘，冷卻至常 溫，備用。
[0017] 實(shí)施例2
[0018] 固體培養(yǎng)基的制備：在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和瓊脂，使吲哚丁 酸的終濃度為5.Omg/L、萘乙酸的終濃度為1.Omg/L、蔗糖的終濃度為30g/L、瓊脂的終濃度 為7g/L，混合加熱至完全溶解，調(diào)pH= 5. 9,在121 °C，0.IMP壓力下滅菌25分鐘，冷卻至常 溫，備用。
[0019] 實(shí)施例3
[0020] 固體培養(yǎng)基的制備：在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和瓊脂，使吲哚丁 酸的終濃度為3. 0mg/L、萘乙酸的終濃度為0. 5mg/L、蔗糖的終濃度為35g/L、瓊脂的終濃度 為7g/L，混合加熱至完全溶解，調(diào)pH= 6. 0,在121 °C，0.IMP壓力下滅菌25分鐘，冷卻至常 溫，備用。
[0021] 實(shí)施例4
[0022] 液體培養(yǎng)基的制備：在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和L蔗糖，使吲哚丁酸 的終濃度為3. 0mg/L、萘乙酸的終濃度為1. 0mg/L、蔗糖的終濃度為40g/L，調(diào)pH= 5. 8,在 121°C，0?IMP壓力下滅菌25分鐘備用。
[0023] 實(shí)施例5
[0024] 液體培養(yǎng)基的制備：在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和L蔗糖，使吲哚丁酸 的終濃度為5. 0mg/L、萘乙酸的終濃度為1. 0mg/L、蔗糖的終濃度為30g/L，調(diào)pH= 5. 9,在 121°C，0?IMP壓力下滅菌25分鐘備用。
[0025] 實(shí)施例6
[0026] 液體培養(yǎng)基的制備：在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和L蔗糖，使吲哚丁酸 的終濃度為3. 0mg/L、萘乙酸的終濃度為0. 5mg/L、蔗糖的終濃度為35g/L，調(diào)pH= 6. 0,在 121°C，0?IMP壓力下滅菌25分鐘備用。
[0027]SH培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1.
[0028]表1SH培養(yǎng)基配方表
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種三七不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 三七不定根的誘導(dǎo)：取三七的愈傷組織，接種于固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、23-25?及 避光的條件下培養(yǎng)3-5周，得到帶有愈傷組織的三七不定根； (2) 三七不定根的繼代培養(yǎng)：將帶有愈傷組織的三七不定根轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，在 轉(zhuǎn)速為110_130r MirT1的搖床上，在無(wú)菌、23-25°C及光照條件下連續(xù)培養(yǎng)4-5周；繼代3-5 次。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三七不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法，其特征是所述固 體培養(yǎng)基為在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和瓊脂，使吲哚丁酸的終濃度為 3. 0-5. Omg/L、萘乙酸的終濃度為0. 5-1. Omg/L、蔗糖的終濃度為30-40g/L、瓊脂的終濃度 為 6-7g/L，pH = 5. 8-6. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三七不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法，其特征是所述液體 培養(yǎng)基為在SH培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖，使吲哚丁酸的終濃度為3. 0-5. Omg/ L、萘乙酸的終濃度為0. 5-1. Omg/L、蔗糖的終濃度為30-40g/L，pH = 5. 8-6. 0。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種三七不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟:(1)三七不定根的誘導(dǎo)：取三七的愈傷組織，接種于固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、23-25℃及避光的條件下培養(yǎng)3-5周，得到帶有愈傷組織的三七不定根；(2)三七不定根的繼代培養(yǎng):將帶有愈傷組織的三七不定根轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為110-130r·min-1的搖床上，在無(wú)菌、23-25℃及光照條件下連續(xù)培養(yǎng)4-5周；繼代3-5次。本發(fā)明利用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)三七不定根，其生長(zhǎng)速率快，并且其活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量高且比較穩(wěn)定，培養(yǎng)物較均一，同時(shí)，培養(yǎng)條件在人工控制下不受外界多變天氣及病蟲(chóng)害的影響。工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低廉，誘導(dǎo)率高，重復(fù)性好。
【IPC分類】A01H4-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104620986
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510075978
【發(fā)明人】高文遠(yuǎn), 王娟, 李金鑫, 李靜, 李建麗, 劉書(shū)杰
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月12日