養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)；3 - 4日后挑選長(zhǎng)出的典型而無雜 菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中央， 28°C恒溫培養(yǎng)10-15天得到強(qiáng)毒力的金龜子綠僵菌CQMa421母種。
[0019] 采用本發(fā)明增強(qiáng)毒力的方法馴化后的強(qiáng)毒力金龜子綠僵菌CQMa421菌株，對(duì)二化 螟致死率可提高53. 5%、達(dá)到100%，致死中時(shí)（LT5tl)縮短62. 6%，為4. 3天，效果非常突出。
[0020] 本發(fā)明具有如下的有益效果： 本發(fā)明金龜子綠僵菌CQMa421菌株能侵染二化螟，致死率可達(dá)到46. 5%，采用本發(fā)明增 強(qiáng)毒力的方法制得的金龜子綠僵菌CQMa421菌株，其致死率可達(dá)到100%，LT5tl縮短62. 6%， 效果非常突出。本發(fā)明金龜子綠僵菌制劑中各成分的有效配合、起到了協(xié)同增效作用，采 用本發(fā)明金龜子綠僵菌制劑兌水噴霧，對(duì)二化螟的田間防效達(dá)到80%以上，該制劑具有良 好的潤(rùn)濕分散特性、潤(rùn)濕時(shí)間< 60s，且保持了長(zhǎng)期儲(chǔ)存中的生物活性，貯存時(shí)間可達(dá)12個(gè) 月，非常適于規(guī)?；a(chǎn)和大面積推廣使用。
【附圖說明】
[0021] 圖I :CQMa421菌株及經(jīng)14次接種馴化后對(duì)二化螟的毒力致死圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0024] 實(shí)施例1 CQMa421菌株及經(jīng)接種二化螟毒力馴化后對(duì)二化螟的毒力 將CQMa421菌株接種在1/4SDA平板上，28°C培養(yǎng)15天，收集成熟分生孢子，用0. 05% (W/V)吐溫-80分散，配制成終濃度為I X IO7個(gè)孢子/ml的懸浮液。采用點(diǎn)滴法接種3-4 齡二化螟幼蟲，每頭試蟲用微量點(diǎn)樣器點(diǎn)滴藥劑2 y 1，接種100頭，接種后在室溫28°C，濕 度50-70%的條件下飼養(yǎng)。選擇最先感病死亡的二化螟僵蟲，放入28°C培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng) 3-5天，使其昆蟲表面生長(zhǎng)出新鮮孢子；收集孢子循環(huán)接種二化螟14次進(jìn)行馴化。在無菌 條件下，用接種環(huán)挑取馴化后新鮮孢子在含有100微克/毫升氨節(jié)青霉素的1/4SDA培養(yǎng)基 平板上劃線；將劃線好的培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)；3-4日后挑選長(zhǎng)出的典型 而無雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng) 基中央，28°C恒溫培養(yǎng)10-15天。馴化后的菌株按上述方法培養(yǎng)分生孢子、接種二化螟，以 原始菌株和清水為對(duì)照。重復(fù)3次。記錄死蟲數(shù)，計(jì)算累計(jì)死亡率，經(jīng)SPSS軟件LT 5tl(致死 中時(shí)）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0025] 從圖1可以看出，CQMa421能有效侵染二化螟，接種后7天，CQMa421菌株馴化前 對(duì)二化螟的致死率為46. 5%，LT5tl (致死中時(shí))為11. 5天；CQMa421菌株馴化后對(duì)二化螟的殺 蟲活性有明顯增強(qiáng)，接種后7天二化螟死亡率達(dá)到100%，較馴化前提高53. 5%，LT5tl為=4. 3 天，縮短62. 6%。
[0026] 實(shí)施例2納米硅對(duì)綠僵菌保護(hù)作用 按表1將金龜子綠僵菌CQMa421純孢子粉與納米硅先混合后，再加入40%硅藻土、 5%CMC和不同含量的吐溫-80、0P-10混勻。
[0027] 紫外保護(hù)作用：將制劑試樣用水分散配成濃度為I X IO7孢子/mL的孢懸液后，取 100 y 1孢子懸液涂布到1/4 SDA平板上，用玻璃推勻后在置于290-310nm紫外燈（978mW/ m2)下垂直照射5小時(shí)，再置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)24h小時(shí)，測(cè)定萌發(fā)率(方法同上)，重復(fù)3 次。用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。
[0028] 貯存實(shí)驗(yàn)：將制劑試樣后在28°C下密封保存2個(gè)月，用水分散配成濃度為IXIO7 孢子AiL的孢懸液后，測(cè)定萌發(fā)率(方法同上)，重復(fù)3次。用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分 析。
[0029] 表1納米硅對(duì)綠僵菌保護(hù)作用
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 金龜子綠僵菌CQMa421菌株在制備防治二化螟的藥劑中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述防治二化螟的藥劑由綠僵菌CQMa421 干孢子粉44-60%、硅藻土 30-40%、納米硅0. 5-1%、羧甲基纖維素鈉3-5%、吐溫-80 3-5%、和 OP-IO 3-5%組成，均以重量百分比。
3. -種金龜子綠僵菌制劑，其特征在于：它是由娃藻土 30-40%、納米娃0. 5-1%、羧甲基 纖維素鈉3-5%、吐溫-80 3-5%、0P-10 3-5%和綠僵菌CQMa421干孢子粉44-60%組成，均以 重量百分比。
4. 如權(quán)利要求3所述的金龜子綠僵菌制劑，其特征在于：所述吐溫-80和0P-10為純 度>95%的吐溫-80和0P-10 ;所述羧甲基纖維素鈉為純度大于95% ;所述硅藻土為白色至 淺褐色疏松粉末，純度大于85%、含水量小于1% ;所述納米硅的粒徑小于50nm ;所述綠僵菌 CQMa421干孢子粉為純孢子粉，含孢量多150億孢子/克、含水量< 5% ;以上均以質(zhì)量百分 含量計(jì)。
5. 如權(quán)利要求3或4所述金龜子綠僵菌制劑，其特征在于：它是由硅藻土 35-40%、納米 硅0. 5-0. 8%、羧甲基纖維素鈉3-5%、吐溫-80 3-5%、0P-10 3-5%和綠僵菌CQMa421干孢子 粉45-55%組成，均以重量百分比。
6. 如權(quán)利要求3、4或5所述金龜子綠僵菌制劑，其特征在于：所述綠僵菌CQMa421干 孢子粉為強(qiáng)毒力金龜子綠僵菌CQMa421孢子粉，所述強(qiáng)毒力金龜子綠僵菌CQMa421孢子粉 由以下方法得到：將金龜子綠僵菌CQMa421接種于3-4齡二化螟幼蟲，接種后在28°C、濕度 50-70%的條件下飼養(yǎng)，將最先感病死亡的二化螟僵蟲，放入28°C、濕度為50-70%培養(yǎng)箱中 保濕培養(yǎng)3-5天，使其昆蟲表面生長(zhǎng)出新鮮孢子，如上所述循環(huán)接種14次得到馴化后的金 龜子綠僵菌CQMa421新鮮孢子；在無菌條件下，用接種環(huán)挑取馴化后新鮮孢子在含有100微 克/毫升氨芐青霉素的1/4SDA培養(yǎng)基平板上劃線，將劃線好的培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于28°C恒溫 箱中培養(yǎng)；3-4日后挑選長(zhǎng)出的典型而無雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲 的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中央，28°C恒溫培養(yǎng)10-15天得到強(qiáng)毒力的金龜子 綠僵菌CQMa421母種，將CQMa421菌株母種接種在1/4SDA平板上，28°C培養(yǎng)15天，收集成 熟分生孢子制得綠僵菌CQMa421干孢子粉。
7. -種增強(qiáng)金龜子綠僵菌毒力的方法，其特征在于：將金龜子綠僵菌CQMa421接種于 3-4齡二化螟幼蟲，接種后在28°C、濕度50-70%的條件下飼養(yǎng)，將最先感病死亡的二化螟僵 蟲，放入28°C、濕度為50-70%培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)3-5天，使其昆蟲表面生長(zhǎng)出新鮮孢子，如 上所述循環(huán)接種14次得到馴化后的金龜子綠僵菌CQMa421新鮮孢子；在無菌條件下，用接 種環(huán)挑取馴化后新鮮孢子在含有100微克/毫升氨芐青霉素的1/4SDA培養(yǎng)基平板上劃線， 將劃線好的培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)；3- 4日后挑選長(zhǎng)出的典型而無雜菌的 菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中央，28°C 恒溫培養(yǎng)10-15天得到強(qiáng)毒力的金龜子綠僵菌CQMa421母種。
【專利摘要】金龜子綠僵菌CQMa421菌株在制備防治二化螟的藥劑中的應(yīng)用，該菌株生產(chǎn)的可濕性粉劑由硅藻土(30-40%)、納米硅（0.5-1%）、羧甲基纖維素鈉（3-5%）、吐溫-80（3-5%）、OP-10（3-5%）和綠僵菌CQMa421干孢子粉（44-60%）組成。具有良好的潤(rùn)濕性、貯存特性和抗紫外特性，能有效地控制了二化螟，且保持了長(zhǎng)期儲(chǔ)存中的生物活性，貯存時(shí)間可達(dá)12個(gè)月。CGMCC NO.460920110225
【IPC分類】C12N1-14, C12R1-645, A01N63-04, A01P7-04
【公開號(hào)】CN104738096
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510084151
【發(fā)明人】夏玉先, 彭國(guó)雄
【申請(qǐng)人】重慶聚立信生物工程有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年2月16日