增加到3%，所用材料： (1) 高羊茅：選取籽粒飽滿、大小均勾的多年生高羊茅arwfli/iflacea L )種 子為試驗材料； (2) 生活垃圾堆肥：來自天津市小淀堆肥廠，基本理化性質(zhì)為：pH 7. 62,飽和含水量 0.76 1111/^，容重0.85 8/1111，全氮5.18%，全鉀 50.83 8/1^，有效磷 77.92 11^/1^，有機質(zhì) 12. 12%，將垃圾堆肥去除其中的木頭、塑料、金屬等雜物，風(fēng)干后備用； (3) 土壤：剔除雜物，過2mm篩，放置于通風(fēng)口處2-3d，自然條件下風(fēng)干，其理化性質(zhì)為： pH7. 44,飽和含水量0. SSmLg-1，有機質(zhì)4. 68%，全氮0. 21%，含鹽量0. 29% ; (4) 鹽堿土：取自河北省黃驊市海邊pH 7. 85,有機質(zhì)2. 21%，全氮0.258%，有效磷 15. 26mgkg-1，全鉀 28. 96gkg-1，含鹽量 1. 58%。
[0012] 本發(fā)明進一步公開了采用耐鹽強化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護酶 的方法在提高高羊茅植株對鹽脅迫適應(yīng)性方面的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明更加詳細的描述： 1研制材料與方法 1. 1實驗材料 選取籽粒飽滿、大小均勾的多年生高羊茅arwfli/iflacea L )種子為試驗材 料。
[0014] 生活垃圾堆肥來自天津市小淀堆肥廠，基本理化性質(zhì)為：pH 7. 62,飽和含水量 0.76 1111/^，容重0.85 8/1111，全氮5.18%，全鉀 50.83 8/1^，有效磷 77.92 11^/1^，有機質(zhì) 12. 12%，將垃圾堆肥去除其中的木頭、塑料、金屬等雜物，風(fēng)干后備用。
[0015] 土壤基質(zhì)取自天津師范大學(xué)校院內(nèi)，剔除雜物，過2mm篩，放置于通風(fēng)口處2-3d， 自然條件下風(fēng)干，其理化性質(zhì)為：pH7. 44,飽和含水量0. SSmLg'有機質(zhì)4. 68%，全氮0. 21%， 含鹽量0. 29%。
[0016] 鹽堿土取自河北省黃驊市海邊pH 7. 85,有機質(zhì)2. 21%，全氮0.258%，有效磷 15. 26mgkg-1，全鉀 28. 96gkg-1，含鹽量 1. 58%。
[0017] 1.2納米堆肥的制備 將垃圾堆肥l〇5°C烘干至恒重，由秦皇島市太極環(huán)納米制品有限公司，利用改進的高能 球磨技術(shù)，通過罐體快速的多維擺動式運動，將垃圾堆肥加工研磨制成納米堆肥，備用。在 電鏡下通過粒徑分析，納米堆肥粒徑大小分布均勻，平均粒徑在30nm左右（圖1)。
[0018] 1. 3耐鹽微生物菌劑的制備 1.3. 1菌種的富集 將堆肥樣品稱取IOg置于無菌錐形瓶中，加入IOOmL無菌水振蕩均勾后，取IOmL懸浮 液于盛有IOOmL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28°C，220r/min下振蕩培養(yǎng)3d，即為混合微生物 菌群。
[0019] L 3. 2耐鹽微生物的強化 混合微生物菌群耐鹽強化采用的是逐步增加鹽濃度的方法，以減輕瞬間高濃度鹽對混 合菌株造成的沖擊和毒害。未經(jīng)過馴化的混合菌群一般在NaCl濃度為0. 5%的條件下生長 較好，而此次研宄的目標(biāo)NaCl濃度為3%，即在本研宄中NaCl的濃度分別為0. 5%、1%、1. 5%、 2%、2. 5%和3%。在馴化過程中，視OD6c?增長而逐步提高鹽濃度，NaCl的濃度以0. 5%的梯度 增加到3%，每增加一次NaCl的濃度，要待菌體增長量穩(wěn)定后，才能繼續(xù)增加 NaCl的濃度，逐 級馴化出耐鹽混合微生物菌群。
[0020] 1. 3. 3強化耐鹽微生物的分離及純化 1. 3. 3. 1稀釋涂布平板法 1)倒平板：將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏（PDA)瓊脂培養(yǎng) 基高溫滅菌，冷卻至55-60°C時，在馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液(最終質(zhì)量濃度為 0.3%)，混均勻后分別倒平板。
[0021] 2)制備混合微生物稀釋液：用移液槍吸取Iml強化后的混合微生物菌懸液加入盛 有9ml無菌水的大試管中充分混勾，此為KT1稀釋液，以此類推制成10'10'10'KT5和 1〇_6幾種濃度的稀釋液。
[0022] 3)涂布：用移液槍分別吸取0. 2ml不同濃度的稀釋菌懸液準確放入相應(yīng)培養(yǎng)基平 板中央，每個不同濃度梯度處理重復(fù)3次。用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。
[0023] 4)培養(yǎng)：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將含高氏I號培養(yǎng)基和馬 丁氏培養(yǎng)基（PDA)的平板倒置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5 d。
[0024] 1. 3. 3. 2平板劃線分離法 挑菌落：將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許菌苔在新的上述3種培養(yǎng)基上進行劃 線純化。直到培養(yǎng)基上長出來的是純種，如不純，仍需重復(fù)該步驟，最后得到3個菌種。
[0025] 1.3. 4強化微生物的鑒定 按照試劑盒的操作手冊提取優(yōu)勢菌種的DNA。優(yōu)勢細菌的PCR體系：10XBuffer(with MgCl2)2 μL，dNTP (10mmol/L)0.4pL，341f (1〇μπιο1/1)?μL，534ι· (10Mmol/L)lPL，Taq 酶（5u/>L) 0. 4μL，模板DNAIPL，加超純水定容至終體積2〇μL。PCR反應(yīng)條件：94°C 5min 預(yù)變性，94°0變性11^11，55°0復(fù)性458,72°0延伸458,30個循環(huán)，72°0延伸1〇1^11。引物為 34If (5，-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')和 534r (5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')。優(yōu)勢真菌的 PCR 反應(yīng)體系： IOXBuffer (without MgCl2)2 μL,MgCl2 (25mmol/L)l. 6μL, dNTP (10mmol/L)0. 4μL,GeolI (l〇Mmol/L) 0· 4μL，GeoA2 (l〇Mmol/L) 0· 4μL，Taq 酶（5u/>L) 0· 2μL，模板 DNA ?μL，加超純 水定容至終體積2〇μL。PCR反應(yīng)條件：94°C 4min預(yù)變性，94°C變性lmin，54°C復(fù)性lmin， 72°C延伸 2min，30 個循環(huán)，72°C延伸 7min。引物為 GeoA2 (5' -CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3')和 Geoll (5' -ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3'）。將得到的 PCR 產(chǎn)物送到 北京華大基因測序部，根據(jù)測序的結(jié)果，在BLAST系統(tǒng)中找出對應(yīng)菌種。
[0026] 對上述3菌種通過對其菌落形態(tài)觀察，結(jié)合分子鑒定結(jié)果（PCR序列相似度)比較， 鑒定結(jié)果分別為：枯草芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌和產(chǎn)黃青霉。
[0027] 表1強化耐鹽微生物鑒定結(jié)果
【主權(quán)項】
1. 一種采用耐鹽強化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護酶的方法，其特征在于 按如下的步驟進行：（1)將土壤與鹽堿土過篩除雜，按一定比例制成輕度0. 3%、中度0. 6%和 重度0. 9%鹽堿土，將混合好的鹽堿土在121°C下滅菌30min備用； (2) 步驟（1)鹽堿土 3〇-35nm納米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml強化耐鹽微生 物菌劑；所述的強化耐鹽微生物菌劑NaCl的濃度以0. 5%的梯度增加到3% ;耐鹽微生物指 的是：枯草芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌和產(chǎn)黃青霉按體積比1:1:1的比例配制成； (3) 以混合好的步驟2的土壤基質(zhì)進行草坪植物栽培試驗，實驗時基質(zhì)用量為 9400gm_2,草皮基質(zhì)厚度為15mm，高羊茅草種播種量為160gm_2,將種子浸泡24h后均勻 播灑于基質(zhì)表層，首先進行黑暗處理，充分澆水保證萌發(fā)，萌發(fā)后進行培養(yǎng)，光照強度為 450-700ymol.nT2.s'期間早晚定期澆一次水，經(jīng)常調(diào)換培養(yǎng)草皮的位置以保證光照一致， 室內(nèi)的相對濕度為40-55%，溫度為20-25 °C，實驗進行50d后進行植物各指標(biāo)的測定。
2. 權(quán)利要求1所述采用耐鹽強化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護酶的方法， 其中 (1) 納米堆肥的制備：將生活垃圾堆肥105°C烘干至恒重，將垃圾堆肥加工研磨制成 3〇-35nm納米堆肥，備用； (2) 草皮建植： 將土壤與鹽堿土過篩除雜，按一定比例制成輕度0. 3%、中度0. 6%和重度0. 9%鹽堿土， 將混合好的鹽堿土在121 °C下滅菌30min備用； 每個脅迫設(shè)3個處理，三個脅迫所設(shè)處理相同，分別為： 1) 以100% 土壤為對照基質(zhì)并加入15ml空白培養(yǎng)基 2) 土壤和納米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml空白培養(yǎng)基 3) 土壤和納米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml強化耐鹽微生物菌劑 (3) 以混合好的土壤為基質(zhì)進行草坪植物栽培試驗，實驗時基質(zhì)用量為9400gnT2,草皮 基質(zhì)厚度為15mm，高羊茅草種播種量為160gnT2,將種子浸泡24h后均勻播灑于基質(zhì)表層， 首先進行黑暗處理，充分澆水保證萌發(fā)，萌發(fā)后進行培養(yǎng)，光照強度為450-700ymol.nT2. s'期間早晚定期澆一次水，經(jīng)常調(diào)換培養(yǎng)草皮的位置以保證光照一致，室內(nèi)的相對濕度為 40-55%，溫度為20-25 °C，實驗進行50d后進行植物各指標(biāo)的測定。
3. 權(quán)利要求1所述采用耐鹽強化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護酶的方法， 其中所述的逐步增加鹽濃度的方法指的是：NaCl的濃度分別為0. 5%、1%、1. 5%、2%、2. 5%和 3%，在馴化過程中，視0D_增長而逐步提高鹽濃度，NaCl的濃度以0. 5%的梯度增加到3%。
4. 權(quán)利要求1所述采用耐鹽強化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護酶的方法 在提高草坪植物耐鹽性方面的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述采用耐鹽強化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護酶的方法 在提高高羊茅植株對鹽脅迫適應(yīng)性方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了采用耐鹽強化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護酶的方法。它是從堆肥中提取耐鹽微生物，將篩選得到純種耐鹽微生物，采用逐步提高NaCl的濃度方法進一步強化練制成強化耐鹽菌劑，與納米堆肥聯(lián)合施用于鹽堿土草坪基質(zhì)中。實驗設(shè)計輕度、中度和重度三種鹽脅迫處理，實現(xiàn)強化微生物聯(lián)合納米堆肥增強草坪草的抗鹽性，目的為研制高效肥料，以達到調(diào)節(jié)草坪草的在鹽脅迫下保護酶活性的增強，以達到促進鹽堿土草坪建植效果的目的。
【IPC分類】A01G7-06, A01G1-00, C05F17-00, C05G3-00
【公開號】CN104838842
【申請?zhí)枴緾N201510186570
【發(fā)明人】趙樹蘭, 多立安, 劉春湘
【申請人】天津師范大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月20日