一種利用莖尖組織高效繁殖大花蕙蘭種苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用莖尖組織高效繁殖大花蕙蘭種苗的方法，特別涉及一種可以使種苗生長發(fā)育更加健壯，新根纏結(jié)比率降低，種苗變異率降低的組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大花蕙蘭(Cymbidium hubridum)是以蘭屬中一些大花型附生種為親本經(jīng)過多代雜交選擇培育出來的花型大、色彩鮮艷、生長健壯的優(yōu)良品種群。大花蕙蘭姿態(tài)優(yōu)美，葉長碧綠，花姿粗礦，花期長達2-3個月，是極重要的室內(nèi)觀賞植物，是世界著名的“蘭花新星”，兼具國蘭的幽香典雅和洋蘭的豐富多彩，在國際花丼市場十分暢銷，深受世界各地人們的喜愛。
[0003]目前，生產(chǎn)上主要以無病毒健壯母株側(cè)芽的莖尖為外植體，通過原球莖和叢生芽途徑大量繁殖大花蕙蘭種苗。工廠化生產(chǎn)大花蕙蘭種苗主要存在以下四個問題:
[0004]一是，采用側(cè)芽的莖尖進行繁殖時，若莖尖組織太大，消毒往往不徹底、消毒成功率極低，同時莖尖組織吸收營養(yǎng)物質(zhì)較慢，培養(yǎng)期間容易褐化。若莖尖組織太小，生活力大大降低，培養(yǎng)后期易死亡，導致原球莖誘導率較低。
[0005]二是，大花蕙蘭增殖階段原球莖極易變異，玻璃化現(xiàn)象較嚴重，這種原球莖后期難以分化芽。
[0006]三是，大花蕙蘭分化階段一部分原球莖會逐漸僵化，主要表現(xiàn)為基部假鱗莖會異常肥大，不分化葉，或者即使能分化葉，但葉片較小，不能進一步生長發(fā)育，導致原球莖分化的芽變異，產(chǎn)生大量的僵化苗。
[0007]四是，大花蕙蘭生根壯苗階段種苗變異率較高，種苗不夠健壯，會產(chǎn)生較多不同類型的變異種苗，比如葉片互生或叢生排列的十字架苗、莖節(jié)間過長的竹竿苗。另外，種苗新根纏結(jié)比率高，不易分開，不利于后期溫室移栽馴化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對以上缺點，對其進行大規(guī)模的技術(shù)革新，提供一種利用莖尖組織高效繁殖大花蕙蘭種苗的方法，優(yōu)化外植體消毒方法及外植體選擇切割技術(shù)，設計高效的誘導、增殖、分化、生根壯苗階段的培養(yǎng)基配方，從而達到提高莖尖組織消毒成功率、原球莖誘導率；降低原球莖變異率與玻璃化率；降低分化芽變異率；使得種苗生長發(fā)育更加健壯，新根纏結(jié)比率降低，根系更加分散與伸展，同時種苗變異率降低的目的。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0010]一種利用莖尖組織高效繁殖大花蕙蘭種苗的方法，包括以下步驟:
[0011]步驟a，外植體的選取，切取大花蕙蘭母株基部長出的6_12cm的健壯側(cè)芽；
[0012]步驟b，側(cè)芽消毒，對切取的側(cè)芽進行消毒，切下莖尖組織作為培養(yǎng)的外植體；
[0013]步驟c，原球莖誘導培養(yǎng)，將外植體接種到原球莖誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30-60天，誘導得到原球莖；所述誘導培養(yǎng)基的成分包括:花寶3號l_3g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.5-1.5g/L，活性炭 0.5-1.5g/L，瓊脂 6_8g/L，蔗糖 15_24g/L ；
[0014]步驟d，原球莖增殖培養(yǎng)，將誘導形成的原球莖團切割成小塊，每塊含3-5個原球莖，接種到增殖培養(yǎng)基中，逐漸形成新的原球莖，反復切割增殖，每30-40天繼代轉(zhuǎn)接一次；所述增殖培養(yǎng)基的成分與誘導培養(yǎng)基成分相同；
[0015]步驟e，原球莖分化培養(yǎng)，將增殖階段形成的原球莖團切割成小塊，每塊含5-10個原球莖，接種到分化培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)，原球莖分化出新葉新根；所述分化培養(yǎng)基的成分包括:花寶3號l_3g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.4-1.0g/L，TDZ (噻苯隆)0.05-0.15mg/L，活性炭 0.5-1.5g/L，瓊脂 5_9g/L，蔗糖 13_26g/L。
[0016]步驟f，生根壯苗培養(yǎng)，切取分化培養(yǎng)后高5-6cm的芽，接種到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到生長健壯的種苗，其中生根壯苗培養(yǎng)基的成分包括:花寶I號l_4g/L，硝酸鉀0.7-2.lg/L，七水硫酸亞鐵18-32mg/L，二水乙二胺四乙酸二鈉30_43g/L，水解酪蛋白2_4g/L，腺嘌呤 0.5-1.5g/L，土豆泥 12_28g/L，香蕉泥 35_65g/L，椰子汁 50_150mL，活性炭0.5-1.5g/L，瓊脂 6-8g/L，蔗糖 14_27g/L。
[0017]進一步，步驟b中，對側(cè)芽進行消毒的方法包括以下步驟:
[0018]將切取的側(cè)芽用流水沖洗干凈，層層剝?nèi)?cè)芽外層葉片，切除側(cè)芽基部木質(zhì)化組織，直到剩下6-8片葉，繼續(xù)用流水沖洗干凈，然后用12%的次氯酸鈣消毒15min，用吸水紙吸干表面水分，拿到無菌工作臺上進一步消毒；
[0019]繼續(xù)剝?nèi)デo尖外層葉片，直到剩下3-5片葉，然后用5%的次氯酸鈣消毒12min，無菌水沖洗3-5次；
[0020]繼續(xù)剝外層葉片，直到剩下1-2片葉，然后用1%次氯酸鈣消毒6min，無菌水沖洗3-5次，用吸水紙吸干表面水分；
[0021]在顯微鏡下面，小心剝?nèi)ドL點外層的幼葉，直到露出生長點；
[0022]切下含生長點的莖尖組織，約2_3mm大小，作為培養(yǎng)的外植體。
[0023]進一步，將含生長點的莖尖組織從中心均勻切成4小塊(十字切法)，或者2小塊(一分為二法)，每塊單獨接種到誘導培養(yǎng)基中。
[0024]進一步，所述誘導培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的成分包括:花寶3號2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，活性炭lg/L，瓊脂7g/L，蔗糖20g/L。
[0025]進一步，所述分化培養(yǎng)基的成分包括:花寶3號2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L, TDZ0.lmg/L，活性炭 lg/L，瓊脂 7g/L，鹿糖 20g/L。
[0026]進一步，生根壯苗培養(yǎng)基的成分包括:花寶I號l_4g/L，硝酸鉀0.7-2.lg/L,七水硫酸亞鐵18-32mg/L，二水乙二胺四乙酸二鈉30_43mg/L，水解酪蛋白2_4g/L，腺嘌呤
0.5-1.5g/L，土豆泥 12-28g/L，香蕉泥 35_65g/L，椰子汁 100ml/L，活性炭 0.5-1.5g/L，瓊脂6-8g/L，鹿糖 14-27g/L。
[0027]優(yōu)選的，生根壯苗培養(yǎng)基的成分包括:花寶I號2g/L，硝酸鉀1.5g/L，七水硫酸亞鐵27.8mg/L，二水乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，土豆泥20g/L，香蕉泥50g/L，椰子汁100ml/L，活性炭lg/L，瓊脂7g/L，蔗糖20g/L。
[0028]總之，本發(fā)明的有益效果為:
[0029]本發(fā)明提供的大花蕙蘭組織培養(yǎng)方法，首先，增殖階段，采用本發(fā)明配制的培養(yǎng)基，能顯著降低原球莖變異率、玻璃化率。
[0030]分化階段，采用本發(fā)明配制的培養(yǎng)基，能顯著降低分化芽的變異率，減少僵化苗數(shù)量。
[0031]生根壯苗階段，采用本發(fā)明配制的培養(yǎng)基，可使種苗生長發(fā)育更加健壯，新根纏結(jié)比率降低，根系更加分散與伸展，同時降低種苗變異率。
[0032]進一步，采用本發(fā)明的消毒方法及外植體選擇切割技術(shù)可以提高莖尖組織消毒成功率，同時增加莖尖組織與培養(yǎng)基接觸面積，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，降低褐化率，提高原球莖誘導率。
【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述。
[0034]實施例1
[0035]誘導培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的成分如下:
[0036]花寶3號2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，活性炭lg/L，瓊脂7g/L，蔗糖20g/L0
[0037]實施例2
[0038]誘導培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的成分包括:
[0039]花寶3號lg/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.5g/L，活性炭0.5g/L，瓊脂6g/L，蔗糖15g/Lo
[0040]實施例3
[0041]誘導培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的成分包括:
[0042]花寶3號3g/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.5g/L，活性炭1.5g/L，瓊脂8g/L，蔗糖24g/Lo
[0043]實施例4
[0044]分化培養(yǎng)基的成分包括:
[0045]花寶3號2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，TDZ0.lmg/L,活性炭lg/L，瓊脂7g/L，鹿糖 20g/L。
[0046]實施例5
[0047]分化培養(yǎng)基的成分包括:
[0048]花寶3號lg/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.4g/L，TDZ0.05mg/L，活性炭0.5g/L，瓊脂 5g/L，鹿糖 13g/Lo
[0049]實施例6
[0050]分化培養(yǎng)基的成分包括:
[0051]花寶3號3g/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.0g/L，TDZ0.15mg/L，活性炭1.5g/L，瓊脂 9g/L，鹿糖 26g/L。
[0052]實施例7
[0053]生根壯苗培養(yǎng)基的成分包括:
[0054]花寶I號2g/L，硝酸鉀1.5g/L，七水硫酸亞鐵27.8mg/L，二水乙二胺四乙酸二鈉37.3g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤lg/L，土豆泥20g/L，香蕉泥50g/L，椰子汁100ml/L，活性炭 lg/L，瓊脂 7g/L，鹿糖 20g/L。
[0055]實施例8
[0056]生根壯苗培養(yǎng)基的成分包括:
[0057]花寶I號lg/L，硝酸鉀0.7g/L，七水硫酸亞鐵18mg/L，二水乙二胺四乙酸二鈉30mg/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.5g/L，土豆泥12g/L，香蕉泥35g/L，椰子汁50ml/L，活性炭 0.5g/L，瓊脂 6g/L，鹿糖 14g/Lo
[0058]實施例9
[0059]生根壯苗培養(yǎng)基的成分包括:
[0060]花寶I號4g/L，硝酸鉀2.lg/L,七水硫酸亞鐵32mg/L，二水乙二胺四乙酸二鈉43mg/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.5g/L，土豆泥28g/L，香蕉泥65g/L，椰子汁150ml/L，活性炭1.5g/L，瓊