一種cik細(xì)胞凍存液及凍存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞凍存技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新型CIK細(xì)胞凍存液及凍存方法。 本發(fā)明通過添加人自體血漿，避免了外源血清存在的傳染病的風(fēng)險(xiǎn)，所采用的試劑適用于 程序降溫盒這種簡(jiǎn)單的程序降溫方法。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)單，細(xì)胞復(fù)蘇活性高的特點(diǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] CIK細(xì)胞，即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine-Induced Killer，CIK)是一種 新型的免疫活性細(xì)胞，CIK增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞毒作用強(qiáng)，具有一定的免疫特性。由于該細(xì)胞 同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細(xì)胞（自然殺傷細(xì)胞）樣T淋巴細(xì)胞， 兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性，和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。該細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì) 胞的識(shí)別能力很強(qiáng)，如同"細(xì)胞導(dǎo)彈"，能精確"點(diǎn)射"腫瘤細(xì)胞，但不會(huì)傷及"無(wú)辜"的正常 細(xì)胞。尤其對(duì)手術(shù)后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細(xì)胞擴(kuò) 散和復(fù)發(fā)，提高機(jī)體免疫力，因此，CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代的腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首 選方案。
[0003] 在生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的當(dāng)今，人們?cè)诩?xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的研宄中，越來 越多的運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)增殖技術(shù)，將有研宄意義或有應(yīng)用前景的細(xì)胞采用低溫度進(jìn)行長(zhǎng)期保 存數(shù)年，數(shù)十年甚至百年，一旦需要，可隨時(shí)對(duì)所保存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)其完整的形態(tài) 結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性，供生命科學(xué)研宄實(shí)驗(yàn)。
[0004] CIK細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺瘤活性，具有TIL、LAK細(xì)胞無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，但誘導(dǎo)CIK細(xì) 胞需要花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間，在臨床應(yīng)用上需要多次誘導(dǎo)和采血，給患者造成了極大的痛苦和 不必要的麻煩。也有人提出將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CIK細(xì)胞像其他傳代細(xì)胞一樣低溫保存，需要 時(shí)再?gòu)?fù)蘇。但是現(xiàn)有的技術(shù)使得復(fù)蘇的細(xì)胞活性偏低，達(dá)不到我們高效增值的目的。
[0005] 目前現(xiàn)有的技術(shù)不足：現(xiàn)有的凍存液包括含血清凍存液與不含血清凍存液兩種。 血清富含CIK細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種細(xì)胞因子及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是其他培養(yǎng)基所不能比擬的。所 以不含血清的凍存液使得凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后活性降低，根本達(dá)不到我們高效增值的目的。 而使用血清又存在著自體血清很難獲取，外源血清有傳染病的風(fēng)險(xiǎn)。而且，現(xiàn)有凍存程序復(fù) 雜，不利于實(shí)際操作的進(jìn)行。
[0006] 本發(fā)明首次提出使用人自體血漿替代血清，與培養(yǎng)基、二甲基亞砜以4:5:1比例 配比，制成CIK細(xì)胞凍存液，然后采用程序降溫盒這種簡(jiǎn)單的程序降溫辦法完成凍存。人自 體血漿與血清成分相似，亦含有CIK細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種細(xì)胞因子及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且屬于 CIK細(xì)胞分離的副產(chǎn)物，方便獲取，又不存在異源性，所以本發(fā)明將成為CIK細(xì)胞凍存的首 選方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種CIK細(xì)胞的凍存液及凍存方法。
[0008] 本發(fā)明中一些常用的術(shù)語(yǔ)說明如下： PBMC:外周血單個(gè)核細(xì)胞； IL-2 :白細(xì)胞介素2 ; IL-1 a :白細(xì)胞介素1 a ; IFN-y :干擾素y ; CD3mAb:細(xì)胞表面分子3單克隆抗體； CD28mAb:細(xì)胞表面分子28單克隆抗體； DMSO:二甲基亞砜。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種CIK細(xì)胞凍存液及凍存方法，其特征在于如下步驟： (1)將人自體血漿置于無(wú)菌離心管中，1800rpm離心6分鐘。
[0010] (2)吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3000rpm離心20分鐘，吸取上清，即為凍 存用人自體血漿。
[0011] (3)將二甲基亞砜、上述人自體血漿、培養(yǎng)基X-VIV015按體積比1:4:5混勻即為 CIK細(xì)胞凍存液。
[0012] (4)取培養(yǎng)至第7天的CIK細(xì)胞，1800rpm離心6分鐘，棄上清，加入上述CIK細(xì)胞 凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1*1〇 8個(gè)/mL，取5mL加入5mL無(wú)菌凍存管中。將凍存管放入在4 度冰箱預(yù)冷的程序降溫盒中。
[0013] (5)將放有凍存管的程序降溫盒置于-80度冰箱中24小時(shí)后，再放于液氮中長(zhǎng)期 保存。
[0014] 其中，步驟（4)提到的培養(yǎng)至第7天的CIK細(xì)胞獲取方法包括如下步驟： ① 從外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，重懸于X-VIV015無(wú)血清培養(yǎng)基中，使外周血單 個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞濃度為1 X 106個(gè)/mL，靜置培養(yǎng)3天； ② 向步驟①制得的培養(yǎng)液中補(bǔ)加X-VIV015無(wú)血清培養(yǎng)基至100mL，同時(shí)添加IL-2,使 IL-2的濃度為1 X 103U/mL，靜置培養(yǎng)1天； ③ 向步驟②制得的培養(yǎng)液中補(bǔ)加X-VIV015無(wú)血清培養(yǎng)基至200-240mL，同時(shí)添加 IL-2,使IL-2的濃度為IX 103U/mL，靜置培養(yǎng)3天；制得處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子CIK細(xì)胞。
[0015] 其中，所述X-VIV015無(wú)血清培養(yǎng)基添加了以下組分：rhIFN-y 1000U/mL、胸腺法 新 500ng/mL、rhlL-la 100U/mL、CD3mAb 100ng/mL、CD28mAb 100ng/mL。
[0016] 其中，所述靜置培養(yǎng)條件為在溫度為37°C、C02體積百分比為含量為7. 5%、相對(duì)飽 和濕度為1〇〇 %的〇)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0017] 本發(fā)明的方法是經(jīng)過篩選的，篩選過程如下： (1)二甲基亞砜：人自體血漿：培養(yǎng)基=1:2:7 ; ⑵二甲基亞砜：人自體血漿：培養(yǎng)基=1:3:6 ; (3) 二甲基亞砜：人自體血漿：培養(yǎng)基=1:4:5 ; (4) 二甲基亞砜：人自體血漿：培養(yǎng)基=1:5:4。
[0018] 為此，本發(fā)明提出了以下四種篩選條件。
[0019] 實(shí)驗(yàn)條件1: (1)將人自體血漿置于無(wú)菌離心管中，1800rpm離心6分鐘。
[0020] (2)吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3000rpm離心20分鐘，吸取上清，即為凍 存用人自體血漿。
[0021] (3)將二甲基亞砜、上述人自體血漿、培養(yǎng)基X-VIV015按體積比1:2:7混勻即為 CIK細(xì)胞凍存液。
[0022] (4)取培養(yǎng)至第7天的CIK細(xì)胞，1800rpm離心6分鐘，棄上清，加入上述CIK細(xì)胞 凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1*1〇 8個(gè)/mL，取5mL加入5mL無(wú)菌凍存管中。將凍存管放入在4 度冰箱預(yù)冷的程序降溫盒中。
[0023] (5)將放有凍存管的程序降溫盒置于-80度冰箱中24小時(shí)后，將凍存管放于液氮 中長(zhǎng)期保存。
[0024] (6)從液氮中取出凍存的CIK細(xì)胞，常規(guī)方法，置37°C水浴2min左右速溶，用臺(tái)盼 藍(lán)法檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞活性，計(jì)算復(fù)蘇細(xì)胞活率。
[0025] 對(duì)比實(shí)驗(yàn)條件1 : (1)將人自體血漿置于無(wú)菌離心管中，1800rpm離心6分鐘。
[0026] (2)吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3000rpm離心20分鐘，吸取上清，即為凍 存用人自體血漿。
[0027] (3)將二甲基亞砜、上述人自體血漿、培養(yǎng)基X-VIV015按體積比1:2:7混勻即為 CIK細(xì)胞凍存液。
[0028] (4)取培養(yǎng)至第7天的CIK細(xì)胞，1800rpm離心6分鐘，棄上清，加入上述CIK細(xì)胞 凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1*1〇 8個(gè)/mL，取5mL加入5mL無(wú)菌凍存管中。按照溫度下降速度 為10攝氏度/小時(shí)的速率將凍存管置-20°C，2小時(shí)，置-40°C，2小時(shí)，置-80°C，2小時(shí)，然 后浸入液態(tài)氮中長(zhǎng)期保存。
[0029] (5)從液氮中取出凍存的CIK細(xì)胞，常規(guī)方法，置37°C水浴2min左右速溶，用臺(tái)盼 藍(lán)法檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞活性，計(jì)算復(fù)蘇細(xì)胞活率。
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