一種三倍體矮牽牛的培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于園藝植物遺傳育種領(lǐng)域，特別涉及一種三倍體矮牽牛的培育方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 矮牽牛（Petunia hybrida Vilm.)為前科碧冬前屬植物，為一年生草本花丼。矮 牽?；ǘ浯T大，色彩豐富，花型變化頗多，目前矮牽牛在國際上已成為主要的盆花和裝飾植 物，廣泛應(yīng)用于庭院、露天花壇、廣場的美化裝飾與綠化，被喻為"世界花壇花卉之王"。我國 矮牽牛于20世紀初開始少量引種栽培，80年代逐漸從歐美等國引進新品種進行規(guī)模種植， 現(xiàn)在隨著經(jīng)濟發(fā)展和城市建設(shè)需要對矮牽牛需求越來越大，目前國內(nèi)廣泛種植的優(yōu)良矮牽 牛品種如重瓣"雙瀑布"系列、大花"夢幻"系列、多花單瓣"慶典"系列和吊藍等系列都為國 外培育的二倍體品種。
[0003] 通過倍性育種可使植物基因組多倍化獲得生長勢旺盛、適應(yīng)性強、抗逆性好的品 種，應(yīng)用于觀賞植物可提高花卉的觀賞性與品質(zhì)。三倍體是指體細胞中含有三個染色體 組，不但具有多倍體的優(yōu)良特性而且可以利用雜種優(yōu)勢、獲得無籽果實，并且作為遺傳育種 橋梁材料選育出的系列單體和三體可應(yīng)用于染色體上基因定位、確定基因連鎖群等遺傳研 究。培育三倍體一般先誘導(dǎo)形成遺傳穩(wěn)定的四倍體，再由四倍體和二倍體雜交獲得三倍體， 此法育種周期較長。迄今為止，還沒有三倍體矮牽牛（2n = 3x = 21)培育方法的公開報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種三倍體矮牽牛的培育方法。此種 方法育種周期短、操作簡便誘變效率高。
[0005] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種三倍體矮牽牛的培育方法， 該方法包括如下步驟：
[0006] 1)選擇雜交優(yōu)勢較強的二倍體組合作為親本，按常規(guī)技術(shù)種植；
[0007] 2)在親本進入花期時，用化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)父本植株上的花蕾，使之產(chǎn)生2n花粉；
[0008] 3)誘導(dǎo)后花蕾縱軸長度生長至1. 5cm~2. 6cm時，采摘放置于低溫、干燥、黑暗處 保存；
[0009] 4)雜交前對母本進行去雄處理，將步驟3)中誘導(dǎo)花蕾中的2n花粉取出，涂于母本 去雄花蕾的柱頭上，植株結(jié)實后得到F1雜交種子；同時將父本沒有經(jīng)過誘導(dǎo)處理的n花粉 涂于母本去雄花蕾的柱頭上，植株結(jié)實后得到對照二倍體 Fl雜交種子；
[0010] 5)將Fi雜交種子生長至成植，篩選出三倍體植株。
[0011] 其中，上述的化學(xué)誘導(dǎo)劑為秋水仙素、氨磺靈和氟樂靈的混合藥液。秋水仙素的最 終質(zhì)量濃度為0. 1%~0. 5%，氨磺靈最終質(zhì)量濃度為20mg. L 1~50mg. L \氟樂靈最終質(zhì) 量濃度為50mg. L 1~100mg. L、
[0012] 其中，上述步驟2)誘導(dǎo)的方法為：上午8~10時溫室大棚內(nèi)溫度控制在22~ 33°C，選擇父本植株上縱軸長度為2. 2mm~3. 4mm花蕾，用微量注射器將化學(xué)誘導(dǎo)劑混合藥 液注入花蕾內(nèi)，每次10~15yL，連續(xù)1~3天。
[0013] 步驟3)具體方法為：采摘經(jīng)誘導(dǎo)處理縱軸長度生長至1. 5cm~2. 6cm的花蕾，放 置于密閉的容器中（內(nèi)含無水氯化鈣或無水硫酸鎂或硅膠等干燥劑），并用黑色遮光物覆 蓋，將容器放置于冷柜中溫度設(shè)置為3~10°C，可存放1~3天，等待授粉的合適時機。
[0014] 步驟4)中，雜交前對母本進行去雄處理，是指雜交前選擇母本植株上縱軸長度達 2. 5厘米或以上的未開花花蕾，對花蕾進行去除雄蕊后套袋隔離，1~3天后進行雜交授粉； 父本沒有經(jīng)過經(jīng)過誘導(dǎo)處理的n花粉，是指選擇父本植株上沒有經(jīng)化學(xué)藥劑處理、縱軸長 度達2. 5厘米或以上的未開花花蕾，進行套袋隔離，1~2天后取花粉進行授粉。
[0015] 其中，上述步驟5)的篩選方法為：將匕雜交種、對照二倍體Fi雜交種按常規(guī)技術(shù) 種植，成株后先進行農(nóng)藝性狀、解剖學(xué)比較，選擇多倍體特征明顯的植株，再進行細胞學(xué)染 色體檢測確定三倍體植株。
[0016] 其中，上述步驟1)中雜交優(yōu)勢較強的二倍體組合是指匕雜交后代的株高、冠幅、 莖粗、葉面積、開花數(shù)的農(nóng)藝性狀超過雙親。
[0017] 其中，上述步驟3)中，低溫、干燥黑暗處是指3~10°C、干燥劑干燥和遮光。
[0018] 其中，上述步驟5)中農(nóng)藝性狀為：葉片長度與寬度、葉面是否扭曲、莖粗、株高、冠 幅、萼片長度與寬度、柱頭和花藥大小、花瓣直徑、花瓣邊緣褶皺程度。
[0019] 步驟5)農(nóng)藝性狀鑒定指，在Fi雜交群體中選擇第5~10片真葉平均長度與寬 度、主莖粗、株高、冠幅、萼片長度與寬度、柱頭直徑、花藥長度與寬度、花瓣直徑其中有任意 5項或5項以上數(shù)值顯著大于對照二倍體匕雜交種，同時葉面扭曲、花瓣邊緣波狀褶皺程度 明顯大于對照二倍體匕雜交種的植株。
[0020] 其中，上述步驟5)中解剖學(xué)觀察性狀有氣孔和花粉細胞，觀察氣孔方法為：將葉 片背面表皮撕下，在顯微鏡下測量表皮氣孔大??；觀察花粉細胞方法為：對成熟花粉進行 染色，在顯微鏡鏡下測量成熟花粉細胞大小。解剖學(xué)中氣孔鑒定指，用尖頭鑷子將葉片背面 表皮撕下，放置于載玻片上，滴1~2滴清水在20或40倍顯微鏡下用具有顯微測微標尺的 目鏡測量氣孔長與寬度，選擇長、寬度顯著大于對照二倍體匕雜交種的植株。
[0021] 花粉細胞鑒定指：從開放花朵中取少量成熟花粉，放置于載玻片上，滴1~2滴質(zhì) 量濃度為1%醋酸洋紅染色3~5分鐘，在20或40倍顯微鏡下用具有顯微測微標尺的目鏡 測量花粉細胞大小，選擇花粉平均直徑、不育花粉率（形狀畸形和不染色）明顯大于對照二 倍體？ 1雜交種的植株。
[0022] 其中，上述步驟5)中細胞學(xué)染色體檢測方法為：
[0023] 晴天上午8~10時取長度3. 1~7. 3謹?shù)挠桌?，立即放入裝有0? 002mol. L V羥 基喹啉水溶液0~10°C容器中，放置在0~10°C的冷柜中預(yù)處理1~5小時，蒸餾水沖洗 3~5次后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定12~24小時，蒸餾水沖洗3~5次，lmol. L iCl溶液 50~60°C水浴解離3~6分鐘，蒸餾水沖洗3~5次用濾紙吸干水，放入體積百分濃度為 45%的醋酸溶液配制的質(zhì)量濃度1 %的洋紅染色液染色12~24小時，用鑷子將幼蕾移入干 凈的載玻片上，用刀片切取雌蕊子房，用鑷子取子房中心部位少量分生組織，放置于載玻片 上，滴1~2滴1%洋紅染色液，蓋上蓋玻片，先在低倍鏡下尋找有絲分裂中期分裂相視野， 然后在100倍油鏡下進行染色體計數(shù)，選擇體細胞染色體數(shù)目2n = 3x = 21的三倍體植株。
[0024] 其中，上述卡諾氏固定液是由無水乙醇和冰醋酸按體積比3:1制成的。
[0025] 其中，上述體積百分濃度45%醋酸溶液配制的質(zhì)量濃度1%的洋紅染色液配制方 法為：先加入45ml乙酸再加水55ml，混勻后將洋紅粉末1克緩慢倒入100ml 45 %醋酸溶液 中，邊煮邊攪拌，煮沸冷卻后過濾即可使用。
[0026] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0027]1、現(xiàn)有技術(shù)大多先誘導(dǎo)形成四倍體再與二倍體雜交形成三倍體，本發(fā)明所述方法 通過直接誘導(dǎo)矮牽牛二倍體形成2n花粉再與二倍體雜交形成三倍體，顯著縮短育種時間， 操作簡便易行；對2n花粉進行低溫保存延長了花粉活力，解決花期不遇，方法簡單易行。
[0028] 2、誘導(dǎo)劑的選擇：本發(fā)明采用秋水仙素、氨磺靈和氟樂靈混合液為誘導(dǎo)劑，通過干 擾紡錘絲形成從而抑制細胞有絲分裂使染色體加倍，三者混合使用后可提高2n花粉誘導(dǎo) 率。
【附圖說明】
[0029] 圖1在100倍油鏡下觀察三倍體植株子房分生組織體細胞的染色體數(shù)目，2n= 21 ；
【具體實施方式】
[0030] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0031] 實施例1 一種三倍體矮牽牛的培育方法
[0032] 1)選擇二倍體矮牽牛Petuniahybrida'Pink'為父本，二倍體矮牽牛Petunia hybrida'RoseHalo'為母本，均購于浙江虹越花丼股份有限公司，按常規(guī)技術(shù)種植；
[0033] 2)父母本進入花期，于上午9時溫室大棚內(nèi)溫度28°C，選擇父本植株上長度為 2. 6mm~3. 1mm花蕾，用微量注射器將去離子水配制最終質(zhì)量濃度秋水仙素0. 2%，氨磺靈 30mg. L 1，氟樂靈80mg. L 1，體積為10 y L混合藥液注入花蕾內(nèi)，處理1次；花粉成熟后，取花 粉粒于載玻片上用質(zhì)量濃度為1 %醋酸洋紅染色，在40倍鏡下用顯微測微尺測量花粉的直 徑并結(jié)合外觀特征確認2n花粉，經(jīng)統(tǒng)計2n花粉率可達40. 1 %。
[0034] 3)誘導(dǎo)處理后花蕾縱軸長度生長至1. 8cm~2. 2cm時，采摘放置于密閉的玻璃干 燥器中（內(nèi)含硅膠