一種金銀花直接體胚發(fā)生和植株再生的培養(yǎng)基及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種金銀花直接體胚發(fā)生和植株再生的培養(yǎng)基及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金銀花含綠原酸和木犀草素等60余種化學(xué)成分，有清熱解毒、消炎退腫、增強機體免疫、延緩衰老的功效，還具有抗癌、抗艾滋病的作用，臨床上主要用于預(yù)防治療心腦血管疾病，治療肝炎等。適應(yīng)性廣，抗逆性強，對土壤要求不嚴，是優(yōu)良的園林綠化植物，還是良好的水土保持和植被恢復(fù)樹種。近年來，金銀花存在品種落后、苗木質(zhì)量退化的問題，雖然也有新品種選育的報道，例如湖南省林科院選育出‘金翠蕾’、‘銀翠蕾’、‘舜帝I號’和‘花瑤晚熟’等優(yōu)良新品種，但目前這些品種繁殖多采用嫁接或扦插方式，繁殖系數(shù)小，育苗周期長，且易傳染病菌，品種退化快。為了加速這些優(yōu)良新品種的推廣應(yīng)用，也采用組織培養(yǎng)方法，主要是以腋芽做外植體，利用芽培養(yǎng)快繁苗木，但這種芽培養(yǎng)繁殖系數(shù)仍舊較低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高，難以在生產(chǎn)中被大面積推廣應(yīng)用。通過“器官發(fā)生”方式，繁殖系數(shù)較芽培養(yǎng)高，但操作過程繁瑣，生產(chǎn)成本也居高不下，且培育出的苗木變異幾率增加。體細胞胚胎發(fā)生是指在離體條件下植物體細胞通過與合子胚發(fā)生相似的途徑發(fā)育成新個體的過程。體細胞胚發(fā)生，特別是直接體胚發(fā)生，是公認的最佳繁殖方法，具有操作簡單、繁殖系數(shù)高、變異株少、幼苗成活率高、植株完全無病等優(yōu)點，且繁殖速度快、不受地區(qū)、季節(jié)和災(zāi)害性氣候等自然條件的限制，一旦獲得優(yōu)良材料就可以比常規(guī)繁殖快數(shù)十倍甚至上百倍的速度繁殖，大大降低了生產(chǎn)成本，是未來金銀花苗木繁育首選方法。
[0003]金銀花組培育苗研究較多。楊培君以金銀花‘蒙花’品系的莖段為外植體，于MS和BJii加不同激素配比的培養(yǎng)基上，探討愈傷組織形成和叢生芽誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)的條件，獲得較好的增殖和生根培養(yǎng)基；王曉明以‘金翠蕾’無菌葉片為材料，通過先誘導(dǎo)出不定芽，再誘導(dǎo)出不定根的方式，成功誘導(dǎo)出完整小苗，但上述方法只局限于一般“芽培養(yǎng)”及“器官發(fā)生”方式繁殖苗木，繁殖系數(shù)仍舊不理想，尚無利用金銀花葉片作為外植體建立直接體胚發(fā)生體系的研究報道。
[0004]公開號CN102577969A號“灰氈毛忍冬渝蕾I號組培種苗的繁育方法”的發(fā)明特征是以當年抽出的葉片為外植體，先誘導(dǎo)愈傷組織，進一步接種至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽和不定根。公開號CN102577970A號“灰氈毛忍冬渝蕾I號種苗的組織培養(yǎng)基”專利，申請人的發(fā)明特征在于種苗繁育的組織培養(yǎng)基，包括愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽分化培養(yǎng)基、不定芽繼代培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基。公開號CN103548687A號“灰氈毛忍冬渝蕾I號組培苗生根培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)方法”專利，申請人的發(fā)明特征在于探索出一個最適合組培苗生根的培養(yǎng)基配方及生根培養(yǎng)方法，顯著提高生根率。公開號CN103548690A號“灰氈毛忍冬渝蕾I號的增殖培養(yǎng)基及其增殖方法”專利，申請人的發(fā)明特征在于調(diào)整基本增殖培養(yǎng)基，并提出增殖時最佳的切割工藝。以上專利都局限在金銀花器官發(fā)生、芽繁或者生根，其培養(yǎng)基組成因器官發(fā)生、芽繁或者生根各有差異，基本培養(yǎng)基為B5、改良仏或1/2MB，添加6-BA、NAA、KT、IAA, IBA、活性炭等，但它們均未涉及到體胚發(fā)生和通過體胚發(fā)生得到再生的金銀花植物。
[0005]通過直接體胚發(fā)生繁殖苗木，攻克金銀花苗木繁殖系數(shù)低的技術(shù)難題，建立高效的快繁技術(shù)體系，可在最短時間內(nèi)繁殖出質(zhì)量好，幼苗成活率高的優(yōu)良種苗，滿足市場對金銀花健康種苗的需求。因此，研究金銀花直接體胚發(fā)生培養(yǎng)基及植株再生方法至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有研究的不足，提供一種能保持母株優(yōu)良性狀的金銀花葉片直接體胚發(fā)生培養(yǎng)基及方法。直接體胚發(fā)生，由于胚直接源于體細胞，不經(jīng)過愈傷組織階段，通過此途徑得到的再生植物能保持母株優(yōu)良性狀。
[0007]為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
100ml所述金銀花直接體胚發(fā)生和植株再生的直接體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由如下配比的原料組成:
硝酸銨1000—1400 mg，優(yōu)選 1200 mg
硝酸鉀700— 1100 mg，優(yōu)選 900 mg
硫酸鎂175—185 mg，優(yōu)選 180.7 mg
氯化鈣330— 335 mg，優(yōu)選 332.2 mg
磷酸二氫鉀165—175 mg，優(yōu)選170 mg
七水硫酸亞鐵25— 30 mg，優(yōu)選27.8 mg
乙二胺四乙酸二鈉鹽35— 40 mg，優(yōu)選37.26 mg
硼酸5.5一6.5 mg，優(yōu)選 6.2 mg
七水硫酸鋅8一9 mg，優(yōu)選8.6 mg
一水硫酸猛15—18 mg，優(yōu)選16.9 mg
碘化鉀0.8—0.85 mg,優(yōu)選 0.83 mg
二水鉬酸鈉0.2—0.3 mg,優(yōu)選0.25 mg
六水氯化鈷0.02—0.03 mg,優(yōu)選0.025 mg
五水硫酸銅0.02—0.03 mg,優(yōu)選0.025 mg
硅酸鉀150— 250 mg，優(yōu)選200 mg
六水硫酸鎳0.003—0.007 mg,優(yōu)選0.005 mg
肌醇90—110 mg，優(yōu)選 100 mg
甘氨酸1.8—2.2 mg，優(yōu)選2.0 mg
煙酸0.3—0.7 mg,優(yōu)選 0.5 mg
鹽酸[!比P多醇0.3一0.7 mg，優(yōu)選0.5 mg
鹽酸硫胺素0.08一0.12 mg，優(yōu)選0.1 mg
瓊脂5— 7 g，優(yōu)選6 g
鹿糖28— 32 g，優(yōu)選30 g
6-BA1.8—2.2 mg，優(yōu)選 2.0 mg
NAA0.01—0.05 mg
95% 乙醇5—15 ml 其余為水。
[0008]1000ml所述金銀花直接體胚發(fā)生和植株再生的生根培養(yǎng)基由如下配比的原料組成:
硝酸銨500— 700 mg，優(yōu)選600 mg
硝酸鉀400—500 mg，優(yōu)選450 mg
硫酸鎂85—95 mg，優(yōu)選90.35 mg
氯化I丐160一170 mg，優(yōu)選 166.1 mg
磷酸二氫鉀80—90111〖，優(yōu)選85.0 mg
七水硫酸亞鐵25— 30 mg，優(yōu)選27.8 mg
乙二胺四乙酸二鈉鹽35— 40 mg，優(yōu)選37.26 mg
硼酸5.5一6.5 mg，優(yōu)選 6.2 mg
七水硫酸鋅8一9 mg，優(yōu)選8.6 mg
一水硫酸猛15—18 mg，優(yōu)選16.9 mg
碘化鉀0.8—0.9 mg,優(yōu)選 0.83 mg
二水鉬酸鈉0.2—0.3 mg,優(yōu)選0.25 mg
六水氯化鈷0.02—0.03 mg,優(yōu)選0.025 mg
五水硫酸銅0.02—0.03mg,優(yōu)選0.025 mg
硅酸鉀80—120 mg，優(yōu)選100 mg
六水硫酸鎳0.003—0.007mg,優(yōu)選0.005 mg
肌醇90—110 mg，優(yōu)選 100 mg
甘氨酸1.8—2.2 mg，優(yōu)選2.0 mg
煙酸0.4—0.6 11^，優(yōu)選0.5 mg
鹽酸P比卩多醇0.4—0.6 11^，優(yōu)選0.5 mg
鹽酸硫胺素0.08一0.12 mg，優(yōu)選0.1 mg
瓊脂4一 8 g，優(yōu)選6 g
鹿糖25—35 g，優(yōu)選30 g
IBA3.0一5.0 mg，
活性炭O — 20g，優(yōu)選O或20g
95% 乙醇5—15 ml
其余為水。
[0009]所述金銀花直接體胚發(fā)生和植株再生方法是將金銀花無菌葉片接種于上述直接體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待直接體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長出子葉胚后，將子葉胚轉(zhuǎn)接到上述生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至子葉胚發(fā)育成再生小植株。
[0010]優(yōu)選地，所述方法是將金銀花無菌葉片接種于直接體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，75—80天將直接體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長出的子葉胚轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，75—80天，優(yōu)選80天后發(fā)育成再生小植株；直接體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件為:暗培養(yǎng)1.5-2.5周，優(yōu)選2周，然后進行光照培養(yǎng)，每天光照時間為10—14小時，優(yōu)選12小時，光照強度為3500-3900LUX，優(yōu)選3850 lux，溫度為20— 25°C，優(yōu)選25°C ;生根培養(yǎng)基培養(yǎng)條件為:光照培養(yǎng)，每天光照時間為10 —14小時，優(yōu)選12小時，光照強度為3500-3900LUX，優(yōu)選3850 lux，溫度為20—25°C，優(yōu)選25°C;將再生小植株煉苗I一 1.5周，優(yōu)選I周后移栽至基質(zhì)中培養(yǎng)，所述基質(zhì)由泥炭土和珍珠巖按體積比(1.5 — 2.5):1，優(yōu)選2:1組成。
[0011]本發(fā)明涉及的培養(yǎng)基包括直接體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基兩種，每種基本培養(yǎng)基均是由MS改良而成。在直接體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，