一種牙鲆雄核發(fā)育雙單倍體的誘導及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產生物技術領域，具體涉及一種牙鲆雄核發(fā)育雙單倍體的誘導及檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 牙鮮（Paralichthys olivaceus)，隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes)，鱗形目 (Pleuronectiformes)，鱗亞目（Pleuronectoidei)，牙鮮科（Paralichthyidae)，牙鮮屬 (Paralichthys)，為暖溫性底層兇猛海魚，個體大的可達800mm以上，它具有個體大、肉質 細嫩、脂滿味美、易消化等特點，同時牙鲆又具有生長快、繁殖能力強、洄游性小、回歸性強 的特點，是中國、日本等國重要的海水增養(yǎng)殖魚類。
[0003] 牙鲆雌雄個體生長速度差異顯著，在生產中，養(yǎng)殖全雌牙鲆比養(yǎng)殖普通牙鲆能大 幅度提高了養(yǎng)殖產量，產生更大的經濟效益。通過人工誘導雌核發(fā)育技術，能在短時間內生 產全雌牙鲆并應用于養(yǎng)殖生產中。
[0004] 雌核發(fā)育技術雖然能快速實現(xiàn)牙鲆的全雌化，但雌核發(fā)育的后代僅具有母本的遺 傳信息，這就在無形中排除了父本遺傳信息的作用。在雜交一代中，某些性狀的父本效應要 高于母本效應，因此，有效的將父本的優(yōu)良性狀傳遞到雜交子代中對最大限度的利用雜交 優(yōu)勢具有不可忽視的作用。
[0005] 傳統(tǒng)的雄核發(fā)育誘導技術，需要對未受精的卵子進行滅活處理。滅活通常是利用 伽馬射線、X射線或者紫外線照射來進行。雖然這些照射能有效的將卵子的遺傳物質滅活， 但需要特定照射源，特別是伽馬射線、X射線，除照射源外，另需特定的安全防護裝備以確保 安全性。另外，所有的照射方法都需要卵子保護液來保護照射中的卵子的受精能力。綜上 所述，利用照射滅活方法進行魚類的雄核發(fā)育誘導不太具有便利性。

【發(fā)明內容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種牙鲆雄核發(fā)育雙單倍體的 誘導及檢測方法，本發(fā)明所建立的方法，只需對受精卵進行一定時間的冷休克處理，即可使 卵內核遺傳物質失活，達到和射線照射滅活相同的效果。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術方案為：一種牙鲆雄核發(fā)育雙單倍體的誘導及檢測方法，包 括以下步驟：
[0008] 1)精子和卵子的采集：采集新鮮的牙鲆雄魚精子和牙鲆雌魚卵子；
[0009] 2)人工授精：用林格氏液對所述精子進行稀釋，得到精子稀釋液，將所述精子稀 釋液和卵子進行混合，攪拌均勻后，向其中加入海水進行激活，得到經海水激活的精卵混合 物；
[0010] 3)冷休克處理誘導雄核發(fā)育單倍體：將經海水激活的精卵混合物轉移至0-3°C的 海水中進行冷休克處理，冷休克處理后，轉移至孵化缸內；
[0011] 4)誘導雙單倍體：從孵化缸中選取上浮魚卵，將所述上浮魚卵轉移至加壓容器 中，加壓至600-700kg/cm2,持續(xù)5-8分鐘，緩慢泄壓后，將所述上浮魚卵轉移至孵化箱內流 水孵化；即可得到含有雄核發(fā)育雙單倍體個體的牙鲆群體。
[0012] 5)仔魚倍性鑒定：對步驟3)和步驟4)中孵化得到的仔魚分別進行倍性鑒定。
[0013] 林格氏液又被稱為Ringer' s液，一種與哺乳動物的血液和淋巴大致等滲的鹽溶 液，Ringer's溶液被廣泛應用于組織、細胞和一些低等動物培養(yǎng)或保存。本發(fā)明中，林格氏 液為海水魚用林格氏液。
[0014] 本發(fā)明中，經過冷休克處理后的受精卵會被誘導為雄核單倍體，所述雄核單倍體 在高靜水壓的環(huán)境下會被誘導為雙單倍體，本發(fā)明操作簡單，方便快捷，對比傳統(tǒng)的雄核發(fā) 育誘導技術，具有明顯優(yōu)勢。
[0015] 優(yōu)選的，所述誘導及檢測方法中，步驟5)仔魚倍性鑒定的評判標準為：對步驟3) 中轉移至孵化缸中孵化所得到的仔魚用流式細胞儀進行倍性檢測，檢測結果中的單倍體， 即為雄核發(fā)育單倍體；對步驟4)孵化所得到的仔魚，進行倍性檢測，檢測結果中的二倍體， 即為雄核發(fā)育雙單倍體。
[0016] 優(yōu)選的，所述誘導及檢測方法還包括：6)微衛(wèi)星檢測：使用微衛(wèi)星引物對步驟3) 得到的雄核發(fā)育單倍體進行父本遺傳檢測；使用微衛(wèi)星引物對步驟4)得到的雄核發(fā)育雙 單倍體進行純合性檢驗。
[0017] 上述鑒定和微衛(wèi)星檢測，方便統(tǒng)計出最終誘導成功的結果和比例，對操作流程及 參數做進一步優(yōu)化。
[0018] 優(yōu)選的，步驟1)中在采集雄魚精子和雌魚卵子后，避光保存，并在解剖鏡和顯微 鏡下對精子和卵子進行篩選。在篩選過程中，選取透明、飽滿、大小均一的卵子和游動時間 長的精子，也就是說，選取從生物學的角度上說，繁殖力強的精子和卵子。
[0019] 優(yōu)選的，步驟2)中所述林格氏液與精子的體積比為1:30-1:50,且所述精子稀釋 液和卵子的體積比為1:10-1:30 ;加入的海水溫度為15-19°C。
[0020] 優(yōu)選的，步驟3)經海水激活的精卵混合物在10秒內轉移至0-3°C的海水中進行冷 休克處理，冷休克處理的時間為15-60分鐘。
[0021] 優(yōu)選的，步驟4)中孵化缸中的培育溫度為15-19°C，培育45-71分鐘后，進行洗卵， 并選取上浮魚卵。經過數據分析，在實驗室條件下，上述配比得到的效果較好。
[0022] 進一步的，步驟4)中所述上浮魚卵轉移至靜水壓機進行加壓，并在30秒內達到所 需壓力，持續(xù)5-8分鐘緩慢泄壓后，將所述上浮魚卵轉移至孵化箱內流水孵化；即可得到含 有雄核發(fā)育雙單倍體個體的牙鲆群體。
[0023] 優(yōu)選的，步驟5)中在對仔魚裂解后，使用DAPI染色后，再進行倍性鑒定。
[0024] DAPI 即 4'，6-二脒基 _2_ 苯基吲噪（4,，6-diamidino_2-phenylindole)，是一種 能夠與DNA強力結合的熒光染料。使用所述DAPI對DNA進行染色，再用激光激發(fā)檢測熒光 含量，便可得出DNA的相對含量，從而得知倍性。
[0025] 優(yōu)選的，步驟6)中微衛(wèi)星檢驗使用的微衛(wèi)星引物為：Polil359TUF、HLJYP38、 Polil446TUF、BDHYP181。
[0026] 雄核發(fā)育單倍體父本遺傳檢測使用微衛(wèi)星引物Polil359TUF和微衛(wèi)星引物 HLJYP38 ;雄核發(fā)育雙單倍體純合性檢驗使用微衛(wèi)星引物Po 1 i 1446TUF和微衛(wèi)星引物 BDHYP181。
[0027] 其中，微衛(wèi)星引物Polil359TUF的序列為：
[0028] F :如 SEQ ID N0 :1 所示；R :如 SEQ ID N0 :2 所示；
[0029] 微衛(wèi)星引物HLJYP38的序列為：
[0030] F :如 SEQ ID N0 :3 所示；R :如 SEQ ID N0 :4 所示；
[0031] 微衛(wèi)星引物Polil446TUF的序列為：
[0032] F :如 SEQ ID N0 :5 所示；R :如 SEQ ID N0 :6 所示；
[0033] 微衛(wèi)星引物BDHYP181的序列為：
[0034] F :如 SEQ ID N0 :7 所示；R :如 SEQ ID N0 :8 所示。
[0035] 上述微衛(wèi)星檢驗屬于現(xiàn)有技術，本行業(yè)技術人員可以輕易得到，在此就不再贅述。
[0036] 本發(fā)明的有益效果為：
[0037] 1、本發(fā)明運用雄核發(fā)育的方法，可以有效的固定父本的優(yōu)良遺傳性狀，并快速的 給予純化用于雜交種的制備，可最大限度的發(fā)揮雜種優(yōu)勢。
[0038] 2、本發(fā)明提供的雄核發(fā)育雙單倍體的誘導及檢測方法，只需對受精卵進行一定時 間的冷休克處理，即可使卵內核遺傳物質失活，達到和傳統(tǒng)的雄核發(fā)育誘導技術中射線照 射滅活相同的效果。
[0039] 3、傳統(tǒng)的雄核發(fā)育誘導及檢測方法在對卵子進行照射時，需要使用特定的保護液 來保護卵子的受精能力。不同魚類的卵子需要不同的保護液，因此針對特定的魚，需要進行 不同保護液保護效果的實驗，費時費力。本發(fā)明所建立的方法，只需將卵子和精子進行正常 的受精，無需事先進行照射，同時也免除了保護液的使用。
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