一種蒙藥香青蘭組織培養(yǎng)再生體系建立的方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域植物組織培養(yǎng)方法，具體涉及蒙藥香青蘭組織培養(yǎng)再生體系 的建立方法。
[0002]
【背景技術(shù)】： 香青蘭ffiWaKicaL.)，別名摩眼子，山薄荷，藍(lán)秋花、玉米草、香花 子，等。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別收載于內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)、衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維藥分冊，還曾收載于 1977年版中國藥典，唇型科青蘭屬一年生草本植物，藥用部位為地上全草，主要分布于我 國華北、東北、西北大部分地區(qū)，特別是內(nèi)蒙古和新疆。蒙古名為畢日陽古，是極具開發(fā)潛力 和民族特色的天然藥用植物，具有緩解心絞痛、改善心肌缺血、降低血粘度和血小板聚集率 等功效作用。除作為中草藥外，香青蘭因含有大量的揮發(fā)油，是制備檸檬香系香料的重要原 料。此外，香青蘭幼嫩的莖葉可作為特菜食用，干的莖葉和種子可制作茶、調(diào)味料或制作香 料。香青蘭以其蘊藏的多功能醫(yī)療保健作用和獨具特色的香味成為一種極具開發(fā)潛力的天 然藥用植物資源和芳香植物資源。
[0003] 近年來，隨著國家"中藥現(xiàn)代化與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)"行動的推進(jìn)，對香青蘭的開發(fā)利用 得到了迅猛發(fā)展，而原材料的獲取主要靠野外采挖，野生香青蘭的資源保護(hù)與撫育、引種與 馴化正在全面展開。香青蘭主要靠種子繁殖，但它的種子非常小，且不宜保存易喪失活力。 植物組織培養(yǎng)與再生體系的建立是快速繁殖植物優(yōu)良品種脫毒苗的重要途徑，而對香青蘭 進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得再生植株的研究至今未見報道。為及時有效的保護(hù)與開發(fā)蒙藥香青蘭， 保證其可持續(xù)利用，本發(fā)明以香青蘭無菌苗的下胚軸為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、分化、 增殖、生根、煉苗、移栽等系列過程成功獲得了香青蘭再生植株，建立了組培快繁體系，為 香青蘭無性系育種及遺傳轉(zhuǎn)化、工廠化生產(chǎn)育苗滿足市場需求提供理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明提供一種蒙藥香青蘭組織培養(yǎng)再生體系建立的方法。
[0005] 技術(shù)解決方案 所述的香青蘭子葉愈傷組織再生體系的建立方法，包括以下步驟： (1)種子表面消毒及無菌苗培養(yǎng)： 挑選籽粒飽滿、大小一致的香青蘭種子，經(jīng)流水沖洗4-7min去除表面塵土雜物，無菌 水沖洗4-7次后放置超凈工作臺上，用體積濃度70%乙醇浸泡30-40s，無菌水沖洗2-4次； 再用體積濃度〇. 1%取(：12消毒4-6min，無菌水震蕩沖洗4-6次，接種在含有100mLMS。固 體培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶瓶身用牛皮紙包裹，28±2 °C條件下培養(yǎng)。每天觀察種子的 污染與萌發(fā)狀況。待種子萌發(fā)后去除牛皮紙光照培養(yǎng)，光照12-14h/d，光照強度1800-2200 lux〇
[0006] (2)愈傷組織的誘導(dǎo) 取步驟（1)培養(yǎng)的生長健壯的香青蘭無菌苗，切取無菌幼苗的子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSil，每瓶接種3-4塊，暗培養(yǎng)9-12d后轉(zhuǎn)入正常光照下培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSMS為基 本培養(yǎng)基，添加6-BA0.5mg/L、2,4_D1.0mg/L、NAA0.5mg/L、鹿糖30mg/L、瓊脂 10mg/ L，pH5. 8-6. 0,13-16d后觀察并統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)光照培養(yǎng)條件為：光照12-14h/d，光照強度 1800-2200lux，溫度 28 士 2 °C。
[0007] (3)愈傷組織的繼代培養(yǎng) 將經(jīng)過步驟（2)誘導(dǎo)得到的黃綠色愈傷組織接種在繼代培養(yǎng)基MS2中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。 繼代培養(yǎng)基MS2&MS為基本培養(yǎng)基，添加 6-BA0.5mg/L、2,4-D0.5mg/L、NAA0.5mg/ 1^、蔗糖3〇1^/1、瓊脂1〇1^/1，？!15.8-6.0，繼代培養(yǎng)條件為：光照12-14 11/(1，光照強度 1800-2200lux，溫度 28 士 2 °C。
[0008] (4)不定芽的誘導(dǎo)分化 將經(jīng)過步驟（3)連續(xù)繼代培養(yǎng)3-4次后得到的黃綠色愈傷組織轉(zhuǎn)到不定芽分化培養(yǎng)基MS3中進(jìn)行誘導(dǎo)，不定芽分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加外源激素6-BA0. 8mg/L、NAA 0· 1mg/L、蔗糖30mg/L、瓊脂10mg/L，pH5. 8-6. 0,培養(yǎng)條件為：光照12-14h/d，光照強 度 1800-2200lux，溫度 28 士 2 °C。
[0009] (5)誘導(dǎo)生根 待經(jīng)過步驟（4)不定芽誘導(dǎo)得到再生芽2-3片左右時轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基MS4進(jìn)行生 根誘導(dǎo)，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加外源激素IBA0. 2mg/L、蔗糖30mg/ L、瓊脂6mg/L，pH5. 8-6.0,培養(yǎng)條件為：光照12-14h/d，光照強度1800-2200lux，溫度 28 士 2 °C。
[0010] (6)再生植株移栽 經(jīng)過12-15d左右步驟（5)的生根誘導(dǎo)，再生植株長出4-6條根后，將三角瓶瓶口打開， 置于自然條件下（陰涼、空氣流通處）煉苗，7-8天后將再生苗從三角瓶中取出，經(jīng)流水沖洗 掉根基部的培養(yǎng)基殘留物，再用蒸餾水沖洗幾次，用體積濃度〇. 08-0. 13%多菌靈浸泡6-8 min，轉(zhuǎn)至移栽基質(zhì)中，基質(zhì)為松樹皮、泥炭土、活苔蘚與陶粒(按1 :1 :1 :1混合)，外扣遮光 塑料，每天澆透水1-3次，培育溫度28 士 2 °C，晚上最低溫度不低于20 °C。待幼苗長出 3-4片新葉，苗高8-12cm左右移栽到正常土壤下在自然環(huán)境中繼續(xù)培育。
[0011] 本發(fā)明還具有如下附加技術(shù)特征： 所述MS。固體培養(yǎng)基為基本MS(MurashigeandSkoog，1962)培養(yǎng)基，含有以下濃度的 物質(zhì)：1.65g/LNH4N03、1.90g/LΚΝ03、0· 17g/LΚΗ2Ρ04、0· 1807g/LMgS04.7H20、0· 332g/ 1^〇&(：12;微量元素：22.3 11^/1]\%504*4!120、6.2 11^/1隊803、8.6 11^/1211504*7!120、0.83 mg/LΚΙ、0· 25g/LNa2Mo04 · 2Η20、0· 025mg/LCuS04 · 7Η20、0· 025mg/LCoCl· 6Η20、27· 8 mg/LFeS04 ·7Η20、37· 3mg/LNa2-EDTA;維生素：肌醇 100mg/L、煙酸 0· 5mg/L、L-甘氨酸 2mg/L、VB6 0.5mg/L、VBl0.1mg/L，蔗糖 30g/L，瓊脂 8-10g/L。
[0012] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSi為以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA0.5mg/L、2,4-D1.0mg/ L、NAA0.5mg/L、鹿糖 30mg/L、瓊脂 10mg/L,pH5. 8-6.0。
[0013] 所述繼代培養(yǎng)基MS2為以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA0· 5mg/L、2,4-D 0· 5mg/ L、NAA0.5mg/L、鹿糖 30mg/L、瓊脂 10mg/L，pH5. 8-6.0。
[0014] 所述不定芽分化培養(yǎng)基MS3為以MS為基本培養(yǎng)基，添加外源激素6-BA0.8mg/L、 NAA0· 1mg/L、鹿糖 30mg/L、瓊脂 10mg/L，pH5· 8_6· 0。
[0015] 所述生根培養(yǎng)基MS4為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加外源激素IBA0. 2mg/L、蔗 糖30mg/L、瓊脂6mg/L，pH5. 8-6. 0。所述1/2MS培養(yǎng)基組分包括大量元素：0· 825g/ LNH4N〇3、0. 95 g/L ΚΝ03、0· 085 g/L ΚΗ2Ρ04、0· 09035 g/L MgS04.7H20、0· 166 g/L CaCl2jj 量元素：22.3 11^/1^]\%304*4!120、6.2 11^/1^1^31303、8.6 11^/1^211304*7!120、0.83 11^/1^1(1、 0.25 g/L Na2Mo04*2H20、0.025 mg/L CuS04*7H20、0.025 mg/L C〇C1*6H20、27.8 mg/L FeS04 ·7Η20、37· 3 mg/L Na2-EDTA ;維生素，肌醇 100 mg/L、煙酸 0· 5 mg/L、L-甘氨酸 2 mg/ L、VB6 0.5 mg/L、VBl 0· 1 mg/L。
[0016] 所述移栽基質(zhì)為松樹皮、泥炭土、活苔蘚與陶粒按1 :1 :1 :1混合所得。
[0017] 所述正常土壤為室外隨機所取得種植土壤。
[0018] 香青蘭作為一種典型的蒙、維常用民族藥，對其進(jìn)行的研究主要集中在化學(xué)成分 分析與臨床應(yīng)用上，通過組織培養(yǎng)建立香青蘭再生體系方面至今未見報道。采用本發(fā)明的 有益效果是提供一種操作簡單的蒙藥香青蘭組織培養(yǎng)再生體系建立的方法。采用香青蘭無 菌苗的子葉做為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷組織繼代培養(yǎng)后增值較快，分化程度高，經(jīng) 生根培養(yǎng)后得到的再生植物移栽后成活率高，利用該方法可在短期內(nèi)獲得大量香青蘭再生 植株，為進(jìn)一步擴大栽培香青蘭提供良好的種苗或可作為優(yōu)秀的科研材料進(jìn)行該物種的遺 傳轉(zhuǎn)化等研究。
[0019]
【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明培養(yǎng)的香青蘭無菌苗； 圖2為本發(fā)明香青蘭無菌苗子葉培養(yǎng)培養(yǎng)5天的情形； 圖3為本發(fā)明香青蘭子葉愈傷誘導(dǎo)20天的情形； 圖4為香青蘭愈傷組織分化不定芽； 圖5為香青蘭不定根的分化； 圖6為香青蘭再生植株移栽。
[0020] 具體實施案例： 下面對本發(fā)明的實施做進(jìn)一步的詳細(xì)描述： 一種蒙藥香青蘭組織培養(yǎng)再生體系建立的方法，種植香青蘭無菌苗的種子采自內(nèi)蒙古 錫林郭勒盟草原，它采用如下步驟： 步驟一：挑選籽粒飽滿、大小一致的香青蘭種子，經(jīng)流水沖洗4-7 min去除表面塵土雜 物，無菌水沖洗4-7次后放置超凈工作臺上，用體積濃度70%乙醇浸泡30-40 s，無菌水沖 洗2-4次；再用體積濃度0. 1%取(：12消毒4-6 min，無菌水震蕩沖洗4-6次，接種在含有 100mLMS。固體培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，pH5. 8)的三角瓶中，將三角瓶瓶身用牛皮紙包裹， 28±2 °C條件下培養(yǎng)。每天觀察種子的污染與萌發(fā)狀況。萌發(fā)率=(萌發(fā)種子數(shù)/接種種 子數(shù)）X100%，待種子萌發(fā)后去除牛皮紙光照培養(yǎng)，光照12-14 h/d，光照強度1800-2200 lux〇
[0021] 所述MS。固體培養(yǎng)基以基本MS(MurashigeandSkoog，1962)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)含有 以下質(zhì)量體積濃度的物質(zhì)：蔗糖30 g/L，瓊脂8-10 g/L，滅菌前將pH調(diào)至5. 8-6. 0。
[0022] 所述基本MS培養(yǎng)基組分包括大量元素：1.65g/LNH4N03、1.90g/LΚΝ03、0. 17g/ LΚΗ2Ρ04、0· 1807g/LMgS04 · 7Η20、0· 332g/LCaCl2jj量元素：22. 3mg/LMgS04 · 4H20、 6.2mg/LN3B03、8.6mg/LZnS04.7H20、0.83mg/LKI、0.25g/LNa2Mo04.2H20、0.025mg/ LCuS04 · 7H20、0. 025mg/LCoCl· 6H20、27. 8mg/LFeS04 · 7H20、