專利名稱：甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，特別是涉及甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建 立的方法。
背景技術：
甜高粱是普通高粱的一個變種，生長耗水量僅為玉米的1/3，畝產(chǎn)可高達5 10 噸，其莖稈汁液是發(fā)酵制造酒精和培養(yǎng)酵母的理想生物質(zhì)原料。用甜高粱取代玉米等糧食 作物作為原料生產(chǎn)酒精的新工藝，不僅能節(jié)約糧食、降低成本，有力地帶動發(fā)酵產(chǎn)業(yè)、振興 酒精生產(chǎn)行業(yè)、而且能推進可再生能源事業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展。發(fā)展甜高粱產(chǎn)業(yè)關鍵在于甜 高粱新品種的選育與高效栽培。傳統(tǒng)育種技術在甜高粱的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病、抗蟲等特性改 良方面已發(fā)揮了重要作用，但在生產(chǎn)上對品種、品質(zhì)要求日益提高的情況下，因受現(xiàn)有資源 的限制，單靠傳統(tǒng)的育種方法難以取得重大突破。利用轉(zhuǎn)基因技術改良高粱品種已引起廣 泛的關注。植物轉(zhuǎn)基因技術通常依賴于植物快捷、高頻率再生體系的建立。然而，甜高粱同 普通高粱一樣，通過組織培養(yǎng)獲得再生植株相對比較困難。目前針對甜高粱組織培養(yǎng)的研 究還很少。從甜高粱的成熟胚和未成熟胚誘導愈傷到獲得整個再生植株以前雖已有過一些 艮道(MacKinnon et al.，1986，Plant Cell Rep. 5 :349_351 ；Ma et al.，1987，Theor App Genet. 73 389-394 ；Rao and Kavi Kishor，1989，Curr Sci. 58 :692_693)，但遺憾的是能 夠從外植體誘導胚性愈傷到再生出植株的僅限于個別幾個品種(Smith and Bhaskaran, 1986，Springer-Verlag, New York, pp. 220-223 ；Rao et al.，1995，Plant Cell Rep. 15 72-75)。近年來隨著人們對甜高粱應用價值的重視，甜高粱組織培養(yǎng)方面的研究也取得了 快速的發(fā)展。通過對不同基因型品種及外植體、不同培養(yǎng)基成分(包括蔗糖濃度和激素配 比等)、不同培養(yǎng)條件對愈傷的誘導、增殖及分化再生能力的影響進行系統(tǒng)研究，為甜高粱 品種建立有效的組織培養(yǎng)再生體系提供了參考(Zhao et al. ,2008,Chinese Bull Bot. 25 465-468 ；Zhao et al. ,2010,African Journal of Biotechnology. 9(16) :2367_2374)。但 以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚為外植體，目前為止以幼穗為外植體的研究 尚很少見有報道。近年來各國科學家正在致力于相關方面的研究，相比其它作物，甜高粱組織培養(yǎng) 植株再生困難，而且受基因型的限制，因此甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究進展緩慢，目前尚很少見成 功報道。據(jù)報道，2009年美國昆士蘭大學的研究人員培育出了世界上首例木質(zhì)素含量降低 的轉(zhuǎn)基因甜高粱植株，他們將編碼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)和咖啡酸-0-甲 基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的DNA片段導入甜高粱品種中，通過改變木質(zhì)素的含量和組分獲得了成 功，該項研究成果已申請了專利(Pub. No. US 2010/0058496A1)。其它研究尚未見相關報道。因此建立甜高粱的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過轉(zhuǎn)基因技術培育甜高粱新品種，使其更好 地滿足實際生產(chǎn)的需求。轉(zhuǎn)化體系的研發(fā)將為綠色能源生物燃料和生物材料的開發(fā)利用開 辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以甜高粱幼穗材料的組織培養(yǎng)形成再生體系，為以甜高 粱幼穗誘導的愈傷組織的組織培養(yǎng)再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化方法提供基礎研究。甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法，包括如下步驟1)選取幼穗，旗葉期 長約2-5cm幼穗，切成薄片，2)將其接種于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成愈傷組織，所述誘導培 養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+ZT (玉米素)2. Omg/L+PVP (聚乙烯吡咯烷酮)IOmg/ L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7. 2g/L瓊脂pH 5. 8，3)將愈傷幼 穗組織塊在繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)基為誘導培養(yǎng)基+KT(激動素)0. 2mg/ L，4)再將其接于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至出苗，所述分化培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+ZT2.0mg/ L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-lOmg/L+水解酪蛋白 500mg/L+30g/L 蔗糖+8. Og/L 瓊脂，pH 5.8， 5)將苗移入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)出根，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS基礎培養(yǎng)基+肌醇500mg/ L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8_10mg/L+30g/L 蔗糖+8. Og/L 瓊脂，pH5. 8，6)轉(zhuǎn)移至小培 養(yǎng)缽中煉苗培養(yǎng)，7)移栽至溫室或大田。優(yōu)選2_3cm幼穗，薄片約3mm長。所述誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件為于20 21°C暗培養(yǎng)3 4周。所述繼代培養(yǎng)為每7-10天繼代一次。所述分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為于26_28°C光培養(yǎng)2 3周。所述培養(yǎng)出根的標準為苗高3 5cm，根長2 3cm。所述煉苗培養(yǎng)的時間約7-15天。所述甜高粱品種為“BABUSH”和“MN-3025”。本發(fā)明通過對植物激素配比、培養(yǎng)基成分、不同基因型等因素對甜高粱組織培養(yǎng) 的影響比較發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加玉米素2. Omg/L對于幼穗愈傷組織的誘導具有重要的作 用，可以大幅度提高誘愈率；同時在培養(yǎng)基中適量添加8-10mg/L PVP和10mg/L抗壞血酸， 可以有效地減輕褐化現(xiàn)象，促進誘愈率的提高。本發(fā)明建立了甜高粱幼穗愈傷組織培養(yǎng)再 生體系其中愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+ZT 2. 0mg/L+水解酪蛋 白 500mg/L+PVPl0mg/L+ 抗壞血酸 10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7. 2g/L，pH 5. 8 ；繼代培養(yǎng)基 為誘導培養(yǎng)基+KT 0. 2mg/L ；分化培養(yǎng)基為MS+ZT 2. 0mg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-10mg/L+ 水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8. 0g/L瓊脂，pH 5. 8 ；生根培養(yǎng)基為1/2MS+肌醇500mg/ L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+ 蔗糖 30g/L+8. Og/L 瓊脂，pH 5. 8。本發(fā)明利用甜高粱幼穗為外植體，采用特定的培養(yǎng)基成分，不同的培養(yǎng)條件對愈 傷誘導，增殖，分化，直至得到再生植株，本發(fā)明方法能得到較高的愈傷組織誘導率，但是， 不同基因型來源的愈傷組織的胚性狀況及再生能力差別較大。實現(xiàn)結(jié)果表明幼穗是建立甜 高粱再生體系比較理想的一種外植體，可以用于進一步的轉(zhuǎn)化研究。


圖1 甜高粱幼穗組織培養(yǎng)再生體系示意圖。a 幼穗切片接種于誘導培養(yǎng)基；b 誘導產(chǎn)生愈傷；c 愈傷繼代培養(yǎng)；d 愈傷分化 出苗；e 幼苗移入生根培養(yǎng)基；f 幼苗生根；g 移栽溫室；h 植株結(jié)實。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。下面所用的材料均有來源，公眾還可以免費從申請人的實驗室中得到。1.用于甜高粱組織培養(yǎng)的幼穗材料選擇與準備本發(fā)明取旗葉期長約2 5cm的幼穗，用70%酒精進行表面消毒3min，無菌水沖 洗多次；在超凈臺中用刀切成大小均一的薄片接種于誘導培養(yǎng)基[MS基礎培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+ZT(玉米素)2. Omg/L+PVP (聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋 白500mg/L+30g/L蔗糖+7. 2g/L瓊脂pH 5. 8]置于20 21°C暗培養(yǎng)3 4周，使之開始 脫分化，形成愈傷組織；之后選擇生長迅速、質(zhì)地松脆、顏色鮮亮的愈傷組織繼代培養(yǎng)[誘 導培養(yǎng)基+KT(激動素)0. 2mg/L]，每7 10天繼代一次。挑選生長狀態(tài)良好的愈傷組織 接于分化培養(yǎng)基[MS基礎培養(yǎng)基+ZT 2. Omg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-lOmg/L+水解酪蛋白 500mg/L+30g/L蔗糖+8. Og/L瓊脂，pH 5. 8]上26-28°C光培養(yǎng)2 3周，之后將愈傷組織 再生出的苗移入生根培養(yǎng)基[1/2MS基礎培養(yǎng)基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/ L+PVP8-10mg/L+30g/L蔗糖+8. Og/L瓊脂，pH 5. 8]中，當長出根時(苗高3 5cm，根長 2 3cm)，洗去培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到裝有消毒蛭石的小培養(yǎng)缽中煉苗培養(yǎng)7-15d，然后移栽溫室 或大田。2.選擇合適的發(fā)育時期的幼穗誘導愈傷組織不同發(fā)育時期的幼穗(以幼穗長度為準)接種于幼穗培養(yǎng)基上，其愈傷誘導能力 存在差別。幼穗長度小于1. Ocm時誘導愈傷率很低，僅為16. 7%;幼穗長度為1. 0 2. Ocm 時期的誘愈率有所提高，可達到43. 8% ；當幼穗長度在2. 0 3. Ocm時，誘愈率達到最高， 為61. 7%。當幼穗長度大于5. Ocm后，隨著其發(fā)育時期的延長，幼穗長度的增加，愈傷組織 的誘導率逐漸下降(表1)。本實驗結(jié)果表明，甜高粱幼穗長度即幼穗在不同發(fā)育時期對愈 傷組織的誘導具有較大的影響，因此，在以甜高粱幼穗為外植體材料建立組織培養(yǎng)再生體 系或遺傳轉(zhuǎn)化時，應注意選擇適宜的發(fā)育時期的幼穗。表1幼穗長度對愈傷組織誘導的影響
權(quán)利要求
甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法，包括如下步驟1)選取幼穗，旗葉期長約2 5cm幼穗，切成薄片，2)將其接種于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成愈傷組織，所述誘導培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+2，4 D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L瓊脂pH 5.8，3)將愈傷幼穗組織塊在繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)基為誘導培養(yǎng)基+KT 0.2mg/L，4)再將其接于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至出苗，所述分化培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8 10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L瓊脂，pH 5.8，5)將苗移入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)出根，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS基礎培養(yǎng)基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP8 10mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L瓊脂，pH 5.8，6)轉(zhuǎn)移至小培養(yǎng)缽中煉苗培養(yǎng)，7)移栽至溫室或大田。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述幼穗長度為2-3cm，薄片約3mm長。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件為于20 21°C暗培養(yǎng) 3 4周。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述繼代培養(yǎng)為每7-10天繼代一次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為于26-28°C光培養(yǎng) 2 3周。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述培養(yǎng)出根的標準為苗高3 5cm，根長2 3cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述煉苗培養(yǎng)的時間約7-15天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述甜高粱品種為“BABUSH”和“MN-3025”。
全文摘要
本發(fā)明為“甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法”，屬植物基因工程技術領域，包括如下步驟1)選取幼穗，旗葉期長約2-5cm幼穗，切成薄片，2)將其接種于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成愈傷組織，3)將愈傷幼穗組織塊在繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，4)再將其接于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至出苗，5)將苗移入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)出根，6)轉(zhuǎn)移至小培養(yǎng)缽中煉苗培養(yǎng)，7)移栽至溫室或大田。本發(fā)明利用甜高粱幼穗為外植體，采用特定的培養(yǎng)基成分，不同的培養(yǎng)條件對愈傷誘導，增殖，分化，直至得到再生植株，本發(fā)明方法能得到較高的愈傷組織誘導率，實驗結(jié)果表明幼穗是建立甜高粱再生體系比較理想的一種外植體，可以用于進一步的轉(zhuǎn)化研究。
文檔編號A01H4/00GK101946706SQ20101026193
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者朱莉, 李桂英, 郎志宏, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所