一種產(chǎn)油酵母atp檸檬酸裂解酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及自圓紅冬孢酵母分離得到的ATP檸檬酸裂解酶(ACL)及其編碼核苷酸序列和重組載體。利用圓紅冬孢酵母轉錄組測序結果，以圓紅冬孢酵母菌CGMCC2.1389總RNA為模板，利用RT-PCR，分離得到Rt-ACL?cDNA序列，如SEQ?ID?No：1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No：3所示。本發(fā)明通過在紅酵母中表達Rt-ACL基因組DNA序列，能夠提高產(chǎn)油酵母細胞內的油脂含量；另外還通過構建到產(chǎn)油細菌或者產(chǎn)油微藻中的表達載體中，在其中表達來源于Rt-ACL的cDNA序列，也獲得油脂含量的積累。本發(fā)明的ATP檸檬酸裂解酶基因可以用于構建微生物油脂生產(chǎn)細胞。
【專利說明】一種產(chǎn)油酵母ATP檸檬酸裂解酶及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及ATP檸檬酸裂解酶ACL，具體地說是自圓紅冬孢酵母分離的ATP檸檬酸裂解酶基因的克隆、重組載體構建，以及在基因工程研究中的應用。
【背景技術】
[0002]國際石油價格屢創(chuàng)新高，低油價的時代一去不復返。為了保障國家石油安全，緩解石油過度依賴進口的危機，同時有效降低機動車污染物排放，我國正大力推動生物柴油的發(fā)展。生物柴油主要指以動植物油脂為原料，用甲醇或乙醇在催化劑作用下經(jīng)脂交換制成的脂肪酸酯。然而利用動植物油脂為原料存在著與人爭糧與農(nóng)爭地的問題，而微生物因其生長快、基本不依賴耕地、可連續(xù)生產(chǎn)、便于改造等特點，今年來顯示出其突出的特點[趙宗保.中國生物工程雜志2005，25(2)，8-11]。因此利用微生物生產(chǎn)油脂為生物柴油提供原料是現(xiàn)今可選替代方案之一。
[0003]自然界中部分微生物在極端情況(如氮源缺乏)能在胞內積累超過其細胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯為主，這些微生物被稱為產(chǎn)油微生物。主要包括細菌、酵母、霉菌、藻類等。其中產(chǎn)油酵母包括Rhodotorula, Candida, Cryptococcus,Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 屬中的某些菌株[Ratledge C, Wynn J P.AdvAppl Microb1l2002, 51,1-51]。產(chǎn)油細菌包括 Colwellia, Shewanella, Alteromonas,Pseudoalteromonas和Ferrimonas屬中的某些菌株[相光明.糧食與油脂2008 (6), 7-11]。產(chǎn)油微藻包括Chlorella, Nannoch I和Phaeodactylums屬中的某些菌株[鄭洪立，中國生物工程學報2009，29，110-116。王立柱，微生物學通報2010，37，336-347。]
[0004]關于產(chǎn)油酵母，尤其是紅酵母基因工程改造的研究相對匱乏，其在特定條件下積累油脂的機制仍未從分子水平上進行闡明僅僅從生化闡明產(chǎn)油酵母在調控油脂合成代謝過程中可能是ATP檸檬酸裂解酶(ACL)和蘋果酸脫氫酶(ME)起到關鍵作用[Evans，C.T.and C.Ratledge.CanadianJournal of Microb1logyl985,31:1000-1005.]? ACL存在于細胞質中，催化檸檬酸裂解為乙酰輔酶A和草酰乙酸。它廣泛存在于油脂酵母和霉菌中。在非產(chǎn)油酵母(即積累油脂不超過細胞干重20%)中不存在這個酶。近年來，有研究表明，紅發(fā)夫酵母中ACL基因在限氮條件下，隨著氮源的減少活性增大，其活性的提高有助于奸青素的積累[Cipriano Chavez-Cabrera, Zoila R, et al.Appl Microb1lB1technol2010，85:1953-1960.]。另有研究表明，在高山被抱霉(Mortierella alpina)中表達來源于自身的ACL基因，能夠脂肪酸含量得到較大的提高[專利號:200880113428.X]。
[0005]但是，至今為止未有人進行過產(chǎn)油酵母的ACL基因的分離及其基因功能的鑒定，也沒有人使用這個基因進行過油脂的生產(chǎn)。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)油酵母ATP檸檬酸裂解酶蛋白、其編碼核苷酸序列以及應用。具體來說，是一種來源于圓紅冬孢酵母CGMCC2.1389的ATP檸檬酸裂解酶新基因Rt-ACL的克隆和生物功能分析，以及該基因在構建重組載體和構建基因工程菌株領域的應用。
[0007]為實驗上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:
[0008]首先，利用圓紅冬孢酵母轉錄組測序結果，設計cDNA擴增的引物，以圓紅冬孢酵母CGMCC2.1389總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR得到ATP檸檬酸裂解酶基因Rt-ACL，其cDNA具有如序列表SEQ ID NO:1所不的序列，其基因組DNA具有如序列表SEQ ID NO:2所不的序列，其氨基酸具有如序列表SEQ ID NO:3所示的序列。而后通過將其導入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，由于釀酒酵母中不存在ACL基因，因此能夠對ACL的活性進行檢測[Beth L.Fatland, Jinshan Ke, et al.PlantPhys1logy2002,130:740-756.] ?最后通過將這個功能確定的基因在紅酵母自身、其他產(chǎn)油酵母及其他產(chǎn)油細菌、微藻中進行過表達，獲得了油脂含量大量提高的菌株。
[0009]本發(fā)明提供的產(chǎn)油酵母ATP檸檬酸裂解酶，名稱為Rt-ACL (R.toruloidesATP-citrate lyase,圓紅冬孢酵母ATP檸檬酸裂解酶)，來源于圓紅冬孢酵母R.toruloides CGMCC2.1389。所述產(chǎn)油酵母ATP檸檬酸裂解酶是由如下(a)或(b)的蛋白質:
[0010](a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0011](b)將SEQ ID NO:3的氨基酸經(jīng)過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有油脂運和代謝調控相關活性的由SEQ ID NO:3衍生的蛋白質。
[0012]為了使(a)中的蛋白便于純化，可以由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0013]表1標簽及其序列
[0014]
【權利要求】
1.一種ATP檸檬酸裂解酶，所述ATP檸檬酸裂解酶是由如下(a)或(b)的蛋白質: (a)由SEQID NO:3所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將SEQID NO:3的氨基酸經(jīng)過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有油脂運和代謝調控相關活性的由SEQ ID NO:3衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述的ATP檸檬酸裂解酶的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求2所述的核苷酸序列，其為SEQID N0:1。
4.包含權利要求2或3的核苷酸序列的重組載體。
5.一種重組細胞，所述細胞導入權利要求4所述的重組載體。
6.—種構建油脂生產(chǎn)重組細胞的方法，所述方法包括:將權利要求2或3所述的核苷酸序列導入宿主細胞中，得到油脂生產(chǎn)重組細胞。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中通過用權利要求4所述的重組載體轉化宿主細胞而導入權利要求2或3所述的核苷酸序列。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述宿主細胞選自酵母、微藻、紅球菌或大腸桿菌。
9.根據(jù)權利要求8所 述的方法，其中所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或圓紅冬孢酵母(R.toruloides),所述微藻選自衣藻或聚球藻,所述紅球菌是渾池紅球菌(R.0pacus)。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法,其中所述衣藻是萊茵衣藻(C.reinhardtii)。
【文檔編號】C12N9/88GK104031902SQ201310067821
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月4日 優(yōu)先權日:2013年3月4日
【發(fā)明者】趙宗保, 林心萍, 張素芳, 王雅南 申請人:中國科學院大連化學物理研究所