專利名稱：在殺真菌劑篩選中孢子附著測定的應用的制作方法
真菌是植物和人類許多重要疾病的病原體，也引起材料如木材、油漆和塑料的生物性腐蝕。需要不斷發(fā)現(xiàn)新的比已存在的產(chǎn)品更有效的抗真菌化合物，以及具有對環(huán)境更有利和在毒性方面更有利的性質(zhì)。
為了增加成功發(fā)現(xiàn)具有有利性質(zhì)的新抗菌化合物的機率，需要篩選大量盡可能有效的化合物。經(jīng)常地，可利用的供試化合物數(shù)量少，迫使使用一些“離體”篩選形式，即在微量滴定板或其他小容器中評價殺真菌毒性，而不是在植物上測定每一種化合物控制真菌病害的能力。
許多不同的技術(shù)可用于“離體”測定殺真菌毒性。常用的方法包括測定供試化合物在接種了真菌的瓊脂板上產(chǎn)生的生長抑制圈，測定在補加有供試化合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基上的真菌菌落的直徑，在含有補加了供試化合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基的微量滴定板或其他容器上用肉眼或分光光度計評價菌絲體的生長。
萌發(fā)試驗即評價化合物抑制孢子萌發(fā)能力的試驗，也已經(jīng)廣泛地用于體外測定殺真菌毒性。這種方法的優(yōu)越之處是對于許多真菌而言孢子萌發(fā)非常快速地發(fā)生，允許殺真菌毒性的效果在幾個小時之內(nèi)測定，而不象其他經(jīng)典方法得需一天或多天。更大的優(yōu)越性是對于不可能在實驗室培養(yǎng)基上培養(yǎng)的“專性”真菌病原菌如銹菌和白粉病菌可以進行孢子萌發(fā)測定。像這樣的專性病原菌的孢子可從感染的植物上采集，在離體的適當條件下誘導萌發(fā){例如參見，M.A.de Waard，Meded.Fac.Landbouwwetensch.36，113-119(1971)，和J.Gorska-Poczopko，Bulletin de l’Academie Polonaise des Sciences，20，681-684(1972)}。萌發(fā)試驗對于評價抗真菌化合物的作用機制也非常有用。對于許多化合物，孢子萌發(fā)是在真菌生長中對抑制最敏感的階段，而其他具殺真菌毒性的化合物可能對萌發(fā)顯示出很少或無抑制，但對隨后的菌絲體生長存在極強的抑制。因此，萌發(fā)測定與其他測定殺真菌毒性的方法，如測定菌絲體生長的抑制或控制植物、動物或材料上的真菌菌落的方法，可為洞察化合物的殺真菌毒性機制提供有價值的信息。
孢子萌發(fā)試驗的主要缺點是為評價萌發(fā)，需要顯微鏡檢查孢子，這是一種單調(diào)乏味的和強體力勞動的工序，該工序本身導致不能篩選大量的化合物。本發(fā)明通過排除對孢子的顯微觀察的需要而克服了這個困難。
本發(fā)明的基礎是發(fā)現(xiàn)了1、正在萌發(fā)的真菌孢子對基質(zhì)的牢固附著(萌發(fā)-伴生附著)是真菌的一般特性，這可以區(qū)別于在其他發(fā)育階段的真菌附著。
2、萌發(fā)-伴生附著可以被抗真菌化合物抑制。
3、抑制萌發(fā)-伴生附著的能力與抑制孢子萌發(fā)的能力具有良好的相關(guān)性，因此，是一種有用的抑制萌發(fā)能力的測定指標，該能力可用于殺真菌劑的篩選。
因此，萌發(fā)-伴生的孢子附著的測定可以替代基于抑制萌發(fā)能力的化合物篩選時的顯微鏡檢查。
真菌在不同發(fā)育階段與葉子和其他基質(zhì)附著的能力在許多文件中有說明。據(jù)報道，發(fā)生附著的發(fā)育階段包括孢子、已萌發(fā)的孢子、附著孢和菌絲體階段{E.B.G.Jones，Mycological Research，98，961-981(1994)}。在一些情況下，附著被認為是一種被動的過程，而在其他情況下，附著涉及粘性物質(zhì)的活躍分泌{Braun，E.J.和Howard，R.J.，Protoplasma，181，202-212(1994)}。已有人報道，在萌發(fā)之前真菌孢子對表面的附著發(fā)生在各種真菌中，如灰葡萄孢菌{R.P.Doss等，《應用與環(huán)境微生物學》[Applied and Environmental Microbiology]，59，1786-1791(1993)}、Magnaporthe grisea{Hamer，J.E.等，《科學》[Science]，239，288-290(1988)}、菜豆刺盤孢菌{Young，D.H.和Kauss，H.，《應用與環(huán)境微生物學》47，616-619(1984)}，以及喬生刺盤孢菌{Mercure，E.W.等，《生理與分子植物病理學》[Physiological and Molecular PlantPathology]，46，121-135(1995)}。據(jù)報道，在萌發(fā)期間或萌發(fā)后很短時間在真菌中也發(fā)生孢子附著，所述真菌例如有灰葡萄孢菌{R.P.Doss等，《應用與環(huán)境微生物學》61，260-265(1995)}、高粱柄銹菌{Chaubal，R.等，《加拿大植物雜志》[Canadian Journal of Botany]，69，2044-2054(1991)}、以及菜豆單孢銹菌{L.Epstein等，《生理與分子植物病理學》30，373-388(1987)}。由于據(jù)報道對各種真菌而言，在萌發(fā)之前和之后都發(fā)生附著，附著可作為抑制萌發(fā)的殺真菌劑篩選方法的基礎令人驚奇。
Inoue等{《農(nóng)藥科學》[Pesticide Science]，19，145-152(1987)}報道，氯苯噻酮和三環(huán)唑抑制稻梨孢菌附著孢對大麥葉片的附著。然而，在比有助于滲透的萌發(fā)以后的階段，附著孢被某些真菌形成特殊結(jié)構(gòu)。因此，氯苯噻酮和三環(huán)唑通過抑制真菌的黑化起作用，這兩種殺真菌劑對真菌的生長或萌發(fā)幾乎不產(chǎn)生什么效果，應用本發(fā)明的方法不可能檢測到這種效果。Vuddhakel等{Journal of AntimicrobialChemistry，21，755-763(1988)}報道，白色假絲酵母菌(該菌為人類病原真菌)的酵母形態(tài)，對滌綸織物纖維的附著被各種抗真菌藥抑制。這個報告與本發(fā)明無關(guān)，因為白色假絲酵母菌的酵母形態(tài)通過芽生機制生長，而不是如本發(fā)明方法中提到的真菌是通過芽管發(fā)育的。值得注意的是，吡咯抗菌劑和阿莫羅芬被發(fā)現(xiàn)能抑制假絲酵母菌的附著，然而已知這些化合物作為麥角甾醇生物合成抑制劑，對真菌孢子的萌發(fā)很少有影響，但卻對隨后的菌絲體生長有影響作用。
本發(fā)明提出一種測定潛在的殺真菌化合物的抗真菌活性的方法，所述化合物防止真菌產(chǎn)生能萌發(fā)的孢子或分生孢子，該方法包括以下步驟(i)將含在水中或含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中的真菌孢子懸浮液施加在一種含有潛在的殺真菌化合物(處理)或不含有潛在的殺真菌化合物(對照)的基質(zhì)表面上，(ii)在適合孢子萌發(fā)的一定溫度下培養(yǎng)足夠長的時間以使萌發(fā)發(fā)生，(iii)除去未結(jié)合的孢子，(iv)測定與含有或不含有潛在的殺菌化合物的基質(zhì)表面結(jié)合的孢子數(shù)或真菌材料的數(shù)量，(v)確定上述潛在的殺真菌劑對真菌的毒性效果，通過將處理樣品與對照比較，用與表面結(jié)合的孢子或真菌材料的數(shù)量的減少來表示所述的毒性效果。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種測定潛在的殺真菌化合物的抗真菌活性的方法，所述化合物防止真菌產(chǎn)生能萌發(fā)的孢子或分生孢子，該方法包括以下步驟(i)將含在水中或含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中的真菌孢子懸浮液施加在一種含有潛在的殺真菌化合物(處理)或不含有潛在的殺真菌化合物(對照)的基質(zhì)表面上，(ii)在適合孢子萌發(fā)的一定溫度下培養(yǎng)足夠長的時間以使萌發(fā)發(fā)生，(iii)通過測定處理與對照樣品中未與基質(zhì)表面結(jié)合的孢子數(shù)或真菌材料的數(shù)量，并將該數(shù)量從孢子總數(shù)或真菌材料總量中減去，來確定與含有或不含有潛在的殺菌化合物的基質(zhì)表面結(jié)合的孢子數(shù)或真菌數(shù)量，(iv)確定上述潛在的殺真菌劑對真菌的毒性效果，通過將處理樣品與對照比較，用與表面結(jié)合的孢子或真菌材料的數(shù)量的減少來表示所述的毒性效果。
與基質(zhì)結(jié)合的孢子或真菌材料的數(shù)量可以通過適當?shù)募夹g(shù)來確定。根據(jù)在未結(jié)合的孢子群落中的孢子數(shù)或真菌材料的數(shù)量的測定，相似的技術(shù)可以被用于評價附著。可以用于計數(shù)結(jié)合或未結(jié)合的孢子或真菌材料的技術(shù)實例包括，但不必限于a)通過視覺檢查或借助于成像分析設備的顯微鏡分析，b)細胞計數(shù)設備的使用，如Coulter Counter，c)基于本身固有顏色的、發(fā)熒光的或發(fā)冷光的細胞組分，用分光光度計、熒光測定儀或光檢測設備計數(shù)孢子，d)在附著之前或者之后對孢子細胞組分染色，并針對具體的染色選用適當?shù)姆止夤舛扔?、熒光測定儀或光檢測設備來定量附著，e)化學分析，和f)在附著之前或者之后利用放射活性材料標記孢子細胞組分，并通過測定摻入的放射活性來測定孢子的附著。
應當可以理解，在附著測定中為了便于發(fā)現(xiàn)附著的孢子，可對真菌本身進行處理。例如，真菌通常可以被遺傳修飾成能表達一個易于發(fā)現(xiàn)的標志如綠色熒光蛋白質(zhì)、顏料或熒光染料。
在孢子附著測定中，可以使用的基質(zhì)實例包括(但不必限于)，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯(Permanox)、聚甲基丙烯酸甲酯(Plexiglas)和玻璃。測定可以采用一種能讓有機體在其上繁殖的天然或合成的基質(zhì)，如植物或動物細胞和組織、皮革、木材、紡織品、金屬或塑料。
本發(fā)明的方法可以用于篩選對子囊菌綱、擔子菌綱和半知菌綱的抗真菌活性，這幾類真菌產(chǎn)生具有萌發(fā)能力的孢子或分生孢子。其實例包括(但不必限于)葡萄孢菌、Magnaporthe spp.、刺盤孢菌、曲霉菌、柄銹菌、單孢銹菌、白粉菌、鐮孢菌、鏈格孢菌、青霉菌、長蠕孢菌、黑星菌、尾孢菌、殼針孢菌、球腔菌、鉤絲殼霉菌、柄球菌、鏈核盤菌、單絲殼菌、核腔菌、假尾孢菌、嘴孢菌、核盤菌、莖點霉菌。
下面的實施例是為實踐本發(fā)明而提供的進一步的指導。實施例1 灰葡萄孢菌的孢子附著和萌發(fā)之間的時間相關(guān)性灰葡萄孢菌于室溫在熒光燈照射下，生長在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上，每14天繼代培養(yǎng)。為制備孢子懸浮液，將20ml無菌水milliQTM加入培養(yǎng)盤中(10-14天齡)，表面用無菌環(huán)輕輕刮擦。液體通過玻璃棉過濾，以除去菌絲體碎片，然后將孢子濃度調(diào)節(jié)到需要的濃度。
測定在聚甲基戊烯孔狀載片(雙孔載片Lab-Tek Permanox，NuncInc.)上進行?？谞钶d片孔或者容納了5μl二甲基亞砜(DMSO)(對照)或者容納了溶于DMSO中的供試化合物，接著加入500μl Sabouraud葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB，從Difco實驗室取得)。然后加入濃度為200000孢子/ml的孢子水懸浮液(500μl)，輕輕地混合，再將小瓶或載片在25℃下溫育所需的一定的時間。為評價孢子附著，未附著孢子的數(shù)量測定通過將液體轉(zhuǎn)移到計數(shù)小瓶中，馬上加入1ml IsotonII計數(shù)液體到孔中，輕輕地搖動沖洗孔狀載片孔一次，然后把沖洗液體也倒入計數(shù)小瓶中。將計數(shù)液體(14ml)加入小瓶中，用Coulter Counter(Coulter科學儀器公司)細胞計數(shù)儀對孢子計數(shù)。附著孢子的數(shù)量通過從孢子的總數(shù)中減去未附著孢子的數(shù)量來計算，以百分率表示(附著％)。為評價萌發(fā)，在孔狀載片中的總孢子群落用5％戊二醛固定，即通過加入0.077ml70％戊二醛到孔狀載片孔中。為了證明芽管長出，萌發(fā)孢子數(shù)量用顯微鏡最少檢查100個孢子來確定。萌發(fā)孢子的數(shù)量以總數(shù)的百分率表示(萌發(fā)％)。下表的數(shù)據(jù)顯示出孢子對載片的附著是時間依賴性的，并該附著與孢子萌發(fā)的時間-過程密切地平行。
實施例2.殺真菌劑對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)-伴生的附著的影響評價各種殺真菌劑抑制萌發(fā)-伴生孢子對聚苯乙烯計數(shù)小瓶、聚甲基戊烯(Permanox)孔狀載片和96孔平底聚苯乙烯微量滴定板附著的抑制能力，以及對孢子萌發(fā)和菌絲體生長的影響(見下表)。同實施例1一樣在孔狀載片上的附著測定和萌發(fā)測定均在25℃下培養(yǎng)5小時。在計數(shù)小瓶中的附著測定在20ml容量的聚苯乙烯計數(shù)小瓶(VWRcat.no.14310-640)中進行。計數(shù)小瓶容納了5μlDMSO(對照)或者溶于DMSO中的供試化合物，接著加入500μl SDB。然后加入濃度為200000孢子/ml的孢子水懸浮液(500μl)，輕輕地混合，將小瓶或載片在25℃下溫育5.5小時。為了確定未結(jié)合孢子的數(shù)量，將15ml計數(shù)液體加入小瓶中，蓋上瓶蓋，輕輕地上下顛倒5次，然后用Coulter Counter細胞計數(shù)儀計數(shù)。
為了在微量滴定板中進行附著測定，供試化合物的儲液以DMSO制備，然后用SDB稀釋，如此之后使DMSO濃度在稀釋后≤2％。這些供試化合物溶液的兩倍系列稀釋液在96孔平底微量滴定板上中用SDB(100μl)制備。孢子懸浮液(濃度2×105孢子/ml，共100μl)被加入到孔中，將滴定板在25℃下培養(yǎng)5.5小時。為了除去盡可能多的液體，通過倒轉(zhuǎn)和輕拍微量滴定板將含有未結(jié)合孢子的培養(yǎng)基除去。附著孢子的計數(shù)通過用磺若丹明B{(Skehan等，Journal of the National CancerInstitute，82，1107-1112(1990)}染色來測定它們的細胞蛋白質(zhì)含量，在564nm下測定吸光率。附著抑制通過含有殺真菌劑孔中的吸光率值與無殺真菌劑的對照孔中的吸光率值比較確定。EC50值從劑量反應曲線求得。
菌絲體生長抑制在有毒的瓊脂中測定評價。每一個供試殺真菌劑的4倍系列稀釋液以DMSO制備，并將每一稀釋液125μl加入25ml熔化的麥芽提取物瓊脂(每升含20g麥芽提取物，20g葡萄糖，1g蛋白胨和20g瓊脂)中。將含有供試化合物的培養(yǎng)基立刻倒入9cm直徑的皮氏培養(yǎng)皿中。每一種處理使用兩個重復培養(yǎng)皿。每一皿用在PDA上培養(yǎng)的灰葡萄孢菌的生長邊緣采集的直徑7mm的活塞接種。菌落直徑在黑暗中25℃下連續(xù)生長3天后測量。EC50值從劑量反應曲線求得。
結(jié)果在下面表中給出。每一種供試化合物在3種附著測定中的EC50值是相似的。孢子附著對所有抑制萌發(fā)的化合物(萌發(fā)抑制劑，GI)在低濃度(＜2ppm)下敏感。相反地，在低濃度下不抑制萌發(fā)的化合物(萌發(fā)后起作用的化合物，AG)，由于菌絲體生長比萌發(fā)更敏感地受到它們的抑制，在孢子附著測定中它們具有很少的活性或無活性。附著抑制EC50同萌發(fā)抑制EC50大體上類似。<
>*GI＝萌發(fā)抑制劑，AG＝萌發(fā)后起作用的化合物實施例3.醚菌酯對灰葡萄孢菌孢子在Plexiglas載片上萌發(fā)-伴生附著的影響測定在定做的以Plexiglas制造的孔狀載片上進行。孔狀載片孔中容納了5μl DMSO(對照)或者溶于DMSO中的醚菌酯(殺真菌劑)，接著加入500μl SDB。然后加入濃度為200000孢子/ml的孢子水懸浮液(500μl)，輕輕地混合，將小瓶或載片在25℃下培養(yǎng)所需的一定時間。未附著孢子的數(shù)量測定通過將液體轉(zhuǎn)移到計數(shù)小瓶中，馬上加入1ml計數(shù)液體到孔中輕輕地搖動，沖洗孔狀載片一次，然后把沖洗液體倒入計數(shù)小瓶中。再將計數(shù)液體(14ml)加入小瓶中，用Coulter Counter細胞計數(shù)儀計數(shù)孢子。附著孢子的數(shù)量通過從總孢子數(shù)減去未附著孢子的數(shù)量來計算，以百分率表示(附著％)。結(jié)果(見下表)顯示了正在萌發(fā)的灰葡萄孢菌孢子對Plexiglas載片的附著和醚菌酯抑制附著的能力。
實施例4.醚菌酯對灰葡萄孢菌孢子在玻璃小瓶中萌發(fā)-伴生附著的影響測定在27×55mm硼硅酸鹽玻璃小瓶中進行，所述小瓶從Kimble玻璃股份有限公司取得。小瓶容納了5μl DMSO(對照)或者溶于DMSO中的醚菌酯，接著加入500μl SDB。然后加入濃度為200000孢子/ml的孢子水懸浮液(500μl)，輕輕地混合，將小瓶在25℃下溫育所需的一定時間。為了確定未附著孢子的數(shù)量，將15ml計數(shù)液體加入小瓶中，蓋上蓋子，輕輕地上下顛倒5次，用Coulter Counter細胞計數(shù)儀計數(shù)孢子。附著孢子的數(shù)量通過從總孢子數(shù)減去未附著孢子的數(shù)量來計算，以百分率表示(附著％)。結(jié)果(見下表)顯示了正在萌發(fā)的灰葡萄孢菌孢子對玻璃的附著和醚菌酯抑制附著的能力
實施例5.醚菌酯對灰葡萄孢菌孢子在聚乙烯小瓶上萌發(fā)-伴生附著的影響測定在26.9×59.5mm聚乙烯小瓶(PolyQ小瓶，從Beckman儀器股份有限公司取得)中進行。小瓶容納了5μl DMSO(對照)或者溶于DMSO中的醚菌酯，接著加入500μl SDB。然后加入濃度為200000孢子/ml的孢子水懸浮液(500μl)，輕輕地混合，將小瓶在25℃下溫育所需的一定時間。為了確定未附著孢子的數(shù)量，將15ml計數(shù)液體加入小瓶中，蓋上蓋子，輕輕地上下顛倒5次，然后用Coulter Counter細胞計數(shù)儀計數(shù)孢子。附著孢子的數(shù)量通過從總孢子數(shù)減去未附著孢子的數(shù)量來計算，以百分率表示(附著％)。結(jié)果(見下表)顯示了正在萌發(fā)的灰葡萄孢菌孢子對聚乙烯的附著和醚菌酯抑制附著的能力。
實施例6.醚菌酯對灰葡萄孢菌孢子在聚丙烯小瓶上萌發(fā)-伴生附著的影響測定在25×56mm RediPaKStarline聚丙烯小瓶中進行，所用小瓶從Wheaton科學產(chǎn)品公司取得。小瓶容納了5μl DMSO(對照)或者溶于DMSO中的醚菌酯，接著加入500μl SDB。然后加入濃度為200000孢子/ml的孢子水懸浮液(500μl)，輕輕地混合，將小瓶在25℃下溫育所需的一定時間。為了確定未附著孢子的數(shù)量，將15ml計數(shù)液體加入小瓶中，蓋上蓋子，輕輕地上下顛倒5次，用Coulter Counter細胞計數(shù)儀計數(shù)孢子。附著孢子的數(shù)量通過從總孢子數(shù)減去未附著孢子的數(shù)量來計算，以百分率表示(附著％)。結(jié)果(見下表)顯示了正在萌發(fā)的灰葡萄孢菌孢子對聚丙烯的附著和醚菌酯抑制附著的能力。
實施例7.菜豆毛盤孢菌孢子在附著和萌發(fā)之間的時間相關(guān)性菜豆毛盤孢菌在黑暗中25℃下用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)，每7-14天繼代培養(yǎng)。為了制備懸浮液，將15ml無菌水加入培養(yǎng)盤中(7-10天時間)，并將培養(yǎng)盤在旋轉(zhuǎn)搖動器上輕輕地搖動10分鐘，以便釋放孢子。制得的孢子懸浮液通過玻璃棉過濾，并調(diào)節(jié)到需要的濃度。孢子附著測定和萌發(fā)測定同實施例1針對葡萄孢菌所描述的那樣進行，除了SDB培養(yǎng)基含吐溫20(40ppm)以及制備的孢子接種體濃度為5×105孢子/ml以外。下表的數(shù)據(jù)顯示出孢子對載片附著的時間依賴性，并該附著同孢子萌發(fā)的時間過程具有密切的平行性。
實施例8.殺真菌劑對葫蘆科刺盤孢菌孢子附著的影響評價各種殺真菌劑抑制孢子附著能力的試驗在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中和Permanox孔狀載片上進行，并測定這些殺真菌劑對孢子萌發(fā)和菌絲體生長的影響。測定同實施例2針對葡萄孢菌所描述的那樣進行，除了SDB培養(yǎng)基含吐溫20(40ppm)、制備的孢子接種體濃度為5×105孢子/ml，以及附著和萌發(fā)測定采用8小時的溫育以外。結(jié)果顯示于下表。對微量滴定板和孔狀載片的附著抑制，每一種供試化合物的EC50值是相似的。孢子附著對所有在低濃度(＜2ppm)下抑制萌發(fā)的化合物敏感。相反，不抑制萌發(fā)的多菌靈，由于菌絲體生長比萌發(fā)更敏感地受到它的抑制，它在孢子附著測定中具有很少的活性或無活性。附著抑制EC50同萌發(fā)抑制EC50大體上類似。
*GI＝萌發(fā)抑制劑，AG＝萌發(fā)后起作用的化合物實施例9.殺真菌劑對構(gòu)巢曲霉菌孢子附著的影響評價各種殺真菌劑抑制孢子附著能力的試驗在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中進行。附著測定同實施例2針對葡萄孢菌所描述的那樣進行，除了所制備的孢子接種體濃度為2×106孢子/ml以及滴定板在37℃下溫育8小時以外。如下表所示，萌發(fā)抑制劑(醚菌酯、氟啶胺和百菌清)是高度有效的孢子附著抑制劑，而苯菌靈卻不是，它在萌發(fā)后發(fā)揮作用，是高度有效的菌絲體生長抑制劑。
*GI＝萌發(fā)抑制劑，AG＝萌發(fā)后起作用的化合物實施例10.Magnaporthe grise孢子附著和萌發(fā)之間的時間相關(guān)性孢子從在皮氏培養(yǎng)皿中生長在馬鈴薯葡萄糖瓊脂上Magnaporthegrisea培養(yǎng)物上采集，為了取出孢子，向培養(yǎng)皿中加入水，輕輕地刮擦表面。制得的懸浮液通過玻璃棉過濾，除去菌絲體碎片，將濃度調(diào)節(jié)到2×105孢子/ml。孢子懸浮液(100μl)加入96孔平底聚苯乙烯微量滴定板的孔中，滴定板的各孔中含100μl酵母提取物葡萄糖培養(yǎng)基(YEG，每升水含30g葡萄糖和4g酵母提取物)，以及在黑暗中25℃下培養(yǎng)。在選定的時間，采用5％戊二醛固定孢子來評價孢子萌發(fā)，通過顯微鏡檢查測定已萌發(fā)孢子的數(shù)量，計算出占總數(shù)的百分率。另一滴定板用于測定孢子附著為了盡可能除去更多的液體，通過倒轉(zhuǎn)和輕拍微量滴定板除去未結(jié)合的孢子。附著孢子的計數(shù)通過用磺若丹明B染色測定它們的細胞蛋白質(zhì)含量來實現(xiàn)，也可以通過在染色過程結(jié)束時計數(shù)每一孔限定面積中孢子的數(shù)量。下表的數(shù)據(jù)顯示出孢子對微量滴定板附著的時間依賴性，該附著同孢子萌發(fā)的時間-過程具有密切的平行性。
Magnaporthe grisea在微量滴定板中孢子附著和萌發(fā)的時間過程
實施例11.各種殺真菌劑對Magnaporthe grisea孢子萌發(fā)-伴生附著的影響在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中進行評價各種殺真菌劑抑制孢子附著的能力。供試化合物的儲液以DMSO制備，然后用YEG稀釋，如此之后使DMSO濃度在稀釋后≤2％。這些供試化合物溶液的兩倍系列稀釋液在96孔平底微量滴定板中用YEG(100μl)制備。將孢子懸浮液(濃度2×105孢子/ml，共100μl)加入到孔中，并將滴定板在黑暗中25℃下溫育6小時。為了盡可能除去更多的液體，通過倒轉(zhuǎn)和輕拍微量滴定板除去未結(jié)合的孢子。附著孢子的計數(shù)通過用磺若丹明B染色測定它們的細胞蛋白質(zhì)含量。附著抑制通過含有殺真菌劑孔中的吸光率值與無殺真菌劑的對照孔中的吸光率值比較來確定。附著抑制EC50值從劑量反應曲線求得。如下表所示，已知的抑制孢子萌發(fā)的化合物，如孢子葉球素(strobilurin)類型的化合物醚菌酯和嘧菌酯，以及多作用點殺真菌劑(百菌清和代森錳鋅)是強烈的萌發(fā)-伴生附著的抑制劑。咪酰胺，一種通過抑制麥角甾醇生物合成而起作用的殺真菌劑，以及破壞細胞微管的甲基硫菌靈，在孢子附著測定中具有很少或無活性。這與它們對萌發(fā)幾乎無影響，而對菌絲體生長有很強的抑制的事實相一致。<
>*GI＝萌發(fā)抑制劑，AG＝萌發(fā)后起作用的化合物實施例12.小麥隱匿柄銹菌孢子附著和萌發(fā)之間的時間相關(guān)性小麥隱匿柄銹菌的孢子從重感染的小麥葉片上用0.05％吐溫20的水溶液洗滌采得。制得的孢子懸浮液通過粗棉布過濾除去葉片污染材料，用0.05％吐溫20稀釋得到2×105孢子/ml的濃度。
孢子懸浮液(2×106孢子/ml，50μl)加入96孔平底聚苯乙烯微量滴定板的孔中，滴定板的各孔中含50μl 0.05％吐溫20。將滴定板置于室溫下10分鐘，然后在黑暗中19℃下溫育，用旋轉(zhuǎn)搖動器在100rpm下連續(xù)搖動。在選定的時間，采用5％戊二醛固定孢子來評價孢子萌發(fā)，通過顯微鏡檢查測定已萌發(fā)孢子的數(shù)量，并計算出占總孢子數(shù)的百分率。另一滴定板用于測定孢子附著為了盡可能除去更多的液體，通過倒轉(zhuǎn)和輕拍微量滴定板除去未結(jié)合孢子。附著孢子的計數(shù)通過用磺若丹明B染色測定它們的細胞蛋白質(zhì)含量來實現(xiàn)，也可以通過在染色過程結(jié)束時計數(shù)每一孔限定面積中孢子的數(shù)量。下表的數(shù)據(jù)顯示出，如同通過磺若丹明B染色測定或者通過計數(shù)附著孢子的數(shù)量所得出的結(jié)果，孢子以時間依賴的方式對載片附著，并且該附著同孢子萌發(fā)的時間-過程具有密切的平行性
實施例13.各種殺真菌劑對小麥隱匿柄銹菌萌發(fā)-伴生附著的影響在微量滴定板中進行評價各種殺真菌劑抑制孢子附著的能力。供試化合物的儲液以DMSO制備，然后用0.05％吐溫20稀釋，如此之后使DMSO濃度在稀釋后≤2％。這些供試化合物溶液的兩倍系列稀釋液用0.05％吐溫20(50μl)在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中制備。將孢子懸浮液(濃度2×105孢子/ml，50μl)加入到各孔中。將滴定板置于室溫下10分鐘，然后在黑暗中19℃下溫育4小時，同時用旋轉(zhuǎn)搖動器在100rpm下連續(xù)搖動。為了盡可能除去更多的液體，通過倒轉(zhuǎn)和輕拍微量滴定板除去未結(jié)合的孢子。附著孢子的計數(shù)通過用磺若丹明B染色測定它們的細胞蛋白質(zhì)質(zhì)含量來實現(xiàn)。附著抑制通過含有殺真菌劑孔中的吸光率值與無殺真菌劑的對照孔中的吸光率值比較來確定。附著抑制EC50值從劑量反應曲線求得。如下表所示。已知的抑制孢子萌發(fā)的化合物，如甲酰苯胺類(噻呋酰胺和萎銹靈)、孢子葉球素類型的化合物醚菌酯和氟啶胺，以及多作用點殺真菌劑(百菌清和代森錳鋅)均抑制萌發(fā)-伴生附著。通過抑制麥角甾醇生物合成而起作用的殺真菌劑(腈苯唑和腈菌唑)在孢子附著測定中具有很少或無活性。這與這些的化合物對孢子萌發(fā)不如對菌絲體生長敏感的事實相一致。
*GI＝萌發(fā)抑制劑，AG＝萌發(fā)后起作用的化合物
權(quán)利要求
1.一種測定潛在的殺真菌化合物的抗真菌活性的方法，所述化合物防止真菌產(chǎn)生能萌發(fā)的孢子或分生孢子，該方法包括以下步驟(i)將含在水中或含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中的真菌孢子懸浮液施加在一種含有或不含有潛在的殺真菌化合物的基質(zhì)表面上，(ii)在適合孢子萌發(fā)的一定溫度下培養(yǎng)足夠長的時間以使萌發(fā)發(fā)生，(iii)除去未結(jié)合的孢子，(iv)測定與含有或不含有潛在的殺菌化合物的基質(zhì)表面結(jié)合的孢子數(shù)或真菌材料的數(shù)量，(v)確定上述潛在的殺真菌劑對真菌的毒性效果，通過將處理樣品與對照比較，用與基質(zhì)表面結(jié)合的孢子或真菌材料的數(shù)量的減少來表示所述的毒性效果。
2.一種測定潛在的殺真菌化合物的抗真菌活性的方法，所述化合物防止真菌產(chǎn)生能萌發(fā)的孢子或分生孢子，該方法包括以下步驟(i)將含在水中或含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中的真菌孢子懸浮液施加在一種含有或不含有潛在的殺真菌化合物的基質(zhì)表面上，(ii)在適合孢子萌發(fā)的一定溫度下培養(yǎng)足夠長的時間以使萌發(fā)發(fā)生，(iii)通過測定處理與對照樣品中未與基質(zhì)表面結(jié)合的孢子數(shù)或真菌材料的數(shù)量，并將該數(shù)量從孢子總數(shù)或真菌材料總量中減去，來確定與含有或不含有潛在的殺菌化合物的基質(zhì)表面結(jié)合的孢子數(shù)或真菌數(shù)量，(iv)確定上述潛在的殺真菌劑對真菌的毒性效果，通過將處理樣品與對照比較，用與基質(zhì)表面結(jié)合的孢子或真菌材料的數(shù)量的減少來表示所述的毒性效果。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述真菌選自子囊菌綱、半知菌綱和擔子菌綱。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述真菌的種選自葡萄孢菌、Magnaporthe、毛盤孢菌、曲霉菌、柄銹菌、單孢銹菌、白粉菌、鐮孢菌、鏈格孢菌、青霉菌、長蠕孢菌、黑星菌、尾孢菌、殼針孢菌、球腔菌、鉤絲殼霉菌、柄球菌、鏈核盤菌、單絲殼菌、核腔菌、假尾孢菌、嘴孢菌、核盤菌和莖點霉菌。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中通?？蓪λ稣婢M行遺傳修飾，使之能表達易于檢測的信號如綠色熒光蛋白質(zhì)、顏料或熒光染料。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述基質(zhì)是聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃，或一種能使真菌在其上長成菌落的天然或合成的基質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述天然或合成的基質(zhì)是植物或動物細胞或組織、皮革、木材、紡織品、金屬或塑料。
全文摘要
本發(fā)明提出一種方法,根據(jù)測定真菌孢子對基質(zhì)抑制萌發(fā)－伴生附著能力來篩選具有殺真菌毒性的化合物。該方法用于發(fā)現(xiàn)抑制真菌孢子萌發(fā)的化合物。
文檔編號C12N1/14GK1260482SQ0010028
公開日2000年7月19日 申請日期2000年1月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月13日
發(fā)明者戴維·漢密爾頓·揚, 理查德·安德魯·斯拉維奇 申請人:羅姆和哈斯公司