專利名稱：源于梨孢菌的控制真菌附著胞成熟與致病力的基因MgPTH12及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病理學(xué)、農(nóng)藥學(xué)和微生物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過插入突變、基因互補和基因敲除證明了一個源于梨孢菌的控制附著胞成熟和致病力的MgPth12基因。該基因可能編碼一個轉(zhuǎn)錄因子，其缺失導(dǎo)致梨孢菌對水稻的致病力顯著降低。因此，該基因及其編碼的功能蛋白的表達可以作為靶位點用于抗真菌藥劑的篩選與設(shè)計中。
背景技術(shù)：
梨孢菌(Magnaporthe grisea)是子囊菌亞門的真菌，能侵染水稻、小麥、大麥、粟以及其它多種禾本科植物，導(dǎo)致瘟病。尤其是該菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各個栽培稻區(qū)每年均有發(fā)生，危害廣泛、嚴重。一般情況下，稻瘟病的危害可使水稻減產(chǎn)5-10％，重病田可導(dǎo)致水稻絕收。稻瘟病在我國曾多次流行，也是我國水稻的主要病害之一。1993年，稻瘟病在我國發(fā)生大流行，在全面防治的情況下仍然減產(chǎn)上百億斤。2004年，重慶和四川等省市暴發(fā)大面積的稻瘟病，僅重慶的合川市(縣級市)就有2萬畝水稻嚴重發(fā)生稻瘟病，其中近5000畝水稻絕收。梨孢菌還可侵染鈍葉草、狗牙草、假儉草等屬的草坪草，造成大面積枯死，是草坪草常見病害。
許多植物病原真菌的侵染過程包括分生孢子與寄主表面的接觸、孢子萌發(fā)、附著胞和侵染性釘形成、侵染菌絲擴展等環(huán)節(jié)。其中，附著胞是梨孢菌等許多植物病原真菌致病過程中形成的一種侵染必需的結(jié)構(gòu)。梨孢菌附著胞是一種呈半球狀、四周沉積著黑色素的侵染結(jié)構(gòu)。黑色素的沉積使得附著胞能承受病菌侵染時由于甘油累積產(chǎn)生的巨大的膨壓(8.0Mpas或1161Psi；Howard，1991)，從而驅(qū)使侵染釘主動刺破寄主表皮，然后分化出泡狀初生侵染菌絲和次生侵染菌絲，在寄主細胞內(nèi)和細胞間隙蔓延。缺少黑色素沉積的附著胞喪失侵入能力，病原菌從而喪失致病性。
附著胞的發(fā)育與成熟是一個極其復(fù)雜的過程。目前已克隆的與梨孢菌附著胞形成有關(guān)的基因，包括MPG1(Talbot et.al.1993)、CPKA(Mitchel and Dean，1995)、MAGB(Liu and Dean.1997)、PMK1(Xu and Hamer 1996)、ACR1(Lau and Hamer，1998)、MAC1(Chaoi and Dean 1997)；PTH11(DeZwaan et.al.1999)和CBP1(Kamakura et.al.2002)。其中MPG1、MAGB、PTH11和CBP1等基因產(chǎn)物的功能是感知外界信號，MPG1編碼的疏水蛋白與稻葉表面的信號分子互作，將產(chǎn)生的信號傳遞給MagB編碼的異源三聚體G蛋白上的α亞基，G蛋白α亞基激活由MAC1編碼的腺苷酸環(huán)化酶，從而激活了cAMP信號傳導(dǎo)途徑(Liu and Dean，1997；Choi andDean，1997)。cAMP結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)亞基，使其釋放催化亞基，催化亞基磷酸化下游的目標蛋白。Δcpka突變體的附著胞形成推遲，沒有致病性，但能從傷口侵入，引起發(fā)病。由PTH11編碼的PTH11p也在附著胞形成途徑的上游起作用，PTH11p可能刺激細胞內(nèi)脂類的降解，釋放甘油二酯，甘油二酯作為信號分子刺激附著胞的形態(tài)建成(DeZwaan et al.，1999)。ACR1缺失突變體的附著胞形成率降低(Lau andHamer，1998)。PMK1調(diào)節(jié)附著胞分化的起始，Δpmkl在任何接觸面上都不能形成附著胞，直接把孢子注射水稻組織也沒有致病性；外源cAMP雖然能使突變體形成附著胞早期的鉤狀結(jié)構(gòu)，但不能形成成熟的附著胞，也不產(chǎn)生膨壓，因而喪失了致病性(Xu and Hamer 1996)。
此外，還有一些附著胞形成受影響的遺傳位點得以鑒定，但基因還未克隆，如CON1 and CON7(Shi and Leung 1995)；APF1(Silue et.al.1998)；APP1，APP2 andAPP3(Zhu et.al.1996)；APP5(Chun and Lee 1999)。盡管如此，梨孢菌附著胞分化和形成機制仍不十分明晰。
本發(fā)明通過插入突變途徑克隆了梨孢菌中一個控制附著胞成熟和致病力的新基因MgPTH2。該基因的缺失導(dǎo)致梨孢菌不能形成正常形態(tài)和黑化的附著胞，且顯著降低了侵染釘?shù)男纬赡芰?，并在感病水稻品種上的致病力顯著降低。因此，該基因及其編碼蛋白的表達和修飾可作為設(shè)計、篩選抗真菌藥物的靶標。此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberellamoniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等植物病原真菌中也存在與梨孢菌MGPTH12在氨基酸序列一致性高于40％以上的同源蛋白，可能具有相似的生物學(xué)功能，因此這些真菌中同源蛋白的表達和修飾也可作為靶標篩選抗真菌藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的旨在以梨孢菌為模式，提供一個新的控制真菌附著胞成熟和致病力的基因。該基因在梨孢菌命名為MgPTH12，其特征為如SEQ ID NO1所示的的第1位到第5526位的核苷酸序列。該基因的特征還在于其編碼的cDNA和蛋白質(zhì)分別具有SEQ ID NO2所示的的第1位到第2164位的核苷酸序列和SEQ ID NO3所示的的第1位到第470位的氨基酸序列。該基因的啟動子如SEQ ID NO1所示的的第1位到第1940位的核苷酸序列。MgPTH12編碼的蛋白MGPTH12具有Homeobox，但與目前已知功能的蛋白在氨基酸水平上沒有明顯的相似性。因此，MgPTH12是一個新的基因。
本發(fā)明所提供的基因MgPTH12是通過插入突變途徑從梨孢菌中克隆的。具體過程包括首先，通過篩選梨孢菌REMI轉(zhuǎn)化體庫獲得致病力降低的突變體；然后，通過遺傳雜交和Southrn雜交分析確定突變體的致病力降低突變表型與插入標記的遺傳共分離情況；進一步，通過質(zhì)粒拯救獲得共分離突變體中插入標記的側(cè)翼序列，并以該側(cè)翼序列為探針篩選基因組TAC文庫和適當?shù)拿盖蝎@得含有目的基因的DNA片段；最后，采用互補實驗、敲除實驗和分離的cDNA來進行目的基因的功能驗證和注釋。本發(fā)明通過篩選從梨孢菌REMI轉(zhuǎn)化體庫獲得了一個突變體X3073。
本發(fā)明所涉及的梨孢菌REMI轉(zhuǎn)化體庫是指通過限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的質(zhì)粒整合技術(shù)(Restrict Enzyme Mediated Integration，REMI)構(gòu)建的、含有幾萬個獨立轉(zhuǎn)化體的梨孢菌菌株群體。
本發(fā)明所涉及的突變體篩選主要包括兩個方面一是將孢子接種于洋蔥內(nèi)表皮上，觀察其侵染過程；另一個方面是將孢子接種于感病水稻葉片上，觀察其在水稻品種上的致病力。對這兩方面的測定，本發(fā)明都采用了常規(guī)的噴霧接種的方法。本發(fā)明所獲得的突變體X3073在附著胞形成率、侵染釘形成率和致病力上與野生型相比，具有明顯的缺陷。
本發(fā)明中的遺傳共分離分析是指分析突變體中插入標記潮霉素抗性基因與突變表型的共分離情況。所采用的方法是遺傳雜交的方法。即將突變體與一個不具有突變表型和潮霉素抗性的、并且交配型相反的菌株進行雜交，分析其子囊孢子后代的孢子萌發(fā)率、附著胞形成率、侵染釘形成率、致病力與潮霉素抗性。如果其中所有不具有潮霉素抗性的后代均為野生型，則說明該突變體的突變表型與插入標記潮霉素抗性基因是共分離的，即該突變體為插入突變體。本發(fā)明所獲得的突變體X3073在附著胞形成率、侵染釘形成率和致病力上的缺陷表型與插入標記是共分離的。
本發(fā)明所涉及的Southern雜交分析，是指以插入質(zhì)粒中的選擇標記(在本發(fā)明中為潮霉素抗性基因)為探針對所獲插入突變體進行基因組Southern雜交，以分析插入質(zhì)粒在梨孢菌基因組中的插入位點數(shù)和拷貝數(shù)等整合情況。經(jīng)分析，本發(fā)明所獲得的突變體X3073在MgPTH12上具有多拷貝的選擇標記的串聯(lián)插入。
本發(fā)明所涉及的目的基因克隆，首先是根據(jù)遺傳共分離分析和Southern雜交分析結(jié)果對目標插入位點進行質(zhì)粒拯救。首先，選取適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化突變體基因組DNA，對含有插入質(zhì)粒和部分側(cè)翼序列的DNA片段進行自身環(huán)化、連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以獲得并測定在插入位點側(cè)端的基因組序列。進一步，用所獲側(cè)翼序列為探針篩選梨孢菌的基因組文庫。本發(fā)明中所用的基因組文庫為梨孢菌野生型菌株Y34的TAC文庫，其平均克隆片段大小為50kb，共覆蓋全基因組的16-18倍。本發(fā)明中，以側(cè)端序列進行篩庫，得到6個陽性克隆，它們都含有如SEQ ID NO1所示的第1位到第5526位的核苷酸序列。
本發(fā)明所涉及的基因功能確認通過互補實驗和敲除實驗進行，具體包括互補載體、敲除載體的構(gòu)建以及將載體導(dǎo)入梨孢菌中，得到梨孢菌的重組轉(zhuǎn)化體?；パa載體的構(gòu)建是指將所克隆的含有功能性目標基因全長序列的DNA片斷與一個帶有新的選擇標記(在本發(fā)明中為新霉素抗性基因)的載體相連。在本發(fā)明中，將外源載體導(dǎo)入梨孢菌優(yōu)選方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中，互補載體所導(dǎo)入的梨孢菌菌株是本發(fā)明所得到的插入突變體X3073?；蚯贸d體的構(gòu)建是指將PCR擴增所得的預(yù)測的該基因的兩側(cè)翼序列定向連入一個載體中，該載體事先已連入一個新霉素抗性基因，在兩側(cè)翼序列之間連入潮霉素抗性基因。基因敲除載體所導(dǎo)入的梨孢菌菌株是野生型梨孢菌P131，基因敲除載體通過基因兩側(cè)的側(cè)翼序列與野生型菌株基因組的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組，從而將基因組中相應(yīng)位點MgPTH12的編碼區(qū)基因序列與潮霉素基因置換。本發(fā)明通過基因互補證明MgPTH12在突變體X3073基因組中的異位整合使該突變體的突變表型恢復(fù)正常；同時，基因敲除也證明MgPTH12的編碼區(qū)基因序列與潮霉素基因序列的置換導(dǎo)致MgPTH12敲除體所產(chǎn)生的附著胞的形態(tài)具有與上述突變體X3073一樣的表型缺陷。
本發(fā)明所提供的控制真菌附著胞成熟與致病力的基因MgPTH12，其特征為具有如SEQ ID NO1所示序列或與SEQ ID NO1具有70％以上序列一致性并具有相似功能的DNA序列，該基因可以源于梨孢菌，也可以源于其它植物病原真菌。
本發(fā)明還提供了MgPTH12基因的cDNA，其具有如SEQ ID NO2所示序列或與SEQ ID NO2具有70％以上序列一致性并具有相似功能的DNA序列，該基因可以源于梨孢菌，也可以源于其它植物病原真菌。
本發(fā)明還根據(jù)MgPTH12基因的cDNA序列，提供了控制真菌附著胞成熟與致病力基因所編碼的蛋白，其特征在于具有如SEQ ID NO3所示序列或與SEQ ID NO3在氨基酸序列上具有40％以上一致性并具有相似功能的蛋白，該蛋白可以源于梨孢菌，也可以源于其它植物病原真菌。
本發(fā)明所涉及的基因其插入突變導(dǎo)致梨孢菌不能形成正常形態(tài)且黑化的附著胞，并且在感病水稻品種上的致病力顯著減弱。因此，本發(fā)明最重要的用途是應(yīng)用上述成果，設(shè)計和篩選能夠破壞該基因表達、剪切及其編碼蛋白的表達的化合物；或設(shè)計和篩選能對該蛋白的氨基酸序列進行修飾或阻斷其進行細胞定位的化合物；從而開發(fā)新型的抗真菌的藥物?；蛘咭陨鲜鏊寺』蚣捌渚幋a蛋白的表達為報告基因或蛋白，設(shè)計、篩選相關(guān)化合物，阻斷該基因及其蛋白參與的信號途徑，從而開發(fā)新型的抗真菌的藥物；或者以具有如SEQ ID NO3所示序列或與SEQ ID NO3具有40％以上序列一致性并具有相似功能的蛋白中任一區(qū)域的氨基酸序列設(shè)計多肽，并制備抗體用于檢測在化合物處理狀況下蛋白的表達，均屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。此外，本發(fā)明的用途還包括以該基因的DNA或cDNA的某一區(qū)段作為探針、或根據(jù)該基因的DNA或cDNA的序列設(shè)計引物通過PCR在梨孢菌中再分離該基因，或者在其它真菌中分離的、與該基因具有一定序列同源性的序列。
本發(fā)明還涉及源于小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等植物病原真菌的、與梨孢菌MgPth12在氨基酸序列上具有高于40％一致性的同源蛋白，它們可能與梨孢菌MgPTH12具有相同的生物學(xué)功能。因此，這些同源蛋白及其編碼基因的啟動子也可作為靶位點，用于設(shè)計和篩選抗這些真菌的藥物。
以下通過


以更進一步理解本發(fā)明。

附圖1。野生型菌株P(guān)131與突變體X3073、互補轉(zhuǎn)化體CX8、敲除轉(zhuǎn)化體K75附著胞形態(tài)比較。圖示說明A為P131，B為X3073，C為CX8，D為K75。接種孢子濃度為5×105個/毫升，接種后12小時顯微拍照，放大400倍。圖示中標尺長度為20微米。
附圖2.梨孢菌野生型菌株P(guān)131與其突變體X3073在洋蔥表皮上不同時間段的附著胞形成率比較。圖示說明接種孢子濃度為5×105個/毫升。
附圖3.梨孢菌野生型菌株P(guān)131與其突變體X3073對水稻的致病力比較。圖示說明左為野生型P131，右為突變體X3073。接種孢子濃度為5×105個/毫升，接種后72小時拍照。
附圖4.互補載體構(gòu)建示意圖。在PCR正向引物設(shè)計酶切SmaI酶切位點5′-GAGCCCGGGATCCATTACAAAA-3′，反向引物設(shè)計酶切EcoRI酶切位點為5′-GCAGAATTCAATCGTCAGCAGTAT-3′，從野生菌P131中擴增出5.5kb包含MgPTH12編碼區(qū)核苷酸序列，連接KN載體，構(gòu)成互補載體。
附圖5.梨孢菌野生型菌株P(guān)131與其突變體X3073的互補轉(zhuǎn)化體CX8在洋蔥表皮上不同時間段的附著胞形成率比較。圖示說明接種孢子濃度為5×105個/毫升。
附圖6.梨孢菌野生型菌株P(guān)131與其突變體X3073的互補轉(zhuǎn)化體CX8對水稻的致病力比較。圖示說明左為野生型P131，右為互補轉(zhuǎn)化體CX8。接種孢子濃度為5×105個/毫升，接種后72小時拍照。
附圖7梨孢菌水稻野生型菌株P(guān)131 MgPth12基因敲除體的載體構(gòu)建與證明。左臂正向引物5′-GCGGAATTCTTTGGTATGTG-3′，其5’帶有EcoRI酶切位點，反向引物為5′-GTCAAGCTTATCGGAACAGG-3′，其5’端帶有HindIII酶切位點；右臂正向引物5′-TAAGTCGACCGATGTTGCTG-3’其5’帶有XhoI酶切位點，反向引物為5′-TAGACCGTGCTGCAGATTG-3′，分別連接KN載體，最后在SalI位點連接潮霉素基因，構(gòu)成敲除載體。下圖為敲除體的Southern雜交確認圖，左下圖為以MgPth12為探針的Southern雜交圖，右下圖為以置換的潮霉素抗性基因為探針的Southern雜交圖。
附圖8.梨孢菌野生型菌株P(guān)131與其MgPTH12敲除體K75在洋蔥表皮上不同時間段的附著胞形成率比較。圖示說明接種孢子濃度為5×105個/毫升。
附圖9.梨孢菌野生型菌株P(guān)131與其MgPTH12敲除體K75對水稻的致病力比較。圖示說明左為野生型P131，右為敲除體K75。接種孢子濃度為5×105個/毫升，接種后72小時拍照。
附圖10.源于梨孢菌(Magnaporthe grisea，Mg)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae，Gz)、玉米莖腐病菌(Gibberella moniliformis，Gm)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum，Ss)的PTH12類蛋白的親緣關(guān)系。
具體實施例方式
為了更好的理解本發(fā)明，以下通過實施例予以進一步地說明，但并非對本發(fā)明的限制。
實施例1突變體的篩選與鑒定。
1、分生孢子的制備將梨孢菌菌株P(guān)131的各REMI轉(zhuǎn)化體的菌絲充分打斷，均勻地涂布到西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基(每升含150ml西紅柿汁、30-50克燕麥片煮沸30分鐘過濾取濾液、20克瓊脂)平板上，26℃-28℃培養(yǎng)，當肉眼可見新生菌絲長出培養(yǎng)基表面時，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈，蓋上單層紗布，于26℃-28℃光照培養(yǎng)48小時，在培養(yǎng)基表面即可見大量的梨孢菌孢子。
2.孢子懸浮液制備將1所述的孢子洗下后用雙層擦鏡紙過濾于50ml的離心管中，4000rpm室溫離心5分鐘收集孢子，然后懸浮于0.25％的吐溫20中。
3.附著胞形態(tài)變異突變體的篩選及致病性的測定分別將野生型菌株和突變體的孢子懸浮液均勻地噴霧接種于五葉一心期水稻幼苗的葉片正面，黑暗、保濕培養(yǎng)36小時后連續(xù)光照，于接種后72小時統(tǒng)計單位長度葉片的感病病斑數(shù)。用同樣的方法制備分生孢子的懸浮液，調(diào)整分生孢子濃度到每毫升5×105孢子，均勻地噴霧接種于新鮮的洋蔥內(nèi)表皮的正面，共約噴霧5-10ml孢子懸浮液，于顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)，附著胞、侵染釘及侵染性菌絲的形成等過程，并計算分生孢子的萌發(fā)率，附著胞、侵染釘及侵染性菌絲的形成率。
在放大倍數(shù)為10×20的顯微鏡下觀察、比較梨孢菌野生型菌株與REMI轉(zhuǎn)化體的附著胞的形態(tài)差異，獲得了一個在洋蔥表皮上附著胞、侵染釘和侵染性菌絲的比率比野生型的明顯降低的突變體X3073。見附圖1，其中野生型P131和突變體X3073在洋蔥表皮上形成侵染釘和侵染性菌絲的比率表1所示。
表1.P131和X3073在接種洋蔥表皮后24、36和48小時形成侵染釘和擴展性侵染菌絲的比率

同時，在水稻親和品種麗江新團黑谷上，突變體的致病力也比野生型的低，野生菌株P(guān)131與突變體3073在親和性水稻麗江新團黑谷葉片上形成病斑情況如圖3所示。
實施例2 突變體表型變化與插入標記共分離分析用遺傳雜交的方法對突變體中插入標記潮霉素抗性基因與突變表型的共分離進行分析，將突變體與一個不具有突變表型和潮霉素抗性，并且交配型相反的梨孢菌菌株S1528進行雜交，分析其子囊孢子后代的附著胞形態(tài)及潮霉素抗性情況，具體方法如下將上述突變體X3073與不具有潮霉素抗性、附著胞形態(tài)正常的梨孢菌菌株S1528在西紅柿燕麥片培養(yǎng)基上進行對峙培養(yǎng)。首先于25℃培養(yǎng)至菌落邊緣即將接到一起，然后將其移至20℃光照培養(yǎng)，約20天左右在菌落的交界處形成黑色突起的子囊殼。挑取成熟的子囊殼，于無菌水中輕輕擠破，釋放殼內(nèi)的子囊，將子囊懸浮液涂在水瓊脂平板上，24小時后挑取子囊內(nèi)子囊孢子萌發(fā)的單根菌絲于西紅柿燕麥片培養(yǎng)基上培養(yǎng)。統(tǒng)計這些子囊孢子后代的潮霉素抗性和附著胞形態(tài)。結(jié)果如表2所示，表明在測定的子囊孢子后代中，附著胞形態(tài)正常的后代都不具有潮霉素抗性，說明這個突變體的附著胞形狀突變的表型與插入標記潮霉素抗性基因是共分離的。雜交后代中，抗潮霉素的后代全是突變表型，說明突變體X3073中插入標記潮霉素抗性基因只插入在基因組的一個位點。
表2突變體與S1528的雜交后代的表形及潮霉素抗性

實施例3控制梨孢菌附著胞成熟及形態(tài)變異的基因MgPTH12的克隆。
1.質(zhì)粒拯救通過對突變體中插入質(zhì)粒的拯救，獲得了相應(yīng)的插入位點側(cè)端的基因組序列，并確定了突變體中質(zhì)粒的插入位置。具體方法如下選取插入質(zhì)粒pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Taggedmutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophus by restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA911264-12653)中pUC18部分沒有酶切位點的限制性內(nèi)切酶XhoI完全消解突變體X3073的基因組。乙醇沉淀精制后用T4DNA連接酶進行自連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細胞JM109。提取轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，并進行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒中除含有pUCATPH中pUC18部分的序列外，還含有部分插入位點側(cè)端的基因組的序列。對鑒定正確的質(zhì)粒進行測序然后到數(shù)據(jù)庫中檢索，分析插入位點附近的基因的范圍和可能的外顯子。結(jié)果表明，在突變體X3073中，質(zhì)粒插入在對應(yīng)于SEQ ID NO.1中的第174和1678位，中間部分可能缺失。將獲得的側(cè)端序列與國際稻瘟菌基因組協(xié)會的官方網(wǎng)站(http://www.riceblast.org/)已公布的梨孢菌的基因組數(shù)據(jù)庫比較，這兩個插入位點分別位于第I號染色體的contig2.1168，2.1169上。
2、基因組TAC文庫的篩選以這兩個位點之間的一段621bp的DNA片斷(SEQ ID NO.4)為探針，篩選梨孢菌P131的基因組TAC文庫，獲得6個陽性克隆，它們都包括MgPTH12的基因組基因(SEQ ID NO.1所示的第1位到第5526位的核苷酸序列)。
質(zhì)粒拯救過程中涉及到的限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說明書使用。
實施例4MgPTH12生物功能確認包括互補實驗和基因敲除實驗。
1、互補載體和敲除載體的構(gòu)建a.互補載體的構(gòu)建首先合成帶有限制性內(nèi)切酶XbaI識別序列的引物從克隆質(zhì)粒載體pS65T-C1(gi1019893)中擴增出新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因連入pBlueScriptKS(+)的限制性內(nèi)切酶切位點XbaI間，得到的質(zhì)粒載體命名為KN。然后將PCR擴增所得的預(yù)測的該基因的全長序列連入KN中。構(gòu)建過程中涉及到的限制性內(nèi)切酶和連接酶，末端補平酶由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說明書使用。
b.敲除載體(基因置換載體)的構(gòu)建。
參照FGENESH中預(yù)測的基因組基因的外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)，將PCR擴增所得的預(yù)測的該基因的兩側(cè)翼序列定向連入一個載體中，該載體事先已連入一個新霉素抗性基因，在兩側(cè)翼序列之間連入潮霉素抗性基因。
2、梨孢菌的轉(zhuǎn)化。
梨孢菌的轉(zhuǎn)化采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。采用不破壞載體內(nèi)基因的限制性內(nèi)切酶將互補載體線性化，轉(zhuǎn)化梨孢菌的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法如下a.原生質(zhì)體的制備500毫升三角瓶裝入150毫升液體CM培養(yǎng)基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸鈣0.1％，磷酸二氫鉀0.02％，硫酸鎂0.025％，氯化鈉0.015％)，分別接入梨孢菌P131、X3073的1×106個分生孢子，在26-28℃、100轉(zhuǎn)/分條件下?lián)u培30-32小時，三層滅菌擦鏡紙過濾收集菌絲體，菌絲體用0.7M氯化鈉溶液洗滌后轉(zhuǎn)移至滅菌的50毫升離心管中，每1克菌絲加入1毫升的酶滲透液(含20毫克/毫升崩潰酶，用0.7M氯化鈉配制)，26-28℃、100轉(zhuǎn)/分條件下酶解3-4小時后，用0.7M氯化鈉洗滌菌絲體，經(jīng)三層滅菌擦鏡紙過濾，收集原生質(zhì)體，4,000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-Cl，pH7.5，50mM氯化鈣)洗滌原生質(zhì)體一次，然后分別用10毫升STC洗2次，離心沉淀后用STC將原生質(zhì)體濃度調(diào)至0.5-1×108個/毫升。
b.梨孢菌轉(zhuǎn)化分別將梨孢菌P131、X3073原生質(zhì)體分裝于滅菌的50毫升離心管中，每管150微升，分別加入等體積的線性化的載體(約2微克，梨孢菌P131的離心管中加入用限制性內(nèi)切酶KpnI線性化的基因置換載體pKO8，梨孢菌X3073的離心管中分別加用限制性內(nèi)切酶EcoRI線性化的互補載體pXC5.5)和STC混合液，冰上放置20分鐘，然后逐滴緩慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mM Tris-pH7.5，50mM氯化鈣)，冰上靜止20分鐘，加入25毫升/管冰冷的STC，緩慢混勻，4,000轉(zhuǎn)/分、4℃離心15分鐘，去上清，然后每管加入3毫升的LR培養(yǎng)基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室溫靜置培養(yǎng)12-13小時后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，加入12毫升冷卻至50℃的SR(LR+1.6％瓊脂)，混勻，待其凝固吹干后，上面鋪一層12毫升的0.7％上層瓊脂(冷卻至50℃，含400微克/毫升的G418(互補實驗)或300微克/毫升的潮霉素(美國Roche公司生產(chǎn)，基因置換試驗)。28℃培養(yǎng)4-6天，將出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化體(梨孢菌突變體X3073的互補轉(zhuǎn)化體分別為CX8；梨孢菌P131的基因置換轉(zhuǎn)化體K75)轉(zhuǎn)至固體CM培養(yǎng)基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％瓊脂)(含400微克/毫升的G418(互補實驗)或250微克/毫升的潮霉素(基因置換試驗)上，二次篩選后將單個菌落轉(zhuǎn)入燕麥片番茄培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并進行單孢分離。
互補實驗的結(jié)果表明互補載體在梨孢菌突變體X3073基因組中的異位整合使突變體的附著胞恢復(fù)野生形態(tài)。突變體的互補轉(zhuǎn)化體CX8的附著胞與野生型菌P131在洋蔥表皮上的侵染釘和侵染性菌絲的形成率比較如表3所示表3.P131，CX8在洋蔥表皮上形成侵染釘和侵染性菌絲的比率

在親和性水稻品種麗江新團黑谷葉片上形成病斑情況如附圖7所示。
基因敲除試驗的結(jié)果表明，MgPTH12基因的部分基因組序列與潮霉素基因序列的置換導(dǎo)致轉(zhuǎn)化體K75所產(chǎn)生的附著胞的形狀具有與本發(fā)明中的突變體X3073一樣的變異。MgPTH12的編碼區(qū)基因序列與潮霉素基因序列的置換也導(dǎo)致轉(zhuǎn)化體的致病力減弱，包括在洋蔥表皮上的侵染釘和侵染性菌絲的形成率(見表4)，以及在親和性水稻品種麗江新團黑谷葉片上形成病斑的數(shù)量(如附圖11所示)。
表4.基因敲除轉(zhuǎn)化體K75與野生型菌P131在接種后24小時、36小時和48小時形成侵染釘和侵染性菌絲的比率

實施例5MgPTH12的cDNA克隆1、MgPTH12 cDNA的預(yù)測用互補實驗基因核苷酸序列到Softberry(http://www.softberry.com/)進行預(yù)測，結(jié)果預(yù)測為一個cDNA長度為1344核苷酸，編碼447個蛋白質(zhì)的ORF。
2、預(yù)測MgPTH12 cDNA的RT-PCR。通過異硫氰酸胍(GT)法抽取總RNA，首先根據(jù)預(yù)測的全長ORF設(shè)計兩端引物進行RT-PCR。然后，用3’-Full RACE Core Set和5’-Full RACE Core Set進行兩端RACE，并分別進行序列測定。最后，再根據(jù)兩端RACE結(jié)果，設(shè)計引物全長cDNA，并進行測序，所獲的全長序列見SEQ ID NO2。通過軟件分析，可能的ORF長度為1410個核苷酸，編碼470個氨基酸的蛋白質(zhì)。
RT-PCR試劑、RACE試劑盒等由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說明書使用。
實施例6植物病原真菌基因組中控制附著胞成熟與致病力蛋白PTH12的生物信息學(xué)分析。
首先，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行檢索、分析，在小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等重要的病原真菌已有的基因組數(shù)據(jù)中可能存在的蛋白進行分析、預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)梨孢菌中MGPTH12蛋白在這幾種病原菌中均具有一個對應(yīng)的、氨基酸序列一致性高于40％的同源蛋白。梨孢菌中該基因編碼的蛋白由470個氨基酸組成，其它真菌病原中的同源蛋白則分別命名為GzPTH12、GmPTH12、SsPTH12。幾種植物病原真菌中PTH12蛋白的親緣關(guān)系如附圖12所示。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>源于梨孢菌的控制真菌附著胞成熟與致病力的基因MgPTH12及其用途<160>7<210>1<211>5526<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>1TATTATACTG TATACCTTTA CCGCATTTTG CAGATCAGTG TCTGCCTCTG GCCCTTGTCC60ATTTTCGTCT TCCGAACTCC TTTACCAGGA AGCACGCTGT TCGGCACCAA GGAGTGAGTT120CCTGCTGTAC AGTACCGTAG GTAGAGTGGT AAGGTAGTTG ATCAGATCCT GGAGCTCCAG180GTCCCGAATG AATTGGATCT CTTGGGGAAA GCTTTCGTAC GGTTTGGTTG AGAAGGGGGG240GGGGCAGCTC TAGAGCAAGC AATTAGCAGT CATTCAGAGA CAAGCAAGCC ACACACGCCA300CAGCCCGGCT AGCAGTAGCG TATTTGCTTT GTCCCTTTTT TTCTTGGGCT TTTTTTTTTT360TTTTTTTTTT TTTTTTTTTG ACGGCCGTTG TCAACGGCTG CATTTCCAGC GTGGTTGAGT420TGGCAGGATA CTGTACTCAT GTCCAACAAC CTTAGAGCTT CCACGGACTC GTAGCACGCA480CGCACTCACA CCTGCACGCA CACTCCTCTT TCGTCTCGCT CTCTTACTAG CAAACCAGAC540TGTCCCACTG GCCCCCTACC GATACCAACC ATTCAATCGA CAAGTACGGT ACGATGTACT600GCGTACAATG TGCAACCAAC CTTGTTGATT CTCATATATC CCTGCATGCT TGTGGGTCTC660GAGTCGACGG GGACTTGCCC ACATCCATAA CCAACTGCAT CCCTGACCGA TGCAGGAATC720GACACAGTAC CAGATTGCAT CTGCTATGTA TGTCATCCTT ACCAAACCCT CGACCCATGT780TCATATTTCC TGTCCCCTAC CCTTGAATTT TGAATAATAA TAATAATGAT AATATTAAAT840AAATTCTCAT TTATTATTTC GTGCTCGCGT CCTCAGGCTA CTTTCGGATT AGTTTCTAGC900TTTACCCCCG GTAGACCGTG CTGCAGATTG TATAAACTGC TTTTTTACCT ACCTGCTCCT960TCCGCAATTC TCCCGCGCCT GGGGTACCTG GACTTGTGTT TTTCTTTGGT CAGTCATTCC1020GCAACGGCCT CTCCAAGAAA AAAACGAAGA AGAAAAAAGC AAACCAAGTC CTTCCGCTAG1080AGCTACGGCG GTAGCAGTTT CACCTAGCAC ATCGTCGTGC TGAAGAACTG TCCTAATTCT1140TTTTGACTCG GGCCTGTTTA CACATGCTCC CCCAAGTCTA CTAGAACTTC CCTTTTTGGC1200CACAACATCT GTGCACCTTG CCCGTTGGAT TCCCACACCA CGAACTAGGT CATCCATCCT1260ACCCCATCCG CATACAGAGA GGGTCCCGGC ACTTGCGTTT CTACAAAAGA ACACCATCAC1320CCTCACCCCA TTCGACGTTG CAGCACTCGT CTTATTCCTA ACCCATCTCT TGATCAACAC1380CAAAGTGCCA GGTTGCTGTC AACTTTTGGT CCTCCCTTTC ACTTCTTGTT TTTCTTTTAT1440
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<221>CDS<222>(333)..(1745)<400>2CGTCCTCGAC AAACTGCAGG AAGACATTCG CTTCTTGCTA TAACGCAACA CCAGCAGTGG60TCAGGAGGTA CTCAGCATCG ACTCGACCGC CATTACGCAT TCCCGCCGCC TCGGTTCATT120GACCGACACT AGGGCTGAAC CATTCGACGC TGTTCATAAT CCTGTCAGCT GGAGGCCAAC180GCCAGCTACA TTTTGCCATT CGCCGCCGGA CGCGTTACTA GTTGGGACAC AAACCCCCAC240ACAACCTTTC GTTAACAACA AGCTGCCTTC TTTTTAAACT ATTTGTAACT GAGCTGGCGC300TGCTACTCCG TCAACTTCCA CTCGAATAGG GCATGGAATA TACCTTGCCA AACCACCGTT360ACTCTCACAG CAACATCGGT CAACGAAGCA ATTCACCCAC AATGTCCACA CTCGCGATGG420CTGCACCATC CCCGCATGCT CCTTTCAAGA AGGAGTACTT CTCCAACTGG GACGACCGCC480GGCAAGCGGA TTATGCTCCT TCCAGGCCAA GGAGTGATCC CGAGAGGATA GCGCTACCCT540CGATTCGCCA GGCTTTCCCC GATCTCCTTC GCCTCCGTGT TATCCCCCAA GATGGCCAAA600CCAGCACACC ATCCTCCACC ACATCACCGA TATCAGGACC ACCTGGCACC CTGACACCAC660CCGAATATGT TCACTCCCCG ACCAGCCAGA ACAAGCGCAG GAGGTTATCG TTCGGTGACG720ACCAGGAGGA AAGGGTCAGC CAGGTTCCAA GGCTCTACAC CAGCCAGTCC CAGGCATACC780AACGACGTGA CAACCGTCCT CTTTCTCCAG TCACCCTAAG TGGCGGGCCC CGTTCTAGCA840CCTCCGATAG CTGGGCTGGA TCCTCCCGAA CGAGCCCGTT CCTTCCTGGT ACCAGCACTT900CGACCTTGAG ATCACCGGCT GCTATTGAGC AAAACGACCC AATGGACAGG CAGCGCCCGA960CGCTACCAAG CCTTCCTCAT CTGAACTTCG ACAGGTCACC AATGGAATCC CAGTCTCACA1020TGCACCACCA CCATCAACAG CACCCTCACC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAC AGCCACCACG1080TGAGGGCAAT GTCTGGGGAC GAGTACATGA TGGAGCAGCA CCGCGGAATG GTCCAGCAGC1140
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65 70 75 80Leu Arg Val Ile Pro Gln Asp Gly Gln Thr Ser Thr Pro Ser Ser Thr85 90 95Thr Ser pro Ile Ser Gly Pro pro Gly Thr Leu Thr Pro pro Glu Tyr100 105 110Val His Ser Pro Thr Ser Gln Asn Lys Arg Arg Arg Leu Ser phe Gly115 120 125Asp Asp Gln Glu Glu Arg Val Ser Gln Val Pro Arg Leu Tyr Thr Ser130 135 140Gln Ser Gln Ala Tyr Gln Arg Arg Asp Asn Arg Pro Leu Ser Pro Val145 150155 160Thr Leu Ser Gly Gly Pro Arg Ser Ser Thr Ser Asp Ser Trp Ala Gly165170175Ser Ser Arg Thr Ser Pro Phe Leu Pro Gly Thr Ser Thr Ser Thr Leu180 185 190Arg Ser Pro Ala Ala Ile Glu Gln Asn Asp Pro Met Asp Arg Gln Arg195200 205Pro Thr Leu Pro Ser Leu Pro His Leu Asn Phe Asp Arg Ser Pro Met210215 220Glu Ser Gln Ser His Met His His His His Gln Gln His Pro His Gln225 230 235240Gln Gln Gln Gln Gln His Ser His His Val Arg Ala Met Ser Gly Asp245 250 255Glu Tyr Met Met Glu Gln His Arg Gly Met Val Gln Gln His Pro His260265270Ser Ala Val Glu Pro Gly Tyr Arg Gln Pro Ala Pro Ser Gly Tyr Pro275280285Tyr Pro Tyr His His Pro Leu Arg Ser Gln Ser Leu Ser Ile Gly Ala290 295 300Met Pro Pro Met Asp Arg Met Pro Phe Ser pro Ser Gly Tyr Ser Ala305 310 315320Tyr His Gly Asp Tyr Met Arg Met Gly Asp Met Gly Gly Met Gly Phe325 330 335
Asn Gly Asp Asn Lys Gln Arg Lys Arg Arg Gly Asn Leu Pro Lys Glu340 345 350Thr Thr Asp Lys Leu Arg Ala Trp Phe Leu Ala His Leu Ser His Pro355360 365Tyr Pro Thr Glu Asp Glu Lys Gln Glu Leu Met Arg Gln Thr Gly Leu370 375 380Gln Met Asn Gln Ile Ser Asn Trp Phe Ile Asn Ala Arg Arg Arg Gln385 390 395 400Leu Pro Ala Met Ile Asn Asn Ala Arg Ala Glu Ser Asp Ala Leu Ala405 410415Gln Gly Arg Gly Leu Ser Asp Gly Ser Lys Ile Leu Leu Ser Thr Glu420 425 430Arg Ser Asp Tyr Asp Ser Asp Lys Arg Gly Ser Pro Ile Ser Asp Asp435 440 445Gly Ala Ser His Leu Tyr His Asp Asp Met His Arg Arg Ala Val Gly450455 460Met Lys Arg Gly Ser Val<210>4<211>621<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)CTGCAGATTG TATAAACTGC TTTTTTACCT ACCTGCTCCT TCCGCAATTC TCCCGCGCCT60GGGGTACCTG GACTTGTGTT TTTCTTTGGT CAGTCATTCC GCAACGGCCT CTCCAAGAAA120AAAACGAAGA AGAAAAAAGC AAACCAAGTC CTTCCGCTAG AGCTACGGCG GTAGCAGTTT180CACCTAGCAC ATCGTCGTGC TGAAGAACTG TCCTAATTCT TTTTGACTCG GGCCTGTTTA240CACATGCTCC CCCAAGTCTA CTAGAACTTC CCTTTTTGGC CACAACATCT GTGCACCTTG300CCCGTTGGAT TCCCACACCA CGAACTAGGT CATCCATCCT ACCCCATCCG CATACAGAGA360GGGTCCCGGC ACTTGCGTTT CTACAAAAGA ACACCATCAC CCTCACCCCA TTCGACGTTG420
CAGCACTCGT CTTATTCCTA ACCCATCTCT TGATCAACAC CAAAGTGCCA GGTTGCTGTC480AACTTTTGGT CCTCCCTTTC ACTTCTTGTT TTTCTTTTAT TTGCGTGAAA TACGGATAGA540CTTCACTCTC TCGTGACCGA CCTCGTCCAC CATTTGGCAC TCGCAACATC TTAAATCTTT600AGCGTCCTCG ACAAACTGCA G 621<210>5<211>453<212>PRT<213>玉米莖腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)<400>5Met Ser Met Leu Ala Thr Ala Ser Pro Ser Pro His Pro Ser Ser Phe1 5 10 15Gly Met Pro Arg Pro Trp Glu Thr Asn Arg Cys Pro Asp Tyr Ser Leu20 25 30Arg Pro Arg Thr Glu Asn Asp Lys Val Ala Leu Pro Ser Ile Arg Gln35 40 45Val His Asn Ile Asp Ser Thr Ser Lys Pro Leu Cys Leu Ala Asn Ile50 55 60Thr Gln Ala Phe Pro Glu Leu Gln Leu Gln Thr Gln Pro Pro His Asp65 70 75 80Leu Asn Thr Lys pro Pro Ser Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ala Pro Pro85 90 95Leu Pro Ala Ala Ser Pro Gln Tyr Ile His Ser Pro Asn Ser Asn Lys100 105 110Arg Arg Arg Leu Ser Ile Glu Arg Glu Val Glu Met Glu Arg Val Arg115 120 125Gln Val Pro Arg Arg Tyr Ser pro Asp Arg Ala Ser Pro Arg Gln Ile130 135 140Ser Pro His Leu Pro Ile Gln Gly Gly Ser Gln Glu Asn Trp Ala Ala145 150 155 160Pro Thr Arg Thr Ser Pro phe Leu Thr Asn Gly Ser Asn Ser His Ser165 170 175Val Ser Ile Glu Val Ser Glu Arg Ala Glu Ser Arg Ser Thr Leu Pro180 185 190Ser Leu Pro pro Pro Arg Ser Leu Glu Arg Glu Leu Pro Val Gly Arg195 200 205Gly Thr Ala Pro Ala Asp Gly Tyr Arg Pro Pro Gln Gln Ser Met Pro210 215 220His Ser Arg Thr Pro Ile Ser Glu Pro Gly Val Ser Pro Tyr Arg Glu225 230 235 240Asn Gly Tyr Gly Tyr Pro Tyr His His Pro Thr Arg Tyr Gln Ser Leu
245 250 255Ser Thr Gly Ser Ala His Ser Tyr Asp Arg Thr Pro Phe Thr Pro Gly260 265 270Thr Tyr Asn Thr Pro Tyr Gln Asp Phe Val Arg Phe Gly Asp Met Ser275 280 285Ser Ala Ser Leu Ser Gly Asp Asn Lys Gln Arg Lys Arg Arg Gly Asn290 295 300Leu Pro Lys Glu Thr Thr Asp Lys Leu Arg Ala Trp Phe Val Ala His305 310 315 320Leu Gln His Pro Tyr Pro Thr Glu Asp Glu Lys Gln Asp Leu Met Arg325 330 335Gln Thr Gly Leu Gln Met Ser Lys Phe Gly Arg Thr Lys Pro Arg Thr340 345 350Glu Lys Pro Ser Gln Asn Trp Lys Leu Thr Cys Pro Pro Thr Asp Gln355 360 365Ile Ser Asn Trp Phe Ile Asn Ala Arg Arg Arg Gln Leu Pro Ala Met370 375 380Ile Asn Asn Ala Arg Ala Glu Thr Asp Ala Met Thr Gly Ala Arg Gly385 390 395 400Gly Asp Leu Lys Val Leu Ala Thr Thr Glu Arg Gly Asp Phe Asp His405 410 415Ser Lys Arg Glu Pro Ala Gly Pro Leu Ser Asp Gly Glu Gly Ala Thr420 425 430Tyr Asp Glu Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Arg Arg Pro Gly Thr Ile435 440 445Gly Arg Gly Ser Val450<210>6<211>463<212>PRT<213>小麥赤霉菌(Gibberella zeae)<400>6Met Glu Asp Ser Arg Ser Leu Ser Lys Gln Ser Asp Thr Lys Leu Gln1 5 10 15Gln Pro Ala Ser Gln Leu Pro Asn Met Ser Met Ile Ala Thr Ala Ser20 25 30Pro Ser Pro His Pro Ser Ser Phe Gly Met Pro Arg Pro Trp Glu Thr35 40 45Asn Arg Cys Pro Asp Tyr Ser Leu Arg Pro Arg Thr Glu Asn Asp Lys50 55 60Val Ala Leu Pro Ser Ile Arg Gln Ala Phe Pro Glu Leu Gln Leu Gln65 70 75 80Thr Gln Pro Pro His Asp Leu Asn Thr Lys Pro Leu Val Thr Gly Pro
85 90 95Pro Leu Gly Thr Ala Pro Leu Ala Ala Ala Ser Pro Gln Tyr Val His100 105 110Ser Pro Asn Ser Ser Lys Arg Arg Arg Leu Ser Met Glu Arg Glu Met115 120 125Glu Ser Glu Arg Val Arg Gln Val Pro Arg Leu Cys Tyr Ser Pro Asp130 135 140Arg Glu Ser Pro Arg Gln Ile Ser Pro Asn Leu Ala Ile Gln Ala Gly145 150 155 160Thr Arg Glu Asn Trp Thr Ala Pro Thr Arg Thr Ser Pro Tyr Leu Thr165 170 175Asn Gly Ala Thr His His Ser Val Pro Met Glu Val Gly Glu Arg Leu180 185 190Glu Ala Arg Pro Ala Leu Pro Ser Leu Pro Pro Pro Arg Ser Leu Glu195 200 205Arg Glu Ala Val Leu Val Ser Arg Gly Pro Ala Pro Ala Pro Val Pro210 215 220Thr Pro Val Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ile Pro Ala Ser225 230 235240Val Ser Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Glu Gly Tyr Arg Ser245 250 255Ser His Gln Pro Met Ser His Ser Arg Thr Pro Ile Pro Glu Ser Gly260 265 270Val Ser Pro Tyr Arg Glu Ser Ser Tyr Gly Tyr Pro Tyr His His Pro275 280 285Thr Arg Tyr Gln Ser Leu Ser Ala Gly Ser Ala His Ser Phe Asp Arg290 295 300Thr Pro Phe Thr Pro Gly Ala Tyr Asn Ala Pro Tyr Gln Asp Phe Val305 310 315 320Arg Phe Gly Glu Met Gly Pro Ala Ser Leu Ser Gly Asp Asn Lys Gln325 330 335Arg Lys Arg Arg Gly Asn Leu Pro Lys Glu Thr Thr Asp Lys Leu Arg340 345 350Ala Trp Phe Val Ala His Leu Gln His Pro Tyr Pro Thr Glu Asp Glu355 360 365Lys Gln Asp Leu Met Arg Gln Thr Gly Leu Gln Met Asn Gln Ile Ser370 375 380Asr Trp Phe Ile Asn Ala Arg Arg Arg Gln Leu Pro Thr Met Ile Asn385 390 395 400Asn Ala Arg Ala Glu Thr Asp Ala Met Ser Ser Ala Arg Gly Gly Asp405 410 415Met Lys Val Leu Ala Thr Thr Glu Arg Gly Asp Phe Asp His Gly Lys420 425 430Arg Glu Pro Val Gly Pro Leu Ser Asp Gly Glu Gly Ala Thr Tyr Glu435 440 445Glu Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Arg Arg Pro Gly Thr Met Gly Arg
450 455 460Gly Ser Val<210>7<211>329<212>PRT<213>油菜菌核病菌(sclerotinia sclerotiorum)<400>7Met Thr Glu Arg Thr Tyr Asn Thr Ser Pro Glu Ser Asn Lys Arg Arg1 5 10 15Ile Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Asp Asp Glu Ile Gln Gln Gln Arg Gly20 25 30Arg Tyr Gln Ser Val Ser Ser Ser Arg Ser Pro Met Thr Tyr His His35 40 45Asp Ser Gly Ala Ala Ser Pro Val Gly Pro Ile Ala Arg Arg Glu Ser50 55 60Leu Arg Ser Ile Pro Glu Arg Arg Ala Pro Phe Ser Asp His Thr Ser65 70 75 80Arg Pro Pro Phe His Ser Pro Ile Ser Glu Pro Ser Ser Thr Ile Tyr85 90 95Arg Gln Asn Leu Pro Gly Val Ala Thr Lys Asp Arg Ser Tyr Asp Arg100 105 110Pro Tyr His Gln Ile Pro Ala Gly His Ser His Asp Tyr Pro Arg Ser115 120 125Glu Tyr Ser Leu Glu Ala Cys Arg Pro Tyr Gln Gln His Asn Tyr Ala130 135 140Pro Ala His Asp Thr Ser Tyr Ala Pro Ser Gln Ser Asp Tyr Gly Tyr145 150 155 160Gln Gln Pro Arg Asn Gln Ala Tyr Pro Gly His Pro Pro Tyr Gln Leu165 170 175Asn Gln Gly Gln Thr Pro Phe Thr Glu Gly His His Ser Gly Asn Tyr180 185 190Ser Ser Ala Ala Tyr Gln Ala Gln Asp Met Asp Ser Lys Pro Arg Lys195 200 205Arg Arg Gly Asn Leu Pro Lys Pro Thr Thr Asp Ile Leu Thr Thr Trp210 215 220Phe Ile Asn His Leu Glu His Pro Tyr Pro Asn Glu Glu Glu Lys Gln225 230 235 240Leu Leu Met Val Gln Thr Gly Leu His Leu Asn Gln Ile Ser Asn Trp245 250 255Phe Ile Asn Ala Arg Arg Arg Lys Leu Pro Ala Leu Gln Asn Asn Ala260 265 270Arg Ala Glu Asn Ala Ala Arg Ser His His Asn Arg Met His Ser Ala
275 280 285Asp Asp Glu Gln Ser Pro Met Ser Leu Cys Asn Ser Asp Ala Gly Leu290 295 300Ser Pro Arg Asp Ala Ser Thr Phe Asn Glu Gly Trp Ser Ser Arg Gln305 310 315 320Glu Glu Arg His Asn Gln His His Tyr32權(quán)利要求
1.真菌中一種控制附著胞成熟和致病力的蛋白，在梨孢菌中命名為MGPTH12，其特征是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且控制真菌附著胞形成和致病力的蛋白質(zhì)。3)與序列表中的SEQ ID №3具有氨基酸序列一致性高于40％的如玉米莖腐病菌(Gibberella moniliformis)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)等病原真菌的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID №5，6，7。
2.權(quán)利要求1所述的真菌控制附著胞成熟和致病力的蛋白的編碼基因。該基因的特征在于具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上一致性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.權(quán)利要求2所述的控制真菌控制附著胞成熟和致病力的蛋白的基因的cDNA，其特征在于可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.權(quán)利要求3所述的控制真菌控制附著胞成熟和致病力的蛋白的基因的cDNA，其特征還在于編碼區(qū)的序列為SEQ ID №2的5′端第333位至1745位堿基。
5.利用權(quán)利要求2、3、4所述的控制真菌控制附著胞成熟和致病力的蛋白的基因及其cDNA構(gòu)建的表達載體，細胞系和宿主菌。
6.權(quán)利要求2所述控制真菌附著胞成熟與致病力蛋白的編碼基因MgPTH12的啟動子，具有自序列SEQ ID №1的5′端第1位至1940位堿基的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求1所述的真菌控制附著胞成熟與致病力蛋白的MGPTH12及其一致高于40％同源蛋白的表達作為靶標在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的利用。
8.權(quán)利要求1所述的真菌控制附著胞成熟與致病力蛋白的MGPTH12及其一致高于40％同源蛋白的修飾作為靶標在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的利用。
9.權(quán)利要求2所述的真菌控制附著胞成熟與致病力蛋白的基因MgPTH12的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪切作為靶標在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的利用。
10.權(quán)利要求6所述的控制真菌附著胞成熟與致病力蛋白的編碼基因MgPTH12的啟動子及其結(jié)合蛋白作為靶標在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的利用。
11.權(quán)利要求7、8、9、10所述的抗真菌藥劑為抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotirum)等病原真菌的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了梨孢菌附著胞成熟和致病力所必需的一個新基因MgPTH12基因及其用途。該基因及其cDNA、編碼產(chǎn)物分別具有序列表中SEQ ID №1、№2和№3的序列。該基因編碼的蛋白質(zhì)具有homeo結(jié)構(gòu)域，但與已知功能蛋白沒有顯著的相似性。該基因的敲除導(dǎo)致梨孢菌不能形成正常和成熟的附著胞，侵染釘和擴展性侵染菌絲的形成頻率顯著下降，并且對水稻幾乎無致病能力。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)該基因的同源基因在植物病原真菌中廣泛存在，在致病過程可能具有相同的功能。因此，MgPTH12編碼蛋白的表達、轉(zhuǎn)錄物的剪切、修飾與定位以及該基因參與的信號途徑可作為重要候選靶標，用于設(shè)計和篩選抗真菌的新型藥劑。
文檔編號A61P31/10GK1951957SQ20051010944
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者彭友良, 張凱, 趙文生, 張裕君, 時濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)