竹黃分離真菌瓶生頂孢霉及其在生產(chǎn)麥角甾酮中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物資源利用領(lǐng)域，設(shè)及到微生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中麥角醬酬天然活性產(chǎn) 物的生產(chǎn)方法，具體就是一株真菌瓶生頂抱霉（Acremoniumcavaraeanum)及其所產(chǎn)麥角醬 酬化合物的固體發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 麥角醬酬主要分布在多種藥用真菌和藥用植物中，分離純化自真菌菌絲、子實(shí)體 及發(fā)酵液的研究較多。從真菌中獲得麥角醬酬的文獻(xiàn)如陳若蕓等（1991)從赤芝抱子脂溶 部分分離獲得麥角醬酬。項(xiàng)晨等（2011)從銀白離權(quán)傘的子實(shí)體中用氯仿/甲醇（1:1，V/ V)浸提獲得2：3g浸膏，最終分離獲得21. 5mg麥角醬酬，得率約為0. 93%。。高錦明等（2002) 從野生真菌耳狀網(wǎng)權(quán)菌子實(shí)體中分離得到麥角醬酬。Leeetal(2005)從豬等菌核中分 離出麥角醬酬，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)HT-29 (結(jié)腸癌），化La細(xì)胞229 (子宮頸癌），Hep3B細(xì)胞（肝 癌），和AGS(胃癌）具有一定的細(xì)胞毒活性。李向敏等（2009)對(duì)靈芝抱子進(jìn)行萃取所得到 的脂溶性組分應(yīng)用硅膠層析、反相硅膠層析、葡聚糖凝膠層析和高效液相半制備等色譜技 術(shù)分離純化獲得麥角醬酬。從植物中獲得麥角醬酬的文獻(xiàn)如劉紅兵等（2005)從東京楓楊 的莖皮中利用Se地adexLH-20和硅膠等柱色譜和重結(jié)晶等技術(shù)分離到麥角醬酬。崔奎等 (2007)從IOKg中華雜猴桃根中用95%乙醇浸提獲得7mg麥角醬酬。王忠昭等（2011)從 半紅樹的莖和樹皮中用石油酸和乙酸乙醋浸提獲得123g浸膏，通過一系列分離手段獲得 6. 7mg麥角醬酬。另外，還有一些通過液體發(fā)酵獲得麥角醬酬的報(bào)道，如李想等（2007)從 紅樹植物內(nèi)生真菌Penicilliumsp.的發(fā)酵菌絲中浸提得到37g浸膏，最終分離獲得23mg 麥角醬酬，得率約為0.62%。。牛蕓（2013)從1化大皮傘的發(fā)酵液中用乙酸乙醋浸提獲得 6. 6g浸膏，最終分離得到7.Smg麥角醬酬，得率約為1.18%。。鄧慧穎等（2011)從海蓮內(nèi)生 真菌化Stalotiopsisclavispora的發(fā)酵液中分離獲得麥角醬酬。李壯壯等（2014)從條 紋擬盤多毛抱化StalotopsisVirga化Ia的發(fā)酵液中分離到麥角醬酬。關(guān)于麥角醬酬的專 利有：CN103816163A:發(fā)現(xiàn)從火木層孔菌的液體發(fā)酵液和子實(shí)體中分離到的麥角醬酬具 有抗禽流感活性。CN103864874A:從桑黃子實(shí)體中分離出麥角醬酬，并研究了其在制備 抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。CN103044511A:從桑黃菌絲發(fā)酵全液中分離麥角醬酬的方法。CN 103265597A:研究了從虎杖藥材中制備麥角醬酬的方法。CN101785776A:研究了麥角醬 酬在制備治療慢性腎衰竭藥物中的應(yīng)用。CN101596201A:研究了麥角醬酬在制備利尿藥 物中的應(yīng)用。CN103265596A:研究了麥角醬酬用于制作化學(xué)傳感器材料和裝飾材料的應(yīng) 用，其制成的化學(xué)傳感器巧光性能優(yōu)異。
[0003] 目前，尚未見關(guān)于固體發(fā)酵獲得麥角醬酬的公開文件。本專利利用竹黃分離真菌 瓶生頂抱霉CAOl固體發(fā)酵生產(chǎn)麥角醬酬，極大地提高了產(chǎn)率，得率高達(dá)1. 89%。，明顯高于 已文獻(xiàn)報(bào)道中的產(chǎn)量。并且可用于擴(kuò)大生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開了一種竹黃分離真菌瓶生頂抱霉（Acremoniumcavaraeanum)CAOl，及 其通過固體發(fā)酵獲得麥角醬酬的方法，包括菌株的獲得和發(fā)酵。首先采集竹黃子實(shí)體，表面 消毒后采用組織分離法分離真菌菌株，對(duì)產(chǎn)生麥角醬酬的菌株進(jìn)行固體發(fā)酵，然后將發(fā)酵 料烘干、粉碎，用有機(jī)溶劑浸提，經(jīng)減壓柱、常壓硅膠柱等手段進(jìn)行分離純化，然后在甲醇中 重結(jié)晶獲得目標(biāo)產(chǎn)物，通過HPLC在350皿處檢測(cè)其純度。該化合物為黃綠色晶體（甲醇）， 分子量：392,分子式：〔2化。0,在365皿紫外燈下顯藍(lán)色巧光。。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案將進(jìn)一步說明。
[0006] 一株真菌瓶生頂抱霉（Acremoniumcavaraeanum)，該菌株編號(hào)為CAOl，分離自竹 黃子實(shí)體，菌株保藏號(hào)為CGMCCNo. 10816。
[0007] 本發(fā)明還公開了瓶生頂抱霉CAOl菌株在生產(chǎn)麥角醬酬中的應(yīng)用。
[0008] 一種用瓶生頂抱霉CAOl菌株生產(chǎn)麥角醬酬的方法，是瓶生頂抱霉CAOl菌株通過 固體發(fā)酵生產(chǎn)麥角醬酬。
[0009] 固體發(fā)酵的固體培養(yǎng)基配方是：大米93~98% (Wt)，黃豆粉3~5% (Wt)，魚粉 1 ~2 % (Wt)，皿2?〇40. 5 ~1 % (Wt)，CaC〇30. 5 ~1 % (Wt)，NaCl0. 5 ~1 % (Wt);培養(yǎng)基 的抑6.0~7.0。93~98%的大米在清水中浸泡2~化加3~5%的黃豆粉，1~2%的 魚粉，0. 5 ~1 % 的KHzPO" 0. 5 ~1 % 的CaC〇3,0. 5 ~1 % 的NaCl,抑調(diào)至 6. 0 ~7. 0,12TC 下滅菌2次，兩次滅菌間隔時(shí)間為4她，得固體發(fā)酵料；將瓶生頂抱霉CAOl的種子培養(yǎng)液接 種到固體發(fā)酵料中，將固體發(fā)酵料于25~28°C下培養(yǎng)10~18天，待發(fā)酵料充分變紅后收 獲，30~55°C烘箱中烘干并粉碎，獲得干燥物用于麥角醬酬的提取。
[0010] 從竹黃分離真菌CAOl的固體發(fā)酵物中分離麥角醬酬的具體步驟如下：
[0011] (I)CAOl的固體發(fā)酵：將CAOl菌株在PDA平板上培養(yǎng)6天，之后轉(zhuǎn)接到PDA液體培 養(yǎng)基中，28°C下震蕩培養(yǎng)4天。將種子培養(yǎng)液接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中。固體發(fā)酵培養(yǎng)基 的配方為大米93~98%，黃豆粉3~5%，，魚粉1~2%，皿2口〇4 0. 5~l%，CaC〇30. 5~ 1%，化Cl0.5~1%，P冊(cè).0~7.0,12TC下滅菌2次（兩次滅菌間隔時(shí)間為4她）。將固 體培養(yǎng)基于28°C下培養(yǎng)10~18天左右（每天觀察并混勻）；待培養(yǎng)基充分變紅后收獲， 30~55°C烘箱中烘干并粉碎備用。 陽〇1引 似固體發(fā)酵物的提?。簩⒎鬯榈母稍锇l(fā)酵產(chǎn)物按1:2~l:5w/v加入細(xì)2化進(jìn)行 浸提3次。在減壓條件下將有機(jī)溶劑揮干，獲得浸膏。
[001引 做減壓柱粗分劃段：將浸膏與硅膠l:lw/w混勻干法上樣，W石油酸-乙酸乙醋 為洗脫液，從石油酸：乙酸乙醋=60:1開始，依次為55:1、50:1…1:1。通過TLC點(diǎn)板，合并 紫外燈下含藍(lán)色巧光的組分，減壓濃縮獲得含麥角醬酬的粗體物。
[0014] (4)硅膠柱分離純化：將上述粗體物用少量石油酸溶解，濕法上樣，所用硅膠 200-300目，采用石油酸：乙酸乙醋梯度洗脫，依次為100:1、90:1…1:1，通過TLC點(diǎn)板，合并 紫外燈下含藍(lán)色巧光的組分，減壓濃縮獲得麥角醬酬粗品。
[0015] (5)結(jié)晶純化：將上述麥角醬酬粗品溶于甲醇中，用有機(jī)濾膜過濾后，于室溫條件 下靜置結(jié)晶。
[0016] (6)純度檢測(cè)：通過HPLC在365皿波長處檢測(cè)其純度。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一株新有菌株用于固體發(fā)酵獲得麥角醬酬；為大 量獲得麥角醬酬提供了 一條新途徑。
[0018] 本發(fā)明菌株CAOl于2015年5月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中屯、（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所），分 類命名為瓶生頂抱霉（Acremoniumcavaraeanum)，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10816。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1竹黃分離真菌瓶生頂抱霉（Acremoniumcavaraeanum)CAOl的獲得
[0020] 選用新鮮的竹黃子實(shí)體，采用組織分離法，即將新鮮的竹黃子實(shí)體用清水沖洗表 面，驚干后用75%酒精進(jìn)行表面消毒，然后用無菌刀片將子實(shí)體切成約3mmX3mmX3mm的 小塊，再在75 %的酒精中消毒30秒，然后用無菌水沖洗3~4次后，將組織塊放在已倒有 PDA培養(yǎng)基的平板上，每個(gè)平板放入3~4個(gè)組織塊，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0021] 待組織塊上有菌絲長出，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，將真菌多次純化后保存到試管 斜面中備用，分別標(biāo)號(hào)為CAO1、CA02…CA67。
[0022] 實(shí)施例2篩選產(chǎn)麥角醬酬的菌株 陽02引將獲得的67株真菌分別接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C下震蕩（130巧m/min) 培養(yǎng)4天，之后過濾掉菌絲，發(fā)酵液用二氯甲燒萃取。通過TLC點(diǎn)板，在紫外燈下觀察有無 藍(lán)色巧光物質(zhì)。根據(jù)篩選結(jié)果，將產(chǎn)生藍(lán)色巧光物質(zhì)的菌株CAOl作為實(shí)驗(yàn)菌株。
[0024] 實(shí)施例3瓶生頂抱霉（Acremoniumcavaraeanum)CAOl菌株的顯微形態(tài)特征及分 子鑒定 陽02引 CAOl菌株的顯微形態(tài)特征：PDA培養(yǎng)基上，菌絲初期呈白色，濃密，6~7天后菌落 中央的菌絲變黃，菌落出現(xiàn)中央至四周的福射狀裂痕。該菌株生長緩慢，擴(kuò)散面積較小。在 生長3~4天后菌株開始分泌紫紅色色素，且色素的擴(kuò)散速度遠(yuǎn)大于 [00%] 菌絲的擴(kuò)散速度。5~7天后也可在菌落上分泌滴狀紫紅色色素。100倍油鏡下 觀察分生抱子光滑，楠圓形，在抱子梗頂端呈鏈狀，大小為3. 2~4ymX1. 2~2ym。
[0027] 分子生物學(xué)鑒定：利用通用引物口S-4:TCCTCCGCTTATTGATATGC(沈QIDNO. 2)和 口S-5 :GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG(SEQIDNO. 3)擴(kuò)增獲得長度在 500 ~750bp間的PCR產(chǎn) 物。將PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果如下SEQIDNO. 1所示。將W下序列在NCBI核酸序列總庫中 進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果該序列與瓶生頂抱霉（Acremoniumcavaraeanum)菌株的相似性高達(dá) 99%，因此可確定該菌株為半知菌類、叢梗抱目（Moniliales)、叢梗抱科（Moniliaceae)、 葡萄抱方矣度otrytideae)、頂抱霉屬（AcremoniumLk.exFr.)的