專利名稱：圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特指一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
圈卷產(chǎn)色鏈霉菌為中國科學(xué)院微生物研究所篩選培養(yǎng)出的放線菌，可用其產(chǎn)生新多氧霉素菌，該菌在放線菌分類上屬于鏈霉菌屬，命名為圈卷產(chǎn)色鏈霉菌種(Streptomyces ansochromogenus)。其培養(yǎng)和發(fā)酵方法包括如下步驟1、斜面培養(yǎng)基用高氏一號培養(yǎng)基或葡萄糖-天門冬素做培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基于試管內(nèi)。
2、斜面培養(yǎng)用從自然界土壤中分離出的鏈霉菌接種到斜面培養(yǎng)基后，在20-30℃條件下培養(yǎng)，便獲得該菌種的斜面培養(yǎng)物；3、發(fā)酵培養(yǎng)液配制用黃豆粉1.0-5.0％、淀粉0.8％-5.5％、NaCl 0.1-0.8％、酵母浸膏0.05-0.35％、碳酸鈣0.15-0.4％，與水混勻，分裝于三角瓶，高壓滅菌，121℃，30分鐘，制成發(fā)酵培養(yǎng)液；4、培養(yǎng)圈卷產(chǎn)色鏈霉菌將3-8ml的無菌生理鹽水加入培養(yǎng)好的斜面中，用接種環(huán)刮取斜面上已長好的菌苔，制成菌懸液，取0.1-1.0ml菌懸液接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，5瓶/批，在20-32℃的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)30-75小時，搖瓶機的轉(zhuǎn)速為120-300轉(zhuǎn)/分，偏心距為15mm-30mm，培養(yǎng)出圈卷產(chǎn)色鏈霉菌。其主要缺陷在于產(chǎn)素能力較低，且產(chǎn)素的不穩(wěn)定性較高，同一批中，不同三角瓶的產(chǎn)素水平的差距在30-60％之間，不同批的平均產(chǎn)素水平偏差也在30％以上，故難以應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。
本發(fā)明的目的在于提供一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，通過物理或化學(xué)誘變處理孢子液來改變其產(chǎn)素不穩(wěn)定性，達到提高產(chǎn)素能力及培養(yǎng)高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的目的。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株，通過化學(xué)誘變劑、紫外線照射、衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理中的一種或兩種以上聯(lián)合處理孢子液，培養(yǎng)出的圈卷產(chǎn)色鏈霉素菌變株，保藏號為CGMCC NO0446，分類命名為“圈卷產(chǎn)色鏈霉菌種Streptomyces ansochromogenus”；該化學(xué)誘變劑為N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍，使用濃度為120微克-300微克，該紫外線誘變處理為在紫外燈下照射30-300秒，避光進行紫外線誘變處理；該衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理為先將孢子液置于安培管及微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)隨衛(wèi)星搭載，再置于高能等離子發(fā)生器內(nèi)進行輻射誘變處理5-90秒鐘。
一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的培養(yǎng)方法，具體步驟如下(1)孢子液的制備先將鏈霉菌的菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為14-22mm，長度為18-23mm，試管的蓋為棉塞或硅橡膠塞，培養(yǎng)溫度為20-32℃，時間5-35天，待菌苔生長出后，加入5-12ml/支的無菌生理鹽水，將菌苔輕輕刮起，使菌苔表面的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至的三角瓶中；(2)誘變處理通過化學(xué)誘變劑、紫外線照射、衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理中的一種或兩種以上聯(lián)合處理孢子液，培養(yǎng)出的、圈卷產(chǎn)色鏈霉素菌變株。
(3)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為20-35℃，時間5-40天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
該化學(xué)誘變劑處理為在制備的孢子液中，加化學(xué)誘變劑N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍，濃度為120微克-300微克，在溫度20-38℃條件下，上搖瓶機，轉(zhuǎn)速15-60轉(zhuǎn)/分，避光進行化學(xué)誘變處理，時間為20分鐘至90分鐘。
該紫外線誘變處理為，將制備好的孢子液加到內(nèi)徑為4-10mm的雙碟中，加入量為3-15ml，在距離為250mm-600mm的紫外燈下，照射時間為30-200秒，處理前、后及處理過程中，均要求避免其他光線進行紫外線誘變處理。
該衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理為先將孢子液置于安培管及微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)隨衛(wèi)星搭載10-20天，再置于高能等離子發(fā)生器內(nèi)進行輻射誘變處理5-90秒鐘。
一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的應(yīng)用，圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株應(yīng)用于工業(yè)化微生物發(fā)酶生產(chǎn)新多氧霉素及新多氧霉素衍生物的前體生產(chǎn)中。
本發(fā)明的主要優(yōu)點是通過物理或化學(xué)誘變處理孢子液來改變其產(chǎn)素不穩(wěn)定性，具有培養(yǎng)高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的功效，其產(chǎn)素能力提高12-80％，產(chǎn)素瓶差由30-60％降為30％以下，不同批的平均產(chǎn)素水平偏差由30％以上降為30％以下?？蓱?yīng)用于工業(yè)化微生物發(fā)酵生產(chǎn)新多氧霉素及與新多氧霉素有關(guān)的衍生物的前體生產(chǎn)中。
下面結(jié)合較佳實施例進一步說明。
實施例1本發(fā)明是通過化學(xué)誘變劑、紫外線照射、衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理中的一種或兩種以上聯(lián)合處理孢子液，培養(yǎng)出的圈卷產(chǎn)色鏈霉素菌變株，保藏號為CGMCC NO0446，分類命名為“圈卷產(chǎn)色鏈霉菌種(Streptomycesansochromogenus)”。
該化學(xué)誘變劑為N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍，使用濃度為120微克-300微克，該紫外線誘變處理為在紫外燈下照射30-300秒，避光進行紫外線誘變處理；該衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理為先將孢子液置于安培管及微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)隨衛(wèi)星搭載，再置于高能等離子發(fā)生器內(nèi)進行輻射誘變處理5-90秒鐘。
本發(fā)明的第一種誘變方法是化學(xué)誘變劑處理采用N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(簡稱NTG，以下同)做化學(xué)誘變劑處理鏈霉菌菌種。
具體步驟如下(1)孢子液的制備先將鏈霉菌的菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為14-22mm，長度為18-23mm，試管的蓋為棉塞或硅橡膠塞，培養(yǎng)溫度為20-32℃，時間5-35天，待菌苔生長出后，加入5-12ml/支的無菌生理鹽水，將菌苔輕輕刮起，使菌苔表面的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的總體積5-20ml；高氏一號培養(yǎng)基的配方為可溶性淀粉20.0克、KNO31.0克、K2HPO40.5克、MgSO4.7H2O 0.5克、NaCl 0.5克、FeSO4.7H2OO 0.01克、瓊脂15克、蒸餾水1.0升、pH7.2-7.4。葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基的配方為葡萄糖10.0克、天門冬素0.5克、K2HPO40.5克、瓊脂15.0克、蒸餾水1.0升、pH7.2-7.4；(2)化學(xué)誘變處理加化學(xué)誘變劑N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍，終濃度為120微克-300微克，在溫度20-38℃條件下，上搖瓶機，轉(zhuǎn)速15-60轉(zhuǎn)/分，避光進行化學(xué)誘變處理，時間20分鐘至90分鐘；(3)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為20-35℃，時間5-40天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株；產(chǎn)素性能比較調(diào)取本發(fā)明制取的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上述(1)孢子液的制備，原有的鏈霉菌菌株同時進行，也按上述(1)孢子液的制備操作。取孢子懸液0.15-1.0ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的容器為500ml三角瓶，裝量為40-100ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共做6批的結(jié)果表明，本發(fā)明的化學(xué)誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為20-30％，不同批的平均水平偏差為22-28％；整體產(chǎn)素水平本發(fā)明的化學(xué)誘變株要比對照株提高12-18％。
實施例2本發(fā)明的第二種誘變方法是紫外線照射處理。具體培養(yǎng)步驟如下(1)孢子液的制備同實施例1的(1)孢子液的制備。
(2)紫外線誘變處理將制備好的孢子液加到內(nèi)徑為4-10mm的雙碟中，加入量為3-15ml，在距離為250mm-600mm的紫外燈下，照射時間為30-200秒，處理前、后及處理過程中，均要求避免其他光線進行紫外線誘變處理。
(3)分離誘變株同實施例1的(3)分離誘變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取本方法制取的變株單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1的(1)孢子液的制備，原有菌株同時進行，也按實施例1的(1)孢子液的制備操作。各取孢子懸液0.15-1.0ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的容器為500ml三角瓶，裝量為40-100ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共做5批的結(jié)果表明，紫外線誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為12-30％，不同批的平均水平偏差為25-30％；整體產(chǎn)素水平本發(fā)明的紫外線誘變株要比對照株提高15-26％。
實施例3本發(fā)明的第三種誘變方法是衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理，具體培養(yǎng)步驟如下(1)孢子液的制備同實施例1的(1)孢子液的制備或(2)化學(xué)誘變處理；(2)衛(wèi)星搭載處理將孢子液分裝于安培管內(nèi)，裝入微生物樣品盒內(nèi)，再裝入微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，最后置放在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)，常溫或控溫搭載均可，衛(wèi)星回收后制得衛(wèi)星搭載樣品；(3)高能等離子體輻射處理按實施例1的(1)孢子液的制備操作，然后將制備的孢子液裝入內(nèi)徑為8-10mm的雙碟中，裝量為5-20ml，置于高能等離子發(fā)生器進行輻射誘變處理，輻射時間5-90秒，溫度為常溫；(4)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為20-35℃，時間5-40天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取本發(fā)明制取的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上述(1)孢子液的制備，原有的鏈霉菌菌株同時進行，也按上述(1)孢子液的制備操作。取孢子懸液0.15-1.0ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的容器為500ml三角瓶，裝量為40-100ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共做4批的結(jié)果表明，產(chǎn)素瓶差為12-20％，不同批的平均水平偏差為18-25％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高12-25％。
實施例4本實施例采用N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(簡稱NTG，以下同)做化學(xué)誘變劑處理菌種。具體步驟如下(1)孢子液的制備先將鏈霉菌菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為14mm，長度為18mm，試管的蓋為硅橡膠塞，培養(yǎng)溫度為21℃，時間6天，待菌苔生長好后，加入6ml/支的無菌生理鹽水，用竹鏟將菌苔輕輕刮起，使菌苔表面的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的總體積6ml，孢子數(shù)在104-105/ml；(2)誘變處理加誘變劑NTG，終濃度為125微克-130微克，溫度21℃，上搖瓶機，轉(zhuǎn)速16-20轉(zhuǎn)/分，避光，時間22分鐘；(3)分離誘變株取處理后的菌液0.06ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基，用直徑為3mm玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，然后進行培養(yǎng)，溫度為21℃，時間6天，培養(yǎng)出本發(fā)明的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1的(1)孢子液的制備，原有菌株同時進行，也按實施例1的(1)孢子液的制備操作。取孢子懸液0.2-0.4ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的容器為500ml三角瓶，裝量為40-45ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共進行了3批的測試。結(jié)果為，誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為28-30％，不同批的平均水平偏差為22-24％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高12-13％。
實施例5本實施例采用N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(簡稱NTG，以下同)做化學(xué)誘變劑處理菌種。具體步驟如下(1)孢子液的制備先將鏈霉菌菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為15mm，長度為19mm，試管的蓋為硅橡膠塞，培養(yǎng)溫度為25℃，時間23天，待菌苔生長好后，加入8ml/支的無菌生理鹽水，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起，使菌苔表面的的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的總體積10ml，孢子數(shù)在104-105/ml；(2)誘變處理加誘變劑NTG，終濃度為135微克-140微克，溫度25℃，上搖瓶機，轉(zhuǎn)速16-20轉(zhuǎn)/分，避光，時間30分鐘；(3)分離誘變株取處理后的菌液0.08ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用直徑為3mm玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，然后進行培養(yǎng)，溫度為25℃，時間23天，培養(yǎng)出本發(fā)明的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1，原有菌株同時進行，也按實施例1操作。取孢子懸液0.2-0.4ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的的容器為500ml三角瓶，裝量為40-45ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共進行了3批的觀察。結(jié)果，誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為22-30％，不同批的平均水平偏差為23-25％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高13-15％。
實施例6本實施例采用N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(簡稱NTG，以下同)做化學(xué)誘變劑處理菌種。具體步驟如下(1)孢子液的制備先將菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為高氏一號，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為22mm，長度為23mm，試管的蓋為棉塞，培養(yǎng)溫度為27℃，時間20天，待菌苔生長好后，加入7ml/支的無菌生理鹽水，用鋼鏟將菌苔輕輕刮起，使菌苔表面的的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的總體積20ml，孢子數(shù)在105-108/ml；(2)誘變處理加誘變劑NTG，終濃度為150微克-155微克，溫度27℃，上搖瓶機，轉(zhuǎn)速21-25轉(zhuǎn)/分，避光，時間35分鐘；(3)分離誘變株取處理后的菌液0.3ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基，用直徑為5mm玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，然后進行培養(yǎng)，溫度為27℃，時間8天培養(yǎng)出本發(fā)明的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1，原有菌株同時進行，也按實施例1操作。取孢子懸液0.5ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的的容器為500ml三角瓶，裝量為50ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共進行了4批的觀察。結(jié)果，誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為28-30％，不同批的平均水平偏差為26-28％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高16-18％。
實施例7本實施例采用N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(簡稱NTG，以下同)做化學(xué)誘變劑處理菌種。具體步驟如下(1)孢子液的制備先將鏈霉菌菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為高氏一號，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為14mm，長度為18mm，試管的蓋為棉塞，培養(yǎng)溫度為28℃，時間11天，待菌苔生長好后，加入7ml/支的無菌生理鹽水，用試管吹吸4遍，使菌苔表面的的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的總體積5ml，孢子數(shù)在105-108/ml；(2)誘變處理加誘變劑NTG，終濃度為155微克-165微克，溫度28℃，上搖瓶機，轉(zhuǎn)速21轉(zhuǎn)/分，避光，時間38分鐘；(3)分離誘變株取處理后的菌液0.35ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用直徑為5mm玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，然后進行培養(yǎng)，溫度為28℃，時間9天，培養(yǎng)出本發(fā)明的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1，原有菌株同時進行，也按實施例1操作。取孢子懸液0.5-0.6ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的的容器為500ml三角瓶，裝量為45-50ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共進行了5批的觀察。結(jié)果，誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為20-30％，不同批的平均水平偏差為24-28％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高14-16％。
實施例8本實施例采用N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(簡稱NTG，以下同)做化學(xué)誘變劑處理菌種。具體步驟如下(1)孢子液的制備先將菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為15mm，長度為20mm，試管的蓋為棉塞，培養(yǎng)溫度為30℃，時間12天，待菌苔生長好后，加入8ml/支的無菌生理鹽水，用試管吹吸5遍，使菌苔表面的的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的總體積10ml，孢子數(shù)在109-1010/ml；(2)誘變處理加誘變劑NTG，終濃度為180微克-190微克，溫度35℃，上搖瓶機，轉(zhuǎn)速26-35轉(zhuǎn)/分，避光，時間70分鐘；(3)分離誘變株取處理后的菌液0.45ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基，用直徑為3mm玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，然后進行培養(yǎng)，溫度為27℃，時間12天培養(yǎng)出本發(fā)明的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1，原有菌株同時進行，也按實施例1操作。取孢子懸液0.5-0.6ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的的容器為500ml三角瓶，裝量為45-50ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共進行了5批的觀察。結(jié)果，誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為23-30％，不同批的平均水平偏差為24-28％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高14-18％。
實施例9本實施例的誘變處理方法為紫外線照射處理。具體步驟如下(1)孢子液的制備先將菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為16mm，長度為18.5mm，試管的蓋為硅橡膠塞，培養(yǎng)溫度為29℃，時間15天，待菌苔生長好后，加入10ml/支的無菌生理鹽水，用竹鏟將菌苔輕輕刮起，使菌苔表面的的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的總體積20ml，孢子數(shù)在106-108/ml；(2)將制備好的孢子液加到內(nèi)徑為9mm的雙碟中，加入量為5ml，在紫外燈下，距離為250mm，照射時間為50秒，處理前、后及處理過程中，均要求避免其他光線。培養(yǎng)出本發(fā)明的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1，原有菌株同時進行，也按實施例1操作。取孢子懸液0.2-0.3ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的的容器為500ml三角瓶，裝量為45-50ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共進行了4批的觀察。結(jié)果，誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為28-30％，不同批的平均水平偏差為26-28％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高15-18％。
實施例10
本實施例的誘變處理方法為紫外線照射處理。具體步驟如下(1)孢子液的制備先將菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為19mm，長度為21mm，試管的蓋為棉塞，培養(yǎng)溫度為27℃，時間12天，待菌苔生長好后，加入7ml/支的無菌生理鹽水，用試管吹吸5遍，使菌苔表面的的孢子盡可能地分散到鹽水中；(2)將制備好的孢子液加到內(nèi)徑為6mm的雙碟，加入量為5ml，孢子數(shù)在1010-1012/ml，在紫外燈下，距離為300mm，照射時間為65秒，處理前、后及處理過程中，均要求避免其他光線，培養(yǎng)出本發(fā)明的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1，原有菌株同時進行，也按實施例1操作。取孢子懸液0.8-1.0ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的的容器為500ml三角瓶，裝量為55-60ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共進行了5批的觀察。結(jié)果，誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為22-28％，不同批的平均水平偏差為27-29％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高19-22％。
實施例11本實施例的誘變處理方法為紫外線照射處理。具體步驟如下(1)孢子液的制備先將菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為20mm，長度為21mm，試管的蓋為硅橡膠塞，培養(yǎng)溫度為30℃，時間12天，待菌苔生長好后，加入8ml/支的無菌生理鹽水，用試管吹吸4遍，使菌苔表面的的孢子盡可能地分散到鹽水中；(2)將制備好的孢子液加到內(nèi)徑為4mm的雙碟，加入量為3ml，孢子數(shù)在1010-1012/ml，在紫外燈下，距離為400mm，照射時間為90秒，處理前、后及處理過程中，均要求避免其他光線，培養(yǎng)出本發(fā)明的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
產(chǎn)素性能比較調(diào)取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同實施例1，原有菌株同時進行，也按實施例1操作。取孢子懸液0.8-1.0ml/瓶，5瓶/批，接種到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的的容器為500ml三角瓶，裝量為55-60ml，進行搖瓶培養(yǎng)。共進行了5批的觀察。結(jié)果，誘變株同批搖瓶個體比較，產(chǎn)素水平偏差為12-20％，不同批的平均水平偏差為25-28％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高23-25％。
實施例12本實施例的誘變處理方法為衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理。具體步驟如下(1)孢子液的制備同實施例1的(1)孢子液的制備；(2)衛(wèi)星搭載處理將孢子液分裝于安培管內(nèi)，裝入微生物樣品盒內(nèi)，再裝入微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，最后置放在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)，常溫搭載，搭載時間10天，衛(wèi)星回收后得搭載樣品，(3)高能等離子體輻射處理按實施例1的(1)孢子液的制備操作，然后將制備的孢子液裝入內(nèi)徑為10mm的雙碟中，裝量為5ml，置于高能等離子發(fā)生器進行輻射誘變處理，輻射時間9秒，溫度為常溫；(4)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為20℃，時間40天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。共進行了3批的觀察。對照株為鏈霉菌。結(jié)果，產(chǎn)素瓶差為13-20％，不同批的平均水平偏差為19-21％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高13-15％。
實施例13本實施例的誘變處理方法為化學(xué)誘變處理與衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理的聯(lián)合處理。具體步驟如下(1)孢子液的制備孢子液的來源為實施例7的孢子液；(2)衛(wèi)星搭載處理將孢子液分裝于安培管內(nèi)，裝入微生物樣品盒內(nèi)，再裝入微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，最后置放在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)，常溫搭載，搭載時間10天，衛(wèi)星回收后待搭載樣品；(3)高能等離子體輻射處理按實施例1的(1)孢子液的制備操作，然后將制備的孢子液裝入內(nèi)徑為10mm的雙碟中，裝量為10ml，置于高能等離子發(fā)生器進行輻射誘變處理，輻射時間10秒，溫度為常溫；(4)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為35℃，時間5天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。共進行了4批的觀察。對照株為化學(xué)誘變劑處理的變株。結(jié)果，產(chǎn)素瓶差為18-22％，不同批的平均水平偏差為20-23％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高15-18％?？偖a(chǎn)素水平提高為實施例7與本實施例相加，即(14-16％)+(15-18％)，合計為29-34％。
實施例14本實施例的誘變處理方法為化學(xué)誘變處理與衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理的聯(lián)合處理。具體步驟如下(1)孢子液的制備孢子液的來源為實施例8的孢子液；(2)衛(wèi)星搭載處理將孢子液分裝于安培管內(nèi)，裝入微生物樣品盒內(nèi)，再裝入微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，最后置放在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)，恒溫搭載，溫度為25℃，搭載時間15天，衛(wèi)星回收后待搭載樣品；(3)高能等離子體輻射處理按實施例1的(1)孢子液的制備操作，然后將制備的孢子液裝入內(nèi)徑為9mm的雙碟中，裝量為7ml，置于高能等離子發(fā)生器進行輻射誘變處理，輻射時間15秒，溫度為常溫；(4)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為20-35℃，時間5-40天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。共進行了4批的觀察。對照株為化學(xué)誘變劑處理的變株(見實施例8)。結(jié)果，產(chǎn)素瓶差為18-20％，不同批的平均水平偏差為18-20％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高18-20％?？偖a(chǎn)素水平提高為33-38％。
實施例15本實施例的誘變處理方法為化學(xué)誘變處理與衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理的聯(lián)合處理。具體步驟如下(1)孢子液的制備孢子液的來源為實施例4的孢子液；(2)衛(wèi)星搭載處理將孢子液分裝于安培管內(nèi)，裝入微生物樣品盒內(nèi)，再裝入微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，最后置放在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)，常溫搭載，搭載時間15天，衛(wèi)星回收后得搭載樣品；(3)高能等離子體輻射處理按實施例1的(1)孢子液的制備操作，然后將制備的孢子液裝入內(nèi)徑為6mm的雙碟中，裝量為8ml，置于高能等離子發(fā)生器進行輻射誘變處理，輻射時間16秒，溫度為常溫；(4)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為20℃，時間40天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。共進行了4批的觀察。對照株為化學(xué)誘變劑處理的變株(見實施例4)。結(jié)果，產(chǎn)素瓶差為14-19％，不同批的平均水平偏差為20-23％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高21-23％?？偖a(chǎn)素水平提高為33-36％。
實施例16本實施例的誘變處理方法為紫外線照射處理與衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理的聯(lián)合處理。具體步驟如下(1)孢子液的制備孢子液的來源為實施例11的孢子液；(2)衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理將孢子液分裝于安培管內(nèi)，裝入微生物樣品盒內(nèi)，再裝入微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，最后置放在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)，常溫搭載，搭載時間20天，衛(wèi)星回收后待搭載樣品；(3)高能等離子體輻射處理按實施例1的(1)孢子液的制備操作，然后將制備的孢子液裝入內(nèi)徑為10mm的雙碟中，裝量為20ml，置于高能等離子發(fā)生器進行輻射誘變處理，輻射時間40秒，溫度為常溫；(4)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為35℃，時間5天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。共進行了4批的觀察。對照株為紫外線照射誘變處理的變株(見實施例11)。結(jié)果，產(chǎn)素瓶差為11-18％，不同批的平均水平偏差為10-15％；整體產(chǎn)素水平誘變株要比對照株提高20-25％。總產(chǎn)素水平提高為43-50％。
當然還可以將各誘變處理后的孢子液進一步再進行誘變處理，如此得到更高的總產(chǎn)素水平，因處理方法相同，故不重述。
上述實施例1-16的誘變處理條件及產(chǎn)素水平列于表1
表1中I為化學(xué)誘變處理II為紫外線誘變處理；
III為衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理；III1為實施例7的化學(xué)誘變孢子液與III聯(lián)合處理III2為實施例8的化學(xué)誘變孢子液與III聯(lián)合處理III3為實施例4的化學(xué)誘變孢子液與III聯(lián)合處理III4為實施例11的紫外線誘變孢子液與III聯(lián)合處理。
從表1的實施結(jié)果表明，本發(fā)明的誘變處理方法中的一種或兩種以上的聯(lián)合處理后，其產(chǎn)素的瓶差在30％以下，批差在30％以下，整體產(chǎn)素水平提高12-26％，其兩種或兩種以上的聯(lián)合誘變處理，產(chǎn)素水平提高量為兩次或兩次以上的加和，故總產(chǎn)素水平可達12-80％?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)素能力較低及產(chǎn)素的不穩(wěn)定性較高的缺陷，從而開創(chuàng)了將圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株應(yīng)用于工業(yè)化微生物發(fā)酶生產(chǎn)新多氧霉素及新多氧霉素衍生物的前體生產(chǎn)中的新途徑。
新多氧霉素能夠抑制多種真菌的生長，可用于防治多種農(nóng)作物的真菌病害，如蘋果斑點落葉病，防治有效率達68％，使用濃度為150ppm。草莓灰霉病，防治有效率達99％，使用濃度為200ppm。人參褐斑病，防治有效率達79％，使用濃度為160ppm。煙草赤星病，防治有效率達76％，使用濃度為150ppm。
圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株與原有菌株的區(qū)別表現(xiàn)為產(chǎn)素性能穩(wěn)定性的差別及菌株全旦白分析上的差別，主要特征原有菌株缺少分子量為66000道爾頓、45000道爾頓、34700道爾頓的蛋白帶；原有菌株與變株的蛋白帶分布差別較大的分子量是在24000-66000道爾頓之間，最為明顯的是前沿蛋白帶的區(qū)別。
權(quán)利要求
1.一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株，其特征在于通過化學(xué)誘變劑、紫外線照射、衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理中的一種或兩種以上聯(lián)合處理孢子液，培養(yǎng)出的圈卷產(chǎn)色鏈霉素菌變株，保藏號為CGMCC NO0446，分類命名為“圈卷產(chǎn)色鏈霉菌種Streptomyces ansochromogenus”。
2.如權(quán)利要求1所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株，其特征在于該化學(xué)誘變劑為N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍，使用濃度為120微克-300微克；
3.如權(quán)利要求1所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株，其特征在于該紫外線誘變處理為在紫外燈下照射30-300秒，避光進行紫外線誘變處理；
4.如權(quán)利要求1所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株，其特征在于該衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理為先將孢子液置于安培管及微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)隨衛(wèi)星搭載，再置于高能等離子發(fā)生器內(nèi)進行輻射誘變處理5-90秒鐘。
5.一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的培養(yǎng)方法，其特征在于具體步驟如下(1)孢子液的制備先將鏈霉菌的菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，裝斜面培養(yǎng)基的試管規(guī)格內(nèi)徑為14-22mm，長度為18-23mm，試管的蓋為棉塞或硅橡膠塞，培養(yǎng)溫度為20-32℃，時間5-35天，待菌苔生長出后，加入5-12ml/支的無菌生理鹽水，將菌苔輕輕刮起，使菌苔表面的孢子盡可能地分散到鹽水中，用吸管將孢子液移至的三角瓶中；(2)誘變處理通過化學(xué)誘變劑、紫外線照射、衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理中的一種或兩種以上聯(lián)合處理孢子液，培養(yǎng)出圈卷產(chǎn)色鏈霉素菌變株；(3)分離誘變株取處理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先鋪好的平板，培養(yǎng)基為高氏一號或葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基，用玻璃棒制成的三角刮鏟涂平板，進行培養(yǎng)，溫度為20-35℃，時間5-40天，培養(yǎng)出本發(fā)明的高產(chǎn)穩(wěn)定的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株。
6.如權(quán)利要求5所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的培養(yǎng)方法，其特征在于該化學(xué)誘變劑處理為在制備的孢子液中，加化學(xué)誘變劑N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍，終濃度為120微克-300微克，在溫度20-38℃條件下，上搖瓶機，轉(zhuǎn)速15-60轉(zhuǎn)/分，避光進行化學(xué)誘變處理，時間為20分鐘至90分鐘。
7.如權(quán)利要求5所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的培養(yǎng)方法，其特征在于該紫外線誘變處理為，將制備好的孢子液加到內(nèi)徑為4-10mm的雙碟中，加入量為3-15ml，在距離為250mm-600mm的紫外燈下，照射時間為30-200秒，處理前、后及處理過程中，均要求避免其他光線進行紫外線誘變處理。
8.如權(quán)利要求5所述的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的培養(yǎng)方法，其特征在于該衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理為先將孢子液置于安培管及微生物培養(yǎng)箱內(nèi)，在衛(wèi)星搭載艙內(nèi)隨衛(wèi)星搭載，再置于高能等離子發(fā)生器內(nèi)進行輻射誘變處理5-90秒鐘。
9.一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株的應(yīng)用，其特征在于圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株應(yīng)用于工業(yè)化微生物發(fā)酶生產(chǎn)新多氧霉素及新多氧霉素衍生物的前體生產(chǎn)中。
全文摘要
一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用,通過化學(xué)誘變劑、紫外線照射、衛(wèi)星搭載和高能等離子輻射復(fù)合處理中的一種或兩種以上聯(lián)合處理孢子液,培養(yǎng)出圈卷產(chǎn)色鏈霉素菌變株,保藏號為CGMCC NO0446,分類命名為“圈卷產(chǎn)色鏈霉菌種Streptomyces ansochromogenus”。圈卷產(chǎn)色鏈霉菌變株應(yīng)用于工業(yè)化微生物發(fā)酶生產(chǎn)新多氧霉素及新多氧霉素衍生物的前體生產(chǎn)中。
文檔編號C12N13/00GK1269404SQ0010588
公開日2000年10月11日 申請日期2000年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月14日
發(fā)明者駱愛群, 宋幼新, 劉志恒 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所