專利名稱：用于蕈菌液體深層發(fā)酵控制的方法
靈芝(包括紅芝、紫芝等)是我國分布廣、醫(yī)學(xué)價(jià)值高的一類藥用蕈菌?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》中早有靈芝的記載，它是民間用之已久的中草藥及滋補(bǔ)品。近代化學(xué)分析研究表明，它含有許多種功能成份，對(duì)中樞神經(jīng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、肝臟等有重要的扶正培本”作用。近年來，關(guān)于靈芝的藥理與生理作用有了更深入的研究及臨床結(jié)果，以靈芝為原料所制備的具有藥療或輔療作用的管養(yǎng)藥劑Nutriceutical”愈益受到人們的重視和關(guān)注。
靈芝子實(shí)體栽培工藝難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，加之子實(shí)體的木質(zhì)化使其有效成份又很難完全提取而被利用。不斷的研究結(jié)果又表明，液體深層培養(yǎng)的菌絲培養(yǎng)物與子實(shí)體有相同的臨床效果。而且液體培養(yǎng)過程中胞外代謝產(chǎn)物的有效成份可分泌與保留在培養(yǎng)液中，但是栽培工藝中子實(shí)體細(xì)胞的有效代謝成份的一部份卻散失到不能被利用的固體栽培基質(zhì)中。由于上述種種原因，國內(nèi)外(如日本、東南亞，包括一些西方國家)加強(qiáng)對(duì)靈芝類液體深層發(fā)酵工藝的研究開發(fā)。但是至今其液體發(fā)酵工藝仍沿用子實(shí)體栽培工藝中菌絲種液搖瓶培養(yǎng)方法放大的分批發(fā)酵技術(shù)，存在工藝不完善、生產(chǎn)效率低的弊病。
藥用蕈菌(大型絲狀真菌)細(xì)胞在液體深層培養(yǎng)體系中的形態(tài)學(xué)特征明顯不同于細(xì)菌或放線菌，易形成不同分支程度的纖長(zhǎng)菌絲，進(jìn)而菌絲間又發(fā)生不同緊密度及空間度的纏繞。培養(yǎng)體系中液流的物理因子與化學(xué)因子(液流類型、剪切力、黏度、固相物特性、氣相物特性、基質(zhì)濃度、酸度等)的干擾作用可引起菌絲的斷裂、分支特征的改變，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)比速率(單位細(xì)胞量的細(xì)胞生成速率)的下降；以及由于細(xì)胞菌絲自身纏繞成絮團(tuán)，引起細(xì)胞集合顆粒內(nèi)部的物質(zhì)傳遞阻力增大，而使內(nèi)部細(xì)胞缺少溶解氧及營(yíng)養(yǎng)，也導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)比速率的下降。所以，蕈菌細(xì)胞在液體深層培養(yǎng)體系中，生長(zhǎng)比速率的控制顯得更為重要。針對(duì)蕈菌類絲狀細(xì)胞的生理生化、形態(tài)及代謝特征，采用本發(fā)明的工藝手段，可以調(diào)整蕈菌細(xì)胞在液體深層培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)比速率值在優(yōu)化控制的范圍內(nèi)，以提高大型絲狀真菌液體深層培養(yǎng)的細(xì)胞生成濃度、細(xì)胞生成效率，從而改善發(fā)酵水平。絲狀真菌靈芝含有許多種功能蛋白、多糖、有機(jī)酸、生物堿、香豆素、甾麥醇以及甙類等有效生物活性物質(zhì)，成份復(fù)雜，藥效廣泛。取其單一成份，則藥效降低。所以，從藥理學(xué)觀點(diǎn)看，藥用絲狀真菌發(fā)酵液是一種綜合抗病因子制劑，對(duì)于這種復(fù)雜的活性因子培養(yǎng)體系，常用菌體生長(zhǎng)作為發(fā)酵及其代謝過程優(yōu)劣的相關(guān)指標(biāo)。發(fā)酵生產(chǎn)中，由于產(chǎn)品目標(biāo)不同，有的以細(xì)胞生成濃度(即單位體積發(fā)酵液中的細(xì)胞量)為指標(biāo)；有的以細(xì)胞生成效率(即單位時(shí)間內(nèi)單位體積發(fā)酵液中的細(xì)胞量)為指標(biāo)。本發(fā)明的實(shí)施過程如下。
從發(fā)酵工程學(xué)觀點(diǎn)，分批發(fā)酵是一類封閉式培養(yǎng)體系(即培養(yǎng)過程中無料液的輸入和輸出)。細(xì)胞菌絲進(jìn)入新鮮營(yíng)養(yǎng)基后的生長(zhǎng)比速率在逐步達(dá)到最大值后，即隨著培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度的下降而明顯降低。采用單元反饋補(bǔ)料控制方法對(duì)培養(yǎng)體系輸入新鮮營(yíng)養(yǎng)基可以不斷改善細(xì)胞的基質(zhì)環(huán)境，使細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率保持在一個(gè)較佳范圍而持續(xù)一段較長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，達(dá)到優(yōu)化目的。采用的方法步驟是按如下給出的培養(yǎng)基。靈芝液體深層發(fā)酵以蔗糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成中，初始蔗糖濃度為0.8-1.5％。培養(yǎng)基中其他組成(％)玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。接種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，pH控制在4.8-5.5。發(fā)酵體系中的還原糖濃度降為0.3-0.5％時(shí)，開始往發(fā)酵體系內(nèi)流加濃度為15％的蔗糖溶液。發(fā)酵過程中每隔4小時(shí)(每4小時(shí)作為一個(gè)單元時(shí)間)，取樣離線檢測(cè)還原糖濃度，并計(jì)算發(fā)酵體系該單元時(shí)間的平均耗糖速率。據(jù)體系中糖濃度的變化速率，反饋調(diào)整下一單元時(shí)間的補(bǔ)糖速度，使發(fā)酵體系中的還原糖維持濃度始終保持在0.6-0.8％范圍內(nèi)。發(fā)酵體系中單元時(shí)間平均耗糖速率的計(jì)算方法如下由上次取樣時(shí)間到這次取樣時(shí)間之間的單元時(shí)間為4小時(shí)。該4小時(shí)的平均耗糖速率記為M[克/小時(shí)]，
則 M＝(V1)(s1)(1/4)－(V2)(s2)(1/4)＋(d)(v)，設(shè)定V1 上次取樣時(shí)間的培養(yǎng)液體積[立升]s1 上次取樣時(shí)間測(cè)得的還原糖濃度[克/立升]V2 這次取樣時(shí)間的培養(yǎng)液體積[立升]s2 這次取樣時(shí)間測(cè)得的還原糖濃度[克/立升]d 流加蔗糖溶液的還原糖濃度[克/立升]v 該單元時(shí)間的流加速度[立升/小時(shí)]v*下一單元時(shí)間的流加速度[立升/小時(shí)](其中培養(yǎng)液體積是時(shí)間變量，等于初始培養(yǎng)液體積與已補(bǔ)料液體積之和[立升])，然而，調(diào)整下一單元時(shí)間的流加速度v*＝(M)/(d)。該補(bǔ)料操作持續(xù)3-4天，在這培養(yǎng)期間，細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率的變化區(qū)間可始終被控制在0.030-0.060(l/h)較佳范圍內(nèi)。從工藝學(xué)觀點(diǎn)，這是一種半開放、變體積的補(bǔ)料發(fā)酵操作體系。目前有關(guān)靈芝液體深層發(fā)酵報(bào)道用的都是分批發(fā)酵技術(shù)，其發(fā)酵液中細(xì)胞終濃度(純細(xì)胞絕對(duì)干重計(jì))為6-10克/立升左右。用上述工藝技術(shù)，細(xì)胞濃度可較分批發(fā)酵的報(bào)道值最高增加到2倍以上，細(xì)胞生成效率也可較分批發(fā)酵提高到1.5倍以上。另外，在目前缺乏即允許在線滅菌、又質(zhì)量可靠的還原糖測(cè)定電極的情況下，該方法更為實(shí)用有效。
當(dāng)然，我們進(jìn)一步也可以控制細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率維持在一個(gè)相同的較佳值，即采用恒定連續(xù)液流控制方法，對(duì)培養(yǎng)體系以選定速度連續(xù)輸入新鮮營(yíng)養(yǎng)基、同時(shí)以相同速度連續(xù)輸出發(fā)酵液，則可以提供一個(gè)基本相同的、良好的細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)環(huán)境，使細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率保持一個(gè)相同的較佳值、并持續(xù)整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間，達(dá)到優(yōu)化目的。采用的方法步驟是按如下給出的培養(yǎng)基。靈芝液體深層發(fā)酵在以工業(yè)葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基組成中，葡萄糖的初始濃度為0.8-1.2％。培養(yǎng)基中其他組成(％)玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。培養(yǎng)溫度28℃，pH控制在4.8-5.5。接種培養(yǎng)14小時(shí)后，開始從培養(yǎng)體系的進(jìn)料口連續(xù)地以恒定速度(料液流動(dòng)速率)輸入新鮮培養(yǎng)基(配方與初始培養(yǎng)基組成相同)，與此同時(shí)以相同恒定速度、連續(xù)地由發(fā)酵體系向外輸出并收集發(fā)酵液，維持發(fā)酵體系的恒定體積。料液流動(dòng)速率值的選擇應(yīng)滿足如下條件，選用的某一料液流動(dòng)速率值使相應(yīng)的某一稀釋率”參數(shù)值應(yīng)在0.030-0.060(l/h)范圍內(nèi)。
它們的定量關(guān)系為[料液流動(dòng)速率]/[發(fā)酵液恒定體積]＝[稀釋率]。
其中，料液流動(dòng)速率的單位[立升/小時(shí)]，發(fā)酵液恒定體積的單位[立升]，稀釋率的單位[l/小時(shí)]。其結(jié)果，細(xì)胞菌絲的生長(zhǎng)比速率[單位l/小時(shí)]可以始終以一個(gè)較佳值持續(xù)整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間，數(shù)值上應(yīng)等于所選定的稀釋率參數(shù)值。這樣，細(xì)胞生長(zhǎng)比速率被控制在0.030-0.060(l/h)范圍中的一個(gè)選擇值上。發(fā)酵體系的排出液(即產(chǎn)物)的細(xì)胞生成效率可較分批發(fā)酵的報(bào)道值提高到2倍以上，而分批發(fā)酵細(xì)胞生成效率值常為0.06-0.08克/立升/小時(shí)(以純細(xì)胞絕對(duì)干重計(jì))。從工藝學(xué)觀點(diǎn)，這是一種全開放、恒體積的連續(xù)發(fā)酵操作體系。這樣的操作體系，可使生產(chǎn)周期明顯延長(zhǎng)，并節(jié)約單批生產(chǎn)時(shí)的反應(yīng)器前期處理、種子培養(yǎng)等相應(yīng)步驟。
本技術(shù)的方法特別適用于對(duì)靈芝(如赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma sinense)以及姬松茸Agaricus blazei類的工業(yè)化生產(chǎn)。為了能達(dá)到滿意的結(jié)果，使用ALR/ff生物反應(yīng)器(專利申請(qǐng)?zhí)?9121894.9)進(jìn)行上述發(fā)酵過程的效果可以更好。
實(shí)施例一在2.5立升生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)基初始體積1200ml。發(fā)酵培養(yǎng)基組成(％)食用蔗糖1.0，玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB10.0015，自然pH。用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的靈芝(Ganoderma sinense)菌絲搖瓶種液120ml接入反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)還原糖濃度降至0.5％時(shí)，開始用15ml/h的補(bǔ)料速率往生物反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)流加經(jīng)滅菌的15％食用蔗糖溶液。每4小時(shí)作為一個(gè)單元時(shí)間取樣分析培養(yǎng)體系內(nèi)的還原糖濃度(常用的DNS測(cè)定法)，并計(jì)算該單元時(shí)間內(nèi)發(fā)酵體系平均耗糖速率值，以此值為依據(jù)確定下一單元時(shí)間的補(bǔ)料速率，使培養(yǎng)體系內(nèi)的還原糖濃度始終維持在0.6-0.8％之間。發(fā)酵體系中單元時(shí)間平均耗糖速率計(jì)算及其調(diào)整方法見上述“實(shí)施過程”的敘述部分。補(bǔ)完800ml補(bǔ)料液后，繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)，使還原糖濃度降至0.3％。整個(gè)過程可用10％NaHCO3溶液調(diào)整pH值，pH控制在4.8-5.5。培養(yǎng)溫度28℃。補(bǔ)料期間細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率可維持在0.032-0.042(l/h)范圍內(nèi)。發(fā)酵周期共5天。發(fā)酵液的純細(xì)胞絕對(duì)干重濃度可達(dá)13.9克/立升。同時(shí)，細(xì)胞的生成效率為0.111克/立升/小時(shí)。
實(shí)施例二在2.5立升ALR/ff生物反應(yīng)器中，裝有發(fā)酵培養(yǎng)基1800ml。接種靈芝(Ganoderma sinense)菌絲搖瓶種液200ml(靈芝菌絲搖瓶種液的制備同實(shí)施例一)，總體積定為2000ml。發(fā)酵培養(yǎng)基組成(％)工業(yè)葡萄糖0.8，玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。接種培養(yǎng)14小時(shí)后用蠕動(dòng)泵由生物反應(yīng)器的進(jìn)料口恒速流加進(jìn)料(料液組成與初始培養(yǎng)基相同)。與此同時(shí)，以相同速率進(jìn)行排料。保持發(fā)酵體系的恒等體積及均勻性?？刂七M(jìn)料速率96ml/h，稀釋率即等于0.048(l/h)。經(jīng)過24-36小時(shí)培養(yǎng)后發(fā)酵體系逐步達(dá)到細(xì)胞濃度相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)(純細(xì)胞絕對(duì)干重維持約3.1克/立升)，收集排出的發(fā)酵液(產(chǎn)物)。這樣，穩(wěn)定連續(xù)地維持0.048(l/h)稀釋率的動(dòng)態(tài)物料流，即控制細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率基本恒定為0.048(l/h)、連續(xù)培養(yǎng)15天以上。培養(yǎng)溫度及pH控制要求同實(shí)施例一。所獲發(fā)酵液的細(xì)胞生成效率值為0.149克/立升/小時(shí)(以純細(xì)胞絕對(duì)干重計(jì))。參考文獻(xiàn)1)應(yīng)建淅等《中國藥用真菌圖鑒》，科學(xué)出版社，1987。2)林志彬等《藥學(xué)學(xué)報(bào)》，pP.183-192，Vol.14，No.3，1979.3)趙繼鼎《中國靈芝新編》，科學(xué)出版社，1989。4)洪震等《食用藥用菌實(shí)驗(yàn)技術(shù)及發(fā)酵生產(chǎn)》，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)出版社，1992。5)閩三弟《食用菌學(xué)報(bào)》，3(1)21-26，1996。6)高大維等《食品與發(fā)酵工業(yè)》，23(2)47，1997。7)何來英等《中國食品衛(wèi)生雜志》，P.41-44，Vol，9，No，3，1997。8)賀新生等《食用菌學(xué)報(bào)》，4(2)54-64，1997。9)汪維云等《中國食用菌》，17(2)1，1998。10)吉田等《發(fā)酵工學(xué)雜志》，46125,119(1968)。11)Takuma Sasaki，et al.Chem.Pharm.Bull，19(4)821-826，1971.12)Shoichi Nakashima，et al.Microbiol.Immunol，23(6)501-513,1979.
權(quán)利要求
1.一種用于蕈菌液體深層發(fā)酵的控制方法，其特征在于，發(fā)酵過程采用控制細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率在0.030-0.060(l/h)的范圍內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，可以用15％濃度的蔗糖溶液對(duì)發(fā)酵體系連續(xù)進(jìn)行流加補(bǔ)料，使發(fā)酵體系的還原糖濃度始終維持在0.6-0.8％之間，達(dá)到控制發(fā)酵過程細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率在權(quán)利要求1規(guī)定的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，可以對(duì)同時(shí)發(fā)生連續(xù)進(jìn)料與連續(xù)排料的發(fā)酵體系進(jìn)行液流稀釋率值的控制，達(dá)到控制發(fā)酵過程細(xì)胞菌絲生長(zhǎng)比速率在權(quán)利要求1規(guī)定的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，是使進(jìn)料速率恒等于排料速率，發(fā)酵液體積保持恒定，
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4所述的方法，可以在紅芝、紫芝、姬松茸類蕈菌(大型絲狀真菌)的液體深層發(fā)酵工藝中使用。
全文摘要
為了克服現(xiàn)今蕈菌類液體深層發(fā)酵工藝不完善、生產(chǎn)效率低的弊病。本發(fā)明針對(duì)蕈菌類絲狀細(xì)胞的生理生化、形態(tài)及代謝特征,首先采用控制蕈菌細(xì)胞生長(zhǎng)比速率的反饋控制補(bǔ)料培養(yǎng)、液流控制連續(xù)培養(yǎng)手段,用于藥用蕈菌靈芝類液體深層發(fā)酵,以優(yōu)化大型絲狀真菌液體深層培養(yǎng)的細(xì)胞生成濃度、細(xì)胞生成效率,從而提高發(fā)酵水平。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1327046SQ00109088
公開日2001年12月19日 申請(qǐng)日期2000年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月6日
發(fā)明者龔建華, 王義軍, 杜遵義 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所