專利名稱：殼聚糖替代外源植物激素培養(yǎng)生產(chǎn)植物離體細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物離體細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及新的用殼聚糖替代外源植物激素培養(yǎng)生產(chǎn)植物離體細(xì)胞的方法以及含殼聚糖的植物細(xì)胞培養(yǎng)基。
在一般情況下的植物細(xì)胞離體培養(yǎng)，都需要添加外源植物激素，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激動(dòng)素(KT)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)等。如果直接食用或人體外用這些培養(yǎng)細(xì)胞或未完全去除外源植物激素的生物活性物質(zhì)，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生副作用。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)在植物細(xì)胞培養(yǎng)中去除外源植物激素，同時(shí)又能加速植物細(xì)胞生長的方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種培養(yǎng)植物離體細(xì)胞的方法，該方法在加速植物細(xì)胞生長的同時(shí)又能使生產(chǎn)出的植物細(xì)胞僅含有極少或甚至不含有外源的植物激素。
本發(fā)明的另一目的是提供新的適用于本發(fā)明方法的植物離體細(xì)胞培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一目的是提供殼聚糖的新用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種培養(yǎng)植物離體細(xì)胞的方法，它包括在適合植物離體細(xì)胞生長的條件下，培養(yǎng)植物細(xì)胞，其中在培養(yǎng)基中不含有外源植物激素，且培養(yǎng)基中含有殼聚糖。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，殼聚糖的濃度為0.005g/L-0.5g/L；更佳地，殼聚糖的濃度為0.01g/L-0.25g/L。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種植物離體細(xì)胞培養(yǎng)基，其中在培養(yǎng)基中不含有外源植物激素，且培養(yǎng)基中含有殼聚糖。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種殼聚糖的用途，其中，所述的殼聚糖替代外源植物激素用于植物離體細(xì)胞的培養(yǎng)。
在附圖中，


圖1顯示了在無外源植物激素下，添加殼聚糖(低分子量)培養(yǎng)人參細(xì)胞28天的情況。從左至右，分別為-H8(去除外源植物激素后第8次繼代培養(yǎng))；0.1×10-3克/升CL；0.5×10-3克/升CL；1.0×10-3克/升CL；2.0×10-3克/升CL；4.0×10-3克/升CL。
圖2顯示了在無外源植物激素下，添加殼聚糖培養(yǎng)人參細(xì)胞56天的情況。從左至右，分別為-H(去除外源植物激素培養(yǎng))；0.1×10-3克/升CH；0.5×10-3克/升CH；1.0×10-3克/升CH；2.0×10-3克/升CH；4.0×10-3克/升CH。
圖3顯示了在無外源植物激素下，添加殼聚糖培養(yǎng)人參細(xì)胞40天的情況。從左至右，分別為-H(CK對(duì)照)；0.1×10-3克/升CL；0.5×10-3克/升CL；1.0×10-3克/升CL；0.5×10-3克/升CH。
圖4顯示了在無外源植物激素下，添加殼聚糖培養(yǎng)人參細(xì)胞20天的情況。從左至右，分別為對(duì)照；0.01×10-3克/升CL；0.01×10-3克/升CH；0.005×10-3克/升CL；0.005×10-3克/升CH。
圖5顯示了在無外源植物激素下，添加殼聚糖培養(yǎng)人參細(xì)胞18天的情況。從左至右，分別為-H10(去除外源植物激素后第10次繼代培養(yǎng))；0.01×10-3克/升CL；0.02×10-3克/升CL；0.01×10-3克/升CH；0.02×10-3克/升CH；1.0×10-3克/升CH。
圖6顯示了在無外源植物激素下，添加殼聚糖懸浮培養(yǎng)人參細(xì)胞46天的情況。從左至右，分別為0.5×10-3克/升CH；0.5×10-3克/升CL；-H。
圖7顯示了在無外源植物激素下，添加殼聚糖懸浮培養(yǎng)人參細(xì)胞56天的情況。從左至右，分別為0.5×10-3克/升CH；0.5×10-3克/升CH；0.5×10-3克/升CL；0.5×10-3克/升CL。
本發(fā)明基于本發(fā)明人在篩選促進(jìn)植物細(xì)胞生長的物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，即殼聚糖具有明顯加快植物細(xì)胞生長速度的作用。在此發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
如本文所用，“外源植物激素”指不是培養(yǎng)中的植物細(xì)胞自身產(chǎn)生的、促進(jìn)植物細(xì)胞生長的激素物質(zhì)。常見的外源植物激素包括(但并不限于)2，4-D、KT、NAA、IAA。
如本文所用，“殼聚糖”是脫去分子中乙?；募讱に?。而甲殼素是由2-乙酰胺-2-脫氧葡萄糖單體通過β-(1，4)糖苷聯(lián)結(jié)而成的直鏈多糖[胡玉文，吳姣蓮，1994，植物生理學(xué)通訊，30(4)294-296]。
適用于本發(fā)明的殼聚糖沒有任何限制，它可以是各種規(guī)格的殼聚糖，例如分子量較低的殼聚糖(如103道爾頓級(jí)的殼聚糖(簡(jiǎn)稱為“CL”))和分子量較高的殼聚糖(如105道爾頓級(jí)的殼聚糖(簡(jiǎn)稱為“CH”))。通常，殼聚糖的均分子量為1×103-1×106道爾頓或更高，較佳地為1×103-5×105道爾頓。
在本發(fā)明中，殼聚糖的使用濃度范圍通常為0.001g/L～1g/L，較佳地為0.005g/L～0.5g/L，更佳地為0.01g/L～0.25g/L。
適用于本發(fā)明的植物離體細(xì)胞沒有任何特別限制，它包括各種植物細(xì)胞。例如合適的植物離體細(xì)胞包括(但并不限于)人參、西洋參、紫草、鐵皮石斛、番紅花、甜菊。較佳地，所述的植物細(xì)胞選自人參、西洋參、紫草、鐵皮石斛、番紅花、甜菊。
適用于本發(fā)明的植物培養(yǎng)基包括任何植物細(xì)胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基例子包括(但并不限于)67-V培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、AA培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、CPW培養(yǎng)基、KM8P培養(yǎng)基、KPP(Kao)培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、NN培養(yǎng)基、NT培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基。
通常，植物培養(yǎng)基包括的營養(yǎng)成分包括氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵、微量元素和維生素等，另外還要根據(jù)需要，添加不同的植物激素。然而，本發(fā)明的培養(yǎng)基中不含有外源植物激素，或者只含有極低濃度(如濃度為常規(guī)有效濃度的約25％或更低，例如以激動(dòng)素為例，濃度小于0.05毫克/升，較佳地低于0.02毫克/升；以2，4-D為例，濃度小于0.5毫克/升，較佳地低于0.2毫克/升)的外源植物激素。
利用本發(fā)明，不僅可以顯著地減少或消除外源植物激素的使用，而且同樣可以實(shí)現(xiàn)促進(jìn)植物的生長。
此外，殼聚糖本身又是一種保健品。具有多種功能免疫調(diào)節(jié)作用，抑制腫瘤作用，調(diào)節(jié)血脂，抗菌、保濕、透氣、促進(jìn)組織再生作用，是目前已知的唯一帶陽離子的動(dòng)物性纖維。殼聚糖還具有治療頑固性皮膚病的作用。因此用它來替代外源植物激素，不僅促進(jìn)了植物細(xì)胞生長，而且沒有副作用，還具有附加的治療、營養(yǎng)、保健、美容的作用。
在經(jīng)濟(jì)植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往需要利用寡聚糖類的激發(fā)子來提高細(xì)胞合成生物活性物質(zhì)的能力。而殼聚糖可來源于真菌、昆蟲、水生生物等。在真菌、昆蟲侵染和食用植物時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生抗性反應(yīng)。而產(chǎn)生這種抗性反應(yīng)的結(jié)果往往就是植物體內(nèi)的生物活性物質(zhì)的提高。因此在利用殼聚糖促進(jìn)植物細(xì)胞生長的同時(shí)，往往還可以同時(shí)提高培養(yǎng)植物細(xì)胞的生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量。
在另一方面，植物經(jīng)殼聚糖處理后，往往它們的殼多糖酶(幾丁質(zhì)酶)會(huì)提高。這就有利于降解加入培養(yǎng)基中的高分子量的殼聚糖。因?yàn)闅ぞ厶堑木肿恿颗c它的保健功效息息相關(guān)。實(shí)現(xiàn)高分子殼聚糖體外降解，使均分子量適當(dāng)降低來提高殼聚糖的吸收和作用效果，是問題的關(guān)鍵。通常采用的是化學(xué)的方法或微生物降解的方法。在本發(fā)明方法中，利用在培養(yǎng)具有高效營養(yǎng)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)植物細(xì)胞的同時(shí)，可提高殼聚糖的功效，這是本發(fā)明的一大優(yōu)點(diǎn)。即利用殼聚糖替代外源植物激素促進(jìn)培養(yǎng)植物細(xì)胞生長的系統(tǒng)，又成了同時(shí)降解殼聚糖的生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
因此，在植物細(xì)胞培養(yǎng)基中加入殼聚糖，不僅可促進(jìn)植物細(xì)胞生長，又可進(jìn)一步提高生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量，還可利用植物細(xì)胞降解高分子量殼聚糖從而生成低分子量的殼聚糖。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1用殼聚糖替代外源植物激素培養(yǎng)人參植物離體細(xì)胞1.1材料培養(yǎng)人參(Panax ginseng C.A.Meyer)愈傷組織細(xì)胞，培養(yǎng)在用0.8％瓊脂固化的67-V固體培養(yǎng)基上(Veliky和Martin，1970，Can JMicrobiol，16223～226)，并在培養(yǎng)基中附加CoCl2和ZnSO4各2.5mg/L的[李新蘭和朱蔚華，1993，中藥材，16(6)3～4]，25℃暗培養(yǎng)。人參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)在67-V液體培養(yǎng)基中，25℃，100rpm的恒溫振蕩器中進(jìn)行暗培養(yǎng)。人參細(xì)胞均28天轉(zhuǎn)接一次。
1.2人參皂苷提取與測(cè)定稱取人參細(xì)胞，以無水乙醇研磨提取，再以水飽和的正丁醇萃取，最后用香莢醛-冰乙酸法進(jìn)行比色測(cè)定，并以人參二醇為標(biāo)準(zhǔn)樣品[王慕鄒等，1979，藥學(xué)學(xué)報(bào)，14(5)309～315；章觀德等，1980，藥學(xué)學(xué)報(bào)，15(3)175-180]。
1.3去除外源植物激素的人參細(xì)胞培養(yǎng)從培養(yǎng)基中含有2，4-D、NAA、IAA和KT的原人參細(xì)胞系出發(fā)，開始去除外源植物激素培養(yǎng)人參細(xì)胞的工作。采用篩選細(xì)胞、馴化和選擇非植物激素類的物質(zhì)來獲得不加外源植物激素培養(yǎng)并能快速生長的人參細(xì)胞。在此過程中發(fā)現(xiàn)殼聚糖具有獨(dú)特的效果。
1.4殼聚糖實(shí)驗(yàn)用于本實(shí)施例的殼聚糖有(1)均分子量在103D級(jí)的分子量較低的殼聚糖(CL)和(2)均分子量在105D級(jí)的分子量較高的殼聚糖(CH)。
首先在去除了激素的人參細(xì)胞培養(yǎng)基(67-V培養(yǎng)基)中加入了濃度從0.1-4.0g/L的殼聚糖CL和CH。
結(jié)果如
圖1-3所示。
結(jié)果表明，在殼聚糖濃度較高的情況下，比如濃度達(dá)2.0和4.0g/L時(shí)對(duì)細(xì)胞的生長是不利的，這可能是由于高濃度殼聚糖影響了細(xì)胞吸收培養(yǎng)基中的養(yǎng)分(
圖1和2)。而在殼聚糖濃度較低時(shí)，比如0.1-1.0g/L時(shí)有改善人參細(xì)胞生長狀況的現(xiàn)象(
圖1、2和3)。
實(shí)施例2殼聚糖的使用濃度為了確定最佳的殼聚糖使用濃度。在本實(shí)施例中進(jìn)一步降低了殼聚糖的使用濃度。其中CH和CL的用量分別為0.01和0.005g/L。
結(jié)果如圖4和5所示。結(jié)果表明，在CL和CH濃度低至0.01g/L和0.005g/L時(shí)，殼聚糖仍可以顯著的促進(jìn)細(xì)胞的生長。
對(duì)人參細(xì)胞鮮重的測(cè)定也證實(shí)了這一結(jié)果(表1)。
表1.比較培養(yǎng)23天人參細(xì)胞的鮮重
對(duì)細(xì)胞中人參皂苷含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，加入適量殼聚糖進(jìn)行培養(yǎng)的人參細(xì)胞中，人參皂苷的含量增高了約30％(表2)。這表明，人參細(xì)胞中的活性物質(zhì)含量增加了。
表2.比較培養(yǎng)23天人參細(xì)胞中皂苷含量
實(shí)施例3殼聚糖分子量高低對(duì)培養(yǎng)的影響在該實(shí)施例中，在液體培養(yǎng)基(67-V)中分別加入0.01g/L的CL和CH，以及0.5g/L的CL和CH。
結(jié)果如圖6和7所示。結(jié)果表明，在液體培養(yǎng)基中分別加入0.01g/L的CL和CH人參細(xì)胞能夠良好的生長。在分別加入0.5g/L的CL和CH進(jìn)行人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，出現(xiàn)了不同的結(jié)果。在第一個(gè)月中加入CL的培養(yǎng)基中人參細(xì)胞生長良好，而加入CH的培養(yǎng)基中人參細(xì)胞生長受到抑制。然而在經(jīng)2個(gè)月的培養(yǎng)后，人參細(xì)胞就又可以生長了。這可能是人參細(xì)胞分解了高分子的殼聚糖后，又重新開始生長(圖6和7)。在加入殼聚糖后懸浮培養(yǎng)的人參細(xì)胞中人參皂苷的含量更高(表3)。
表3比較懸浮培養(yǎng)1.5月人參細(xì)胞中皂苷含量
實(shí)施例4含有殼聚糖以替換外源植物激素的培養(yǎng)基按常規(guī)配方配制含有殼聚糖以替換外源植物激素的培養(yǎng)基67-V培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、AA培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、CPW培養(yǎng)基、KM8P培養(yǎng)基、KPP(Kao)培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、NN培養(yǎng)基、NT培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基，不同點(diǎn)僅在于殼聚糖的濃度為0.005g/L，0.05g/L，0.5g/L，而且這些培養(yǎng)基中不含有其他任何外源植物激素。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些培養(yǎng)基同樣可滿足植物細(xì)胞生長的需要。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)植物離體細(xì)胞的方法，它包括在適合植物離體細(xì)胞生長的條件下，培養(yǎng)植物細(xì)胞，其特征在于，在培養(yǎng)基中不含有外源植物激素，且培養(yǎng)基中含有殼聚糖。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，殼聚糖的濃度為0.005g/L-0.5g/L。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，殼聚糖的濃度為0.01g/L-0.25g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物離體細(xì)胞是選自下組的植物細(xì)胞人參、西洋參、紫草、鐵皮石斛、番紅花、甜菊。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的殼聚糖的均分子量為1×103-1×106道爾頓。
6.一種植物離體細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，在培養(yǎng)基中不含有外源植物激素，且培養(yǎng)基中含有殼聚糖。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，殼聚糖的濃度為0.005g/L-0.5g/L。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的殼聚糖的均分子量為1×103-1×106道爾頓。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的外源植物激素選自下組2，4-二氯苯氧乙酸、激動(dòng)素、萘乙酸、吲哚乙酸。
10.一種殼聚糖的用途，其特征在于，所述的殼聚糖替代外源植物激素用于植物離體細(xì)胞的培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)植物離體細(xì)胞的方法,它包括在適合植物離體細(xì)胞生長的條件下,培養(yǎng)植物細(xì)胞,其中在培養(yǎng)基中不含有外源植物激素,且培養(yǎng)基中含有殼聚糖。本發(fā)明還公開了用殼聚糖替換外源植物激素的培養(yǎng)基。用本發(fā)明培養(yǎng)植物細(xì)胞,不僅可促進(jìn)植物細(xì)胞生長,又可進(jìn)一步提高生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量,還可利用植物細(xì)胞降解高分子量殼聚糖從而生成低分子量的殼聚糖。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1347984SQ0012563
公開日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2000年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月10日
發(fā)明者蔡偉明 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海植物生理研究所