專利名稱：一種用于在里氏木霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其基因工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于在里氏木霉(Trichodermareesei) 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其基因工程菌。
背景技術(shù)：
里氏木霉是在二戰(zhàn)時期從所羅門群島的棉制油布中分離得到的一種嗜溫腐生性絲狀真菌，具有良好的降解纖維素材料的能力。由于該菌由ReeseE. T.博士篩選鑒定，因此被命名為iTrichoderma reesei。作為工業(yè)菌株，Τ. reesei能夠生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶等，其中一些里氏木霉突變株的胞外酶蛋白產(chǎn)量可達(dá)60g/L， 而最主要的纖維素酶CBHI (cellobiohydrolase I，纖維二糖水解酶I)，可以達(dá)蛋白分泌總量的50% (約30g/L)。里氏木霉作為工業(yè)生產(chǎn)菌株生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶已有多年的歷史，這些酶類被廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、制漿等工業(yè)領(lǐng)域。除具有極好的合成和分泌蛋白的能力以外，T. reesei還具有真核的蛋白分泌機(jī)制和與哺乳動物系統(tǒng)相似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾、加工性能，如高甘露糖型和N-糖基化。由于其適于蛋白生產(chǎn)的諸多優(yōu)點(diǎn)，而且對人類沒有毒性，里氏木霉也已成為相關(guān)研究人員開展真菌細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)和生理生化研究的重要生物材料。美國能源部(NOE)資助支持了里氏木霉基因組的測序工作，目前全基因組序列已經(jīng)完成并公布。里氏木霉全基因組測序的完成為利用功能基因組學(xué)方法研究具有重要生物學(xué)意義的功能基因奠定了基礎(chǔ)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA將外源基因轉(zhuǎn)移到真菌基因組中的方法。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化是近年來發(fā)展的一種新方法，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比，該方法操作簡便，可導(dǎo)入大片段的DNA，轉(zhuǎn)化效率高，導(dǎo)入基因大多是單拷貝，表達(dá)效果好，穩(wěn)定遺傳?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為目前真菌分子生物學(xué)研究中快速發(fā)展的轉(zhuǎn)化方法，成為真菌系統(tǒng)突變分析的有效工具。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對外源蛋白表達(dá)量低，分離純化困難的不足，提供一種操作簡便快捷的用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其應(yīng)用和所獲得的里氏木霉基因工程菌，可高效分泌表達(dá)來源于動物、植物和真菌等的異源基因。本發(fā)明的第一方面提供一種用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備，其中，所述的表達(dá)設(shè)備從5’至3’依次包括以下元件(1)控制外源基因在里氏木霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子；( 控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表達(dá)的信號肽的編碼序列；C3)多克隆位點(diǎn)；(4)控制外源基因在里氏木霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子。本發(fā)明中，所述的啟動子是能夠控制外源基因在里氏木霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子，較佳的為里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶I啟動子(p。bhI)，更佳的啟動子的序列是序列表中 SEQ ID NO 18 所示。本發(fā)明中，所述的信號肽可以是本領(lǐng)域中能夠控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表達(dá)的任何信號肽(分泌肽)，較佳的信號肽的編碼序列為序列表中SEQ ID N0:1所示。本發(fā)明中，所述的多克隆位點(diǎn)可以是本領(lǐng)域各種常規(guī)的多克隆位點(diǎn)，較佳的多克隆位點(diǎn)序列是序列表中SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明中，所述的終止子是能夠控制外源基因在里氏木霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子 (T。bhI)，較佳的是里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶I終止子，更佳的終止子的序列是序列表中SEQ ID NO 19所示。較佳的，所述的表達(dá)設(shè)備還包括以下元件( 篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒，其位于元件(1)啟動子的上游或元件(4)終止子的下游。本發(fā)明中，所述的篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒能夠在里氏木霉中表達(dá)各種本領(lǐng)域的常規(guī)篩選標(biāo)記，較佳的，所述的篩選標(biāo)記是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、慶大霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶、或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，較佳的篩選標(biāo)記是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其基因序列較佳的是GeneBank的登錄號為Z32698. 1的第1437位位至第4057位所示。較佳的，所述的在里氏木霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備還進(jìn)一步包括外源蛋白的編碼序列，其位于第⑶元件多克隆位點(diǎn)之中、之前或之后。所述的外源蛋白是指來源于里氏木霉以外的蛋白，包括動物、植物和真菌的蛋白。本發(fā)明中，較佳的，所述的表達(dá)設(shè)備還進(jìn)一步包括第二個多克隆位點(diǎn)，該第二個多克隆位點(diǎn)位于第(4)元件終止子和第( 元件篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒之間。本發(fā)明第二方面提供一種含有上述任何一種表達(dá)設(shè)備的載體，較佳的是根瘤農(nóng)桿菌二元載體，如 T-DNA 表達(dá)載體 pPZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、 或pPK2，但不限于這些載體，更佳的選自ρΡΖΡ201ΒΚ、ρΒΙ121、或pCAMBIA。本發(fā)明第三方面提供一種含有上述任何一種載體的宿主細(xì)胞，較佳的是根瘤農(nóng)桿菌 LBA4404、GV2260、C58C1、GV3100、A136、GV3101、GV3850、AGL-1、EHAlOl、EHA105，更佳的是根瘤農(nóng)桿菌GV3101。本發(fā)明第四方面提供一種表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，其基因組中含有任何一種如上所述的表達(dá)設(shè)備。所述的里氏木霉屬于里氏木霉種，較佳的是里氏木霉 Trichoderma reesei QM6a、QM9414、QM 9123、Sa28、QM 9136、NRRL 3653、ME-446、DB746、 4065MG4、4065MG5、NRRL 3652、或NRRL 11236，更佳的是里氏木霉 Trichoderma reesei RUT C30。本發(fā)明第五方面提供一種該表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌的制備方法包括，將上述含有外源蛋白基因的表達(dá)設(shè)備的根瘤農(nóng)桿菌二元載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，將所得的根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子和里氏木霉接合，挑選基因組中整合有外源蛋白基因的表達(dá)設(shè)備的接合子，即為表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌。該里氏木霉基因工程菌可高效分泌表達(dá)來源于動物、植物和真菌等的異源基因。本發(fā)明第六方面提供一種生產(chǎn)蛋白的方法，包括培養(yǎng)所述的表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，從培養(yǎng)物中獲得該外源蛋白。本發(fā)明的里氏木霉基因工程菌可應(yīng)用于制備工業(yè)酶制劑、飼料添加劑和蛋白質(zhì)藥物。所述酶制劑為中性纖維素內(nèi)切酶、纖維二糖酶、β葡萄糖苷酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶。
本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1、本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)設(shè)備在一環(huán)化質(zhì)粒上，易于保存和DNA操作。2、本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)設(shè)備利用農(nóng)桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移技術(shù)，可提高轉(zhuǎn)化效率，縮短操作時間和工作量。3、本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)設(shè)備具有優(yōu)化的分泌表達(dá)能力，適合大多數(shù)異源基因的分泌表達(dá)。4、本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)設(shè)備的多克隆位點(diǎn)中含有稀有接口，兼容絕大多數(shù)異源基因的連接，節(jié)約操作時間提高工作效率。5、本發(fā)明的基因工程菌可以作為纖維素酶誘導(dǎo)劑篩選的靈敏指示劑。6、本發(fā)明的基因工程菌可高效表達(dá)中性纖維素酶，在造紙業(yè)和紡織業(yè)具有很重要的應(yīng)用。7、本發(fā)明提供的表達(dá)設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)來源于動物、植物和真菌的異源蛋白質(zhì)基因在絲狀多細(xì)胞真核微生物里氏木霉中的高效分泌表達(dá)。由于里氏木霉培養(yǎng)條件粗放，適用于固體培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵；里氏木霉本身沒有毒性，在產(chǎn)酶條件下不會產(chǎn)生真菌毒素和抗生素，符合國際食品安全認(rèn)證；里氏木霉產(chǎn)生的胞外蛋白質(zhì)易于分離純化，成本低廉。因此本發(fā)明可以為洗滌、紡織、飼料、食品、造紙、醫(yī)藥等酶制劑行業(yè)提供基因工程生產(chǎn)菌株，提高酶制劑的生產(chǎn)效率降低生產(chǎn)成本。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1為里氏木霉表達(dá)設(shè)備TOF的物理圖譜。Pcbh I :cbh I啟動子；leader 分泌肽；MCS 多克隆酶切位點(diǎn)；Tcbh I :cbh I終止子；Hgy Box 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因篩選標(biāo)
τ5 jB. O圖2為里氏木霉表達(dá)載體pTO32F00的構(gòu)建圖。。圖3為含紅色熒光蛋白的重組表達(dá)載體PTO32F01的構(gòu)建圖。圖4為含中性纖維素內(nèi)切酶Wgl的重組表達(dá)載體pTO32F02的構(gòu)建圖。圖5為含中性纖維素內(nèi)切酶Egl3的重組表達(dá)載體pTO32F03的構(gòu)建圖。圖6為紅色熒光蛋白在里氏木霉中的表達(dá)。A.誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌絲在普通光源下觀察；B.誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌絲在紅色熒光光源下觀察。圖7為不同纖維素酶誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)紅色熒光蛋白胞外分泌表達(dá)。1.乳糖；2.纖維二糖；3. CMC ；4.微晶纖維素；5.濾紙纖維。圖8為里氏木霉中的中性纖維素酶酶活。A.原始里氏木霉；B. FGl ；C. FG2.
具體實(shí)施例方式一、里氏木霉異源表達(dá)設(shè)備本發(fā)明提供了一種里氏木霉異源表達(dá)設(shè)備。該表達(dá)設(shè)備通過農(nóng)桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移里氏木霉細(xì)胞。宿主菌屬于里氏木霉種，較佳的是里氏木霉iTrichodermareesei RUT C30。被表達(dá)的基因是與里氏木霉異源的任何外源基因。
本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)設(shè)備的制備方法(1)通過PCR擴(kuò)增，分別得到里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶I啟動子 (Pcbhl)、外切葡聚糖纖維二糖水解酶I終止子(T。bhI)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因篩選標(biāo)記盒各自DNA序列。(2)將啟動子(P。bhI)、分泌肽、多克隆位點(diǎn)、終止子(T。bhI)、潮霉素B篩選標(biāo)記盒依次連接到表達(dá)載體中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體1，即PWE32F00。這里的表達(dá)載體主要起大量拷貝本表達(dá)設(shè)備和提供農(nóng)桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的作用，所以可以選擇任何一種農(nóng)桿菌二元載體，如 PZP100、PPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI 121、pCAMBIA、pPK2，但不限于這些載體。(3)將外源目的基因插入到上述表達(dá)載體1中，使外源基因位于分泌肽和T。bhI之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒2，即pWE32F01、pWE32F02和pWE32F03。上述步驟O)中，分泌肽和多克隆位點(diǎn)為人工合成；將啟動子、分泌肽、多克隆位點(diǎn)、終止子和篩選標(biāo)記連接，可用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法將各個元件連入表達(dá)載體，所述的限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接都是本領(lǐng)域常規(guī)做法。上述步驟C3)中，將外源基因插入到上述表達(dá)載體1中，可用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法將外源基因連入表達(dá)載體1中，所述的限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接都是本領(lǐng)域常規(guī)做法。二、里氏木霉基因工程菌本發(fā)明提供了一種里氏木霉基因工程菌，該基因工程菌是將本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備通過農(nóng)桿菌接合轉(zhuǎn)移入里氏木霉細(xì)胞，培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子制備而得，具體制備步驟如下(1)將本發(fā)明的含有表達(dá)設(shè)備的載體電轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；再利用接合轉(zhuǎn)移機(jī)制轉(zhuǎn)化里氏木霉細(xì)胞。(2)將上述轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞進(jìn)行篩選、鑒定，得到表達(dá)紅色熒光蛋白的重組里氏木霉菌株，和高效表達(dá)中性纖維素內(nèi)切酶的重組里氏木霉菌株。下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，PDA培養(yǎng)基配方如下馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，自來水lOOOmL，自然pH。Luria Bertani (LB)培養(yǎng)基的配方如下蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g。馬丁氏培養(yǎng)基的配方如下PePtonelg, YE 0. 3g，乳糖 20g，(NH4)2S041. 4g, Urea 0. 3g, KH2P042. Og, CaCl2O. 34g, MgSO4 · 7H20 0. 3g, Mandels 微量元素液 lmL。Mandels 微量元素液(1000X)FeSO4 · 7H20 5g, MnSO4 · H2O 1. 6g, ZnSO4 · 7H20 1. 4g, CoCl · 6H202g,水定容至 1L。結(jié)合轉(zhuǎn)移用的培養(yǎng)基a. MM salts (IL)KH2P043. 625g, K2HP045. 125g, NaCl 0. 375g, MgSO4 · 7H20 1. 250g, CaCl2 · 2H20 0. 165g, FeSO4 · 7H20 0. 0062g, (NH4)2SO4L 250g.b. IM MES
6
21. 32g定容到IOOmL, pH5. 3 (5Μ KOH調(diào)節(jié))需要過膜除菌。c. 5Μ KOH7. 013g 定容到 25mL。d. M-IOOTrace (0. 5L)H3B0330mg, MnCl2 · 4H20 70mg, ZnCl2200mg, Na2MoO4 · 2H20 20mg, FeCl3 · 6H20 50mg, GuSO4 · 5H20 200mg.e. M-IOOSalt (IL)KH2P0416g, Na2S044g, KCl 8g, MgSO4 · 7H20 2g, CaCl2Ig, M-IOOTrace 8mL.f. Induction MediumMM salts 80mL,葡萄糖 0. 36g，甘油 1. 26g, 24mLx8 分裝 8 瓶，水定容至 192mL，接種時每瓶加lmL(lM MES，過膜除菌)調(diào)節(jié)pH值，起到緩沖的作用。g. Induction Medium PlatesMM salts 160mL,葡萄糖 0. 36g,甘油 2. 52g,水定容至 384mL，96mLx4 分裝 4 瓶，每瓶中加入1.5g瓊脂，115°C，20min滅菌。倒平板前每瓶加入^ilLlM MES (過膜除菌)。h. M-IOOplates葡萄糖10g，KN033g，M-IOOSalt solution 62. 5mL，水定容至 1L，IOOmLxlO 瓶分裝， 每瓶加入0. 75g瓊脂。115°C，20min滅菌。i.乙酰丁香酮(AS)0. 01962 使用 DMSO 溶解定容至 0. 5mL。DNA 提取液的配方如下Tris-HCl (pH7. 5)0. 2mol/L，NaCl 0. 5mol/L, EDTAO. 01mol/L, SDS 1%。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中使用的里氏木霉是Trichoderma reesei RUTC30 (購自 ATCC)。質(zhì)粒提取試劑盒購自hvitrogen (USA)，膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。實(shí)施例1包含本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)設(shè)備的表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1、里氏木霉基因組的提取及檢驗(yàn)將里氏木霉Trichoderma reesei RUT C30接種于PDA培養(yǎng)基上，于沘°C下恒溫培養(yǎng)7天至孢子成熟。制備適量孢子懸液接種于馬丁氏培養(yǎng)基液體種子培養(yǎng)基中，于 300C ISOrpm條件下培養(yǎng)2天至菌絲體濃度達(dá)到4 5g/L用于提取基因組。本實(shí)施例采用本領(lǐng)域常用的真菌快速提取基因組法提取里氏木霉的基因組DNA， 提取完畢后使用瓊脂糖凝膠電泳電泳檢驗(yàn)所提取的基因組DNA。1. 2、里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶I啟動子(P。bhI)的分離根據(jù)GeneBank上發(fā)布的cbhl啟動子的序列，以上述提取的里氏木霉基因組DNA 為模板，以上游引物和下游引物進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增分離P。bhI。上游引物Pl，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，其中含有EcoRV酶切位點(diǎn)。下游引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，其中含有McII酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系參照試劑盒說明書，PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 1490bp，該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和DNA序列分析，結(jié)果表明所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。
1. 3、外切葡聚糖纖維二糖水解酶I終止子(T。bhI)的分離根據(jù)GeneBank上發(fā)布的cbh I終止子的序列，以上述提取的里氏木霉基因組DNA 為模板，以上游引物和下游引物進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增分離T。bhI。上游引物P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示，其中含有MuI酶切位點(diǎn)。下游引物P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示，其中含有HpaI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系參照試劑盒說明書，PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 IlOObp,該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和DNA序列分析，結(jié)果表明所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。1. 4、分泌肽leader和多克隆位點(diǎn)MCS合成利用DNA基因合成技術(shù)，人工合成分泌肽leader，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。利用DNA基因合成技術(shù)，人工合成多克隆位點(diǎn)MCS，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。 利用DNA基因合成技術(shù)，人工合成多克隆位點(diǎn)MCS，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。1. 5、潮霉素B篩選標(biāo)記盒的獲得以質(zhì)粒pAN7_l(NCBI gi :475166)為模板，使用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶篩選標(biāo)記盒。上游引物P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示，其中含有McI酶切位點(diǎn)；下游引物P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示，其中含有^CbaI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系參照試劑盒說明書，PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為264;3bp，該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和DNA序列分析，結(jié)果與質(zhì)粒pAN7_l的 GeneBank中保留序列1 一致，所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。1. 6、里氏木霉pTO32F00表達(dá)載體的構(gòu)建用兩種限制性內(nèi)切酶的組合體系(EcoRV和SacII，SacII和PacI，PacI和StuI， StuI和Hpal，HpaI和SacI，SacI和Xbal，及EcoRV和XbaI)分別雙酶切上述實(shí)例1. 2、 1.3、1.4、1.5得到的？。_、T。bhI、分泌肽、多克隆位點(diǎn)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因篩選標(biāo)記盒片段和農(nóng)桿菌二元載體pPZP201BK(取自新澤西州立大學(xué)的瓦克斯曼研究所的Peter Hajdukiewicz)。再用DNA連接酶將上述多個雙酶切片段相連。DNA連接反應(yīng)完成將連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)Dffia(天根公司)，然后涂布含有卡那霉素(50ug/ml)的LB平板。 挑出單克隆，接入含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基，菌液用plasmidextraction kit (Omega, USA)提質(zhì)粒。測序驗(yàn)證出陽性轉(zhuǎn)化子，獲得表達(dá)載體PWE32F00，即得到用于表達(dá)外源基因的里氏木霉表達(dá)載體。表達(dá)載體PWE32F00如圖2所示。插入序列結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。插入序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :20所示，其中第1-1490位是 Pcbhl，第1485-1565位是分泌肽，第1558-1578位是多克隆位點(diǎn)，第1573-2706位是Tebhl，第 2701-2723位是多克隆位點(diǎn)，第2718-5372位是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因篩選標(biāo)記盒。實(shí)施例2利用里氏木霉表達(dá)設(shè)備表達(dá)紅色熒光蛋白2. 1、紅色熒光蛋白基因Red的獲得以質(zhì)粒pDSRed2-Nl (Clontech公司，貨號63M06)為模板，使用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了 697bp的紅色熒光蛋白Red基因。上游引物P7，其核苷酸序列如SEQ ID NO 10所示，其中含有I^cI酶切位點(diǎn)；下游引物P8，其核苷酸序列如SEQ ID NO :11所示，其中含有EcoRV酶切位點(diǎn)。
擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為697bp，長度及序列分析的結(jié)果均與預(yù)期相符。2. 2、Red與表達(dá)設(shè)備的對接將上述擴(kuò)增產(chǎn)物(red基因)經(jīng)過I3acIjc0RV限制性酶切，使用T4連接酶連接到經(jīng)過I^acI，EcoRV限制性酶切的表達(dá)載體PWE32F00中，得到了含Pebhl-Red_T。bhI表達(dá)設(shè)備的重組載體PWE32F01 (如圖3所示)。將PWE32F01轉(zhuǎn)化DH5a(天根公司)，然后涂布含有卡那霉素(50ug/ml)的LB平板。挑出單克隆，接入含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基，菌液用plasmid extraction kit (Omega, USA)提質(zhì)粒。測序驗(yàn)證出陽性轉(zhuǎn)化子，獲得表達(dá)載體PWE32F01，即得到用于表達(dá)外源基因的里氏木霉表達(dá)載體PWE32F01 (表達(dá)載體如圖 3所示)。2. 3、pTO32F01電轉(zhuǎn)根瘤農(nóng)桿菌質(zhì)粒PWE32F01電轉(zhuǎn)根瘤農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞(購買于中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心)，涂布在含Gen+Kan的LB平板上，確保細(xì)胞濃度稀釋到全部根瘤農(nóng)桿菌均以單克隆形式出現(xiàn)。在30°C下培養(yǎng)48h。挑取單克隆的根瘤農(nóng)桿菌接種到加了 Gen+Kan 的LB培養(yǎng)基中，放在30°C，200rpm的搖床中培養(yǎng)Mh。使用引物對做菌落PCR，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。2. 4、根瘤農(nóng)桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移倒化(111(^丨011 Medium Plates平板，并將醋酸纖維素膜覆蓋在培養(yǎng)基的上面。將里氏木霉T.reesei RUT C30的孢子稀釋成合適的濃度。把上述步驟3電轉(zhuǎn)后的陽性根瘤農(nóng)桿菌和該里氏木霉孢子等體積混合，點(diǎn)到上述醋酸纖維素膜上。放在27°C下共培養(yǎng)4 后，把加了潮霉素和頭孢的M-100培養(yǎng)基倒在膜上，即為上層培養(yǎng)基。將平板放在30°C下培養(yǎng)。2. 5、轉(zhuǎn)化子的鑒定及目的基因的表達(dá)提取上述步驟4所得的陽性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，用引物P7(其核苷酸序列如SEQ ID NO 10所示)和P8 (其核苷酸序列如SEQ IDNO 11所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 結(jié)果顯示，抗性轉(zhuǎn)化子的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到大小約為697bp的red基因的特異帶，而用原始菌株T.reeseiRUT C30的基因組DNA為模板進(jìn)行同樣的PCR反應(yīng)，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。使用引物Pl (其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)和P4(其核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示)擴(kuò)增出3365bp的片段，對應(yīng)于表達(dá)設(shè)備P。bhI-Red_T。bhI的大小。將獲得的重組里氏木霉菌株接種于馬丁氏液體培養(yǎng)基中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng) 72h后，取發(fā)酵液點(diǎn)到載玻片上，放到熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光蛋白的激發(fā)光557nm，發(fā)射光579nm。結(jié)果如圖6所示，重組里氏木霉菌絲體在熒光顯微鏡下發(fā)出紅色熒光，而原始的里氏木霉菌絲體在熒光顯微鏡下沒有紅色熒光。2. 6、探究紅色熒光蛋白的表達(dá)與纖維素酶誘導(dǎo)劑的關(guān)系將步驟2. 4得到的重組里氏木霉基因工程菌的孢子接種到添加了 2%葡萄糖的馬丁氏液體培養(yǎng)基中，于30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)48h，菌體生長至生長旺盛期后，用沒有添加任何糖的馬丁氏液體培養(yǎng)基洗滌菌體3次，離心收集菌體用沒有添加任何糖的馬丁氏液體培養(yǎng)基復(fù)溶，然后以相同體積分裝到添加不同底物的誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(馬丁氏培養(yǎng)基)中， 在30°C，200rpm的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，定時取樣使用熒光酶標(biāo)儀測定在激發(fā)光535nm，發(fā)射光 595nm處的熒光吸收值，結(jié)果見圖7所示?？梢姡罴烟荚匆来问俏⒕Юw維素，濾紙纖維，CMC，乳糖，纖維二糖。實(shí)施例3利用本發(fā)明表達(dá)設(shè)備表達(dá)中性纖維素酶3. 1、中纖纖維素酶基因wgl、egl3的分離Wgl基因的分離wgl基因是Bicillus subtilis W168(ATCC)菌株中纖維素內(nèi)切酶，其最適pH值在中性，wgl基因的NCBI保存號為M16185. 1。以 Bicillus subtilis W168 菌株(ATCC 23857)的基因組 DNA 為模板，以 P9、P10 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到wgl基因。上游引物P9，其核苷酸序列如SEQ ID NO 12所示，其中含有I^cI酶切位點(diǎn)；下游引物P10，其核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示，其中含有MuI酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，其分子大小為1428bp，與預(yù)期結(jié)果相符合；經(jīng)DNA序列分析，其序列與GeneBank上發(fā)布的序列一致。egl3基因的分離egl3 基因?yàn)?Humicola grisea var. thermoidea 菌株中纖維素內(nèi)切酶，egl3 基因的NCBI保存號為AB003107. 1。以人工合成egl3基因(序列見NCBI :AB003107. 1)為模板，以Pll、P12引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到egl3基因。上游引物Pll，其核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示，其中含有I^cI酶切位點(diǎn)；下游引物P12，其核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示，其中含有MuI酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，其分子大小為867bp，與預(yù)期結(jié)果相符合；經(jīng)DNA序列分析，其序列與GeneBank上發(fā)布的序列一致。2、wgl、egl3與表達(dá)設(shè)備對接分別將上述所獲得的wgl、egl3基因經(jīng)I^cI和MuI酶切后與經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體PWE32F00連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，獲得含表達(dá)設(shè)備P。bhI_wgI-Tebhl和 PcbhI-egl3-TcbhI的重組質(zhì)粒，分別是質(zhì)粒pTO32F02、pffE32F03,如圖4、5所示。將重組質(zhì)粒中的表達(dá)設(shè)備進(jìn)行DNA測序分析，結(jié)果表明表達(dá)設(shè)備中各元素包括啟動子、目的基因以及終止子的結(jié)構(gòu)完全正確。3、電轉(zhuǎn)分別將質(zhì)粒pTO32F02、pffE32F03電轉(zhuǎn)根瘤農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含Gen+Kan 的LB平板上，確保細(xì)胞濃度稀釋到全部根瘤農(nóng)桿菌均以單克隆形式出現(xiàn)。在30°C下培養(yǎng) 48h。挑取單克隆的根瘤農(nóng)桿菌接種到加了適量Gen+Kan的LB培養(yǎng)基中，放在30°C，200rpm 的搖床中培養(yǎng)Mh。通過測序驗(yàn)證篩選陽性轉(zhuǎn)化子。4、結(jié)合轉(zhuǎn)移倒化(111(^丨011 Medium Plates平板，并將醋酸纖維素膜覆蓋在培養(yǎng)基的上面。將里氏木霉T.reesei RUT C30的孢子稀釋成合適的濃度。把上述步驟3電轉(zhuǎn)后的陽性根瘤農(nóng)桿菌和該里氏木霉孢子等體積混合，點(diǎn)到膜上。放在27°C下共培養(yǎng)4 后，把加了潮霉素 B和頭孢噻唑的M-100培養(yǎng)基倒在膜上，即為上層培養(yǎng)基。將平板放在30°C下培養(yǎng)。5、篩選及鑒定從上述步驟4所得的平板上挑取的單個菌落，即重組菌株，進(jìn)行基因型鑒定。以重組菌株的基因組DNA為模板，使用引物P9(其核苷酸序列如SEQID NO :12所示)和PlO (其核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示)擴(kuò)增出14^bp的片段，對應(yīng)于基因wgl的大小。使用引物Pl (其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示)和P4 (其核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示) 擴(kuò)增出4096bp的片段，對應(yīng)于表達(dá)設(shè)備大小P。bhI-wgl-T。bhI的大小，該重組菌株命名為陽1。以重組菌株的基因組DNA為模板，使用引物Pll (其核苷酸序列如SEQID N0:14所示)和P12(其核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示)擴(kuò)增出867bp的片段，對應(yīng)于基因egl3 的大小。使用引物Pl (其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)和P4 (其核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示)擴(kuò)增出3535bp的片段，對應(yīng)于表達(dá)設(shè)備大小P。bhI-egl3-T。bhI的大小，該重組菌株命名為TO2。6、重組菌株表達(dá)產(chǎn)物分析將在含潮霉素的PDA平板上生長良好的重組菌株rei、re2接種于含有2%葡萄糖的液體馬丁氏培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間后，按照合適的接種量轉(zhuǎn)接到含有2%乳糖的液體馬丁氏培養(yǎng)基中。培養(yǎng)2d后。取發(fā)酵液測中性纖維素內(nèi)切酶活。其中，酶活力單位定義為每毫升酶液每分鐘水解羧甲基纖維素鈉(CMC)產(chǎn)生1 μ g還原糖(以葡萄糖計)所需酶量定義為一個酶活力單位。結(jié)果見圖8，可見，中性纖維素酶wgl，egl3在里氏木霉菌株已經(jīng)表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備，其特征在于，所述的表達(dá)設(shè)備從5’至3’依次包括以下元件(1)控制外源基因在里氏木霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表達(dá)的信號肽的編碼序列；(3)多克隆位點(diǎn)；(4)控制外源基因在里氏木霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)設(shè)備，其特征在于，所述的啟動子是里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶I啟動子(P。bhI)；所述的終止子是里氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶I 終止子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)設(shè)備，其特征在于，所述的表達(dá)設(shè)備還包括以下元件 (5)篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒，(5)篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒，其位于元件⑴啟動子的上游或元件(4)終止子的下游。
4.如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的表達(dá)設(shè)備，其特征在于，所述的在里氏木霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備還進(jìn)一步包括外源蛋白的編碼序列，其位于第( 元件多克隆位點(diǎn)之中、之前或之后。
5.一種含有如權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述表達(dá)設(shè)備的載體。
6.一種含有如權(quán)利要求5所述載體的轉(zhuǎn)化子。
7.—種表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，其特征在于，其基因組中含有如權(quán)利要求4所述的表達(dá)設(shè)備。
8.—種如權(quán)利要求7所述的表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌的制備方法，其特征在于，包括將含有如權(quán)利要求5所述的表達(dá)設(shè)備的根瘤農(nóng)桿菌二元載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌， 將所得的根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子和里氏木霉接合，挑選基因組中整合有外源蛋白基因表達(dá)設(shè)備的接合子，即為表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌。
9.一種生產(chǎn)蛋白的方法，其特征在于，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求7所述的表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，從培養(yǎng)物中獲得外源蛋白。
10.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)外源蛋白的里氏木霉基因工程菌在制備工業(yè)酶制劑、飼料添加劑或蛋白質(zhì)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其基因工程菌。該表達(dá)設(shè)備從5’至3’依次包括以下元件(1)控制外源基因在里氏木霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表達(dá)的信號肽的編碼序列；(3)多克隆位點(diǎn)；(4)控制外源基因在里氏木霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子。將外源基因插入上述表達(dá)設(shè)備中，經(jīng)T-DNA二元載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，和里氏木霉接合，所得里氏木霉基因工程菌可高效分泌表達(dá)來源于動物、植物和真菌等的異源基因，從中獲得外源蛋白的大量生產(chǎn)。該里氏木霉培養(yǎng)條件粗放，適合固體培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，在產(chǎn)酶條件下不會產(chǎn)生真菌毒素和抗生素，產(chǎn)生的胞外蛋白質(zhì)易于分離純化，成本低廉。
文檔編號C12N1/21GK102268448SQ20111017781
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者呂丹丹, 王瑋, 魏東芝 申請人:華東理工大學(xué)