專利名稱：ESR基因部分序列及與豬的產(chǎn)仔性狀相關(guān)的ESR基因和FSH－Beta基因的多態(tài)檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及ESR基因部分序列及與豬的產(chǎn)仔性狀相關(guān)的ESR基因和FSH-Beta基因的多態(tài)檢測技術(shù)。
豬產(chǎn)仔數(shù)是一種數(shù)量性狀，豬產(chǎn)仔數(shù)微小的改良就可對養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟效益。有文獻報道，只要將豬產(chǎn)仔數(shù)提高1.0頭/胎，英國養(yǎng)豬業(yè)每年可獲得7億英鎊的額外利潤，而整個歐共體每年獲得的額外利潤將至少是20億英鎊，雖然我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化程度不高(大約為15％)，其額外利潤將在190億人民幣以上。
傳統(tǒng)的動物遺傳和育種理論認(rèn)為，重要經(jīng)濟性狀(絕大部分是數(shù)量性狀)是由許多微效的基因效應(yīng)可加的控制。盡管這個模型并不完全合理，但是過去的幾十年中通過表型選擇改良動物品種的確取得了豐碩成果，然而，今天在這一傳統(tǒng)理論和育種技術(shù)指導(dǎo)下，動物品種改良的遺傳進展非常緩慢，甚至是停滯不前，達到了所謂的“選擇高原”。對豬的產(chǎn)仔數(shù)的選擇更是如此，法國用了30多年的時間來改良這個性狀，結(jié)果毫無進展；丹麥用了50多年的時間才將每胎產(chǎn)仔數(shù)提高了1.0頭。這一方面與“選擇高原”現(xiàn)象有關(guān)，同時也與豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀遺傳力較低(約為0.1)有關(guān)，要使動物生產(chǎn)持續(xù)地發(fā)展，只有探索和應(yīng)用新的高技術(shù)。
在人類基因定位計劃的啟發(fā)和巨大成果的鼓舞下，畜禽基因定位計劃于90年代初開始實施。人類基因定位計劃的主要目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)與遺傳疾病有關(guān)的基因及基因治療的方法，而畜禽基因定位計劃的主要目標(biāo)卻是找到重要經(jīng)濟性狀(如產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)奶量、日增重、產(chǎn)蛋量、疾病抗性等)座位或與之連鎖的DNA標(biāo)記，并將其應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted Selection；MAS)來改良畜禽品種，提高動物生產(chǎn)效率。
1993年新西蘭的Montgomery.G在綿羊多產(chǎn)基因(FecB)的重大發(fā)現(xiàn)極大地鼓舞了這一領(lǐng)域的研究者去尋找控制豬繁殖性狀的主基因。美國Rothschild研究組1994年發(fā)現(xiàn)ESR是豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一，該座位在中國梅山豬合成系中可以控制1.5頭產(chǎn)仔數(shù)/胎和1頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎。經(jīng)過精細的定位研究，盡管ESR座位控制產(chǎn)仔數(shù)的遺傳效應(yīng)在大約克豬種群中有所下降，但卻證明了這種遺傳效應(yīng)的確是由ESR基因直接造成的。在中國二花臉雜交種群中，我們研究小組的工作不但證實了Rothschild等人的研究結(jié)果，同時還發(fā)現(xiàn)了另一個控制豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因座位FSH-Beta。這個基因座位可以控制豬產(chǎn)仔數(shù)2.0頭產(chǎn)仔數(shù)/胎和1.5頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎。
目前ESR(Estrogen Receptor)雌激素受體基因已定位于1p24--p25；線性連鎖圖譜為-SW552-[8.3cm]-SWR485-[3.2cm]-ESR-[2.9cm]-SOD2-[2.9cm]-SW137-[2.6cm]-SW64-[25.4cm]-S0008?？刂?.44-1.15頭/窩的產(chǎn)仔數(shù)。豬ESR基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)性狀的影響見表1表1豬ESR基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)性狀的影響
**，b，cMeans within a column without a common superscript differ(P＜0.01).*P＜0.05；**P＜0.01.(摘自Rothschild(1996))。
卵泡刺激素β亞基基因，卵泡刺激素受體基因(FSHβ，F(xiàn)S小時)也已完成了定位工作。FSHβ定位于2p16--p12；FS小時定位于3q22-q23。控制1.5-2.0頭/窩產(chǎn)仔數(shù)。豬FSHβ基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)性狀的影響見表2。
表2豬FSHβ基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)性狀的影響
*Ntestnumber；Dd/a；aadditive effect；ddominance effect.(Adapted from Li Ning，1998)。
ESR基因和FSH-beta基因在豬的產(chǎn)仔數(shù)方面的明顯效應(yīng)，使得人們有理由認(rèn)為在不同的品種不同的群體中這兩個基因的多態(tài)性可能與豬的產(chǎn)仔性能的差異有關(guān)。1987年Castagnoli報道了人的ESR位點的PvuII多態(tài)性，1991年Rothschild報道了豬ESR位點的PvuII的多態(tài)性。接著1994年Rothschild等人利用人的ESR的1.3Kb cDNA為探針對含有中國梅山豬血緣的多個豬種進行RFLPs分析，發(fā)現(xiàn)其中一種基因型可以顯著地增加1.5頭總產(chǎn)仔數(shù)/胎和1.0頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎，其顯性程度分別為1.31和0.43，反映出基因作用基本上是顯性模式。1996年Rothschild研究小組又將高產(chǎn)仔數(shù)的梅山豬所特有的3.7Kb條帶的基因稱作B基因，而相對應(yīng)的低產(chǎn)仔數(shù)品種含有的4.3Kb條帶的基因命名為A基因。1997年，李寧等以ESR基因為產(chǎn)仔數(shù)主基因的侯選基因，用人ESR基因的1.8Kb的cDNA為探針，對不同品種的豬的DNA進行了PvuII酶切的RFLPs多態(tài)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有四種不同的多態(tài)型，即在二花臉中有2.5Kb和4.0Kb的特異帶，梅山豬有2.5Kb、4.3Kb或2.8Kb、4.0Kb的特異帶；而大約克和大二豬在此位點帶型復(fù)雜，表現(xiàn)出太湖豬與歐洲豬的雜合型。
比較李寧與Rothschild所報道的PvuII酶切片段的差異，可能是因為使用的Marker與凝膠的濃度有差異，所造成的人為估算的差異。此外，李寧研究小組還在二花臉豬中檢測到2.5Kb的特異片段，與Rothschild在大約克中也發(fā)現(xiàn)有梅山豬的3.7Kb特異帶結(jié)果相一致，可將其解釋為大約克豬可能起源于十九世紀(jì)前輸入英國的中國豬種。
為了確定更多豬只的基因型，美國Iowa州立大學(xué)與PIC公司合作又發(fā)展了一種檢測ESR多態(tài)性的PCR-RFLPs測試方法。本室趙要風(fēng)、李寧等人也建立了FSH-Beta基因多態(tài)的PCR和PCR-RFLPs測試方法(趙要風(fēng)，1998)。本發(fā)明在前人工作的基礎(chǔ)上對ESR和FSH-β基因的多態(tài)分析的方法和程序進行了改進，使之更為簡便快速，多態(tài)信息含量大為提高，也大大降低了檢測成本。我們所測定的ESR基因的部分序列也為相關(guān)標(biāo)記的設(shè)計開發(fā)提供了必要的素材。
美國Iowa州立大學(xué)與PIC公司合作(1997年Short.TH等人)發(fā)展的檢測ESR多態(tài)性的PCR-RFLPs測試方法由于所用引物的位置和擴增片段的長度等原因，使得PCR產(chǎn)物經(jīng)PvuII酶切后形成的兩個片段的長度比較接近(一個為56bp另一個為65bp)，需要較高分辨率的瓊脂糖凝膠(4％)才能較好地將兩條帶分離開來，這樣檢測成本比較高，而且ESR多態(tài)和FSH-β多態(tài)都與豬的產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)，因此如能將兩個多態(tài)的檢測合并將大大提高檢測效率，降低成本，同時提高分析結(jié)果的多態(tài)信息含量。
本發(fā)明的目的之一是克隆測定了ESR基因的部分序列。
本發(fā)明的目的之二是依據(jù)所測定的ESR基因的部分序列重新設(shè)計引物，建立了一個新的檢測ESR基因多態(tài)性的PCR-RFLPs方法。
本發(fā)明的目的之三是提供了同時檢測ESR基因和FSH-Beta基因的多態(tài)的方法，該方法調(diào)整ESR基因PCR-RFLPs多態(tài)檢測所用引物的位置和序列，一方面降低ESR基因多態(tài)PCR-RFLPs檢測中所用瓊脂糖凝膠的濃度，從而降低該標(biāo)記單獨使用時的成本。另一方面將ESR基因的PCR-RFLPs多態(tài)和FSH-β基因的PCR多態(tài)檢測合并操作，從而進一步降低檢測成本，提高檢測效率。為豬的育種工作提供更為簡潔、快速有效且成本更低的遺傳標(biāo)記，我們所測定的ESR基因的部分序列可用于相關(guān)標(biāo)記的開發(fā)。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明以人的ESR基因全長cDNA(1.8kb)為探針以PvuII酶切豬的基因組DNA對豬的群體進行RFLPs分析(探針標(biāo)記及Southern雜交參見地高辛標(biāo)記雜交試劑合說明書進行)，找到在RFLPs分析圖譜中出現(xiàn)3.7kb帶的個體，將該個體的基因組DNA用進行RFLPs分析時所用的PvuII限制性內(nèi)切酶進行切割，電泳回收其3.0-4.0kb范圍內(nèi)的DNA，并將其克隆到pGEM-7zf(+)載體上，通過細菌原位雜交的方法篩選(探針為人的ESR基因全長cDNA序列，方法參考熒光標(biāo)記雜交試劑合說明書)獲得了三個陽性克隆。陽性克隆經(jīng)酶切鑒定正確后，選擇其中一個進行序列測定(用Dye-primer Sequencing Kit和ABI 377 DNA sequencer進行，方法參照試劑合和測序儀的使用說明)，得到了該片段的5′端和3′端部分序列。
據(jù)1997年Short，TH等人所發(fā)表的引物序列(引物I5′-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3′，引物II5′-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3′)，合成引物對不同豬的品種(二花臉豬、大白豬、長白豬香豬、杜洛克豬和雙肌臀豬)進行PCR-RFLPs分析。
PCR反應(yīng)體系2.5μl 10×Taq DNA聚合酶緩沖液(500mmol/LKCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明膠)，2μldNTPs(2.5mmol/L for each)，引物終濃度0.5μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng。終體積25μlPCR反應(yīng)條件94℃ 4分鐘60℃ 1分鐘70℃ 1分鐘一個循環(huán)，然后94℃1分鐘，60℃ 1分鐘，70℃ 1分鐘31個循環(huán)，最后72℃8分鐘4℃長時間保存。
酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件10μl PCR產(chǎn)物，加入0.5μl(10U)的PvuII限制性內(nèi)切酶，37℃消化過夜(5-12小時)。
用4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
確定擴增片段中包含PvuII切點的純合個體，然后以該個體的基因組DNA為模板以上述引物進行PCR擴增，并將PCR擴增產(chǎn)物克隆到pGEM-T-vector的載體上。經(jīng)序列測定得到該片段的核苷酸序列(測序方法同上)。我們所測定的這些序列可用于開發(fā)檢測ESR基因多態(tài)的遺傳標(biāo)記(如PCR-RFLPs標(biāo)記、RFLPs標(biāo)記等)，在GenBank中并未見到這些序列的報道。
對3.7kb和121bp兩片段的測序結(jié)果進行分析，表明PCR擴增區(qū)56bp的PvuII酶切片段位于3.7kb片段正向序列的起始部分，因此，依據(jù)3.7kb片段測序結(jié)果設(shè)計了一條反向引物(引物III5′-CAGTTGAGAGCAAATCAATGCTAAG-3′)，與前述檢測中所使用的引物對中的正向引物(引物I)相結(jié)合，用限制性內(nèi)切酶PvuII檢測ESR基因的PCR-RFLPs多態(tài)性。
PCR反應(yīng)體系2.5μl 10×Taq DNA聚合酶緩沖液(500mmol/LKCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明膠)，2μldNTPs(2.5mmol/L for each)，引物終濃度0.5μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng，終體積25μl。
PCR反應(yīng)條件94℃ 4分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘2個循環(huán)，然后94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘31個循環(huán)，最后72℃ 8分鐘，4℃長期保存。
酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件10μl PCR產(chǎn)物，加入0.5μl(10U)的PvuII限制性內(nèi)切酶，37℃消化過夜(5-12小時)。
用2.5-3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
用此方法檢測ESR基因的多態(tài)時可產(chǎn)生三種帶，長度分別為246bp(A單倍體型)和185bp、65bp(B單倍體型)而1997年Short，TH等人所發(fā)表的引物PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)PvuII酶切后產(chǎn)生另外三種不同長度的DNA片段即121bp(A單倍體型)和65bp、56bp(B單倍體型)，兩者相比，我們所發(fā)明的方法中使用較低濃度的瓊脂糖凝膠(2.5-3％)就能將三個片段很好的分開，而1997年Short，TH等人的方法中需要使用4％的瓊脂糖凝膠才能將三個DNA片段分開，因而我們的方法使ESR基因的PCR-RFLPs的檢測得到了改進，降低了檢測時瓊脂糖凝膠的濃度并同時提高PCR-RFLPs條帶分辨的清晰程度，使得ESR基因型的檢測更為經(jīng)濟而且簡單。
參照趙要風(fēng)1998年的博士論文的內(nèi)容合成另外兩對檢測FSH-beta基因PCR-RFLPs多態(tài)的引物引物IV5′-ACTGGTCTATTCATCCTCTC-3′引物V5′-CCTTTAAGACAGTCAATGGC-3′將ESR基因多態(tài)檢測引物I、III和FSH-beta基因多態(tài)檢測引物IV、V合并，將兩對引物放于同一反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)，摸索合適的PCR反應(yīng)條件，待PCR反應(yīng)條件穩(wěn)定后，用該方法對不同品種豬的群體進行分析，即應(yīng)用該反應(yīng)體系在所確定的PCR反應(yīng)條件下進行PCR反應(yīng)，然后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物用PvuII進行酶切，電泳檢查酶切結(jié)果(所用瓊脂糖凝膠的濃度為4％)。
PCR反應(yīng)體系2.5μl 10×Taq DNA聚合酶緩沖液(500mmol/LKCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明膠)，2μldNTPs(2.5mmol/L for each)，引物終濃度0.5μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng。終體積25μl。
PCR反應(yīng)條件94℃ 4分鐘58℃ 1分鐘70℃ 1分鐘1個循環(huán)，然后94℃ 1分鐘58℃ 1分鐘70℃ 1分鐘31個循環(huán)，最后 72℃8分鐘，4℃長期保存。
酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件10μl PCR產(chǎn)物，加入0.5μl(10U)的PvuII限制性內(nèi)切酶，37℃消化過夜(5-12小時)。
用4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。該方法在同一個體系中同時檢測兩個基因的多態(tài)，因此大大降低了兩個基因多態(tài)檢測中的成本，節(jié)約了時間和人力，同時也使分析結(jié)果的雜合頻率大為提高，從而增加了分析結(jié)果的多態(tài)信息含量，為育種工作中標(biāo)記輔助選擇或標(biāo)記輔助滲入的工作提供了一個更為有效的、簡便易行的、多態(tài)信息含量更高的分子遺傳標(biāo)記。
本發(fā)明克隆測定了ESR基因的部分序列，所測序列中包含一個具有多態(tài)性的一個限制性內(nèi)切酶PvuII位點，因此可用于開發(fā)檢測ESR基因多態(tài)的遺傳標(biāo)記標(biāo)記(如PCR-RFLPs標(biāo)記、RFLPs標(biāo)記等)。
發(fā)明人依據(jù)所測定的ESR基因的部分序列重新設(shè)計引物，建立了一個新的檢測ESR基因多態(tài)性的PCR-RFLPs方法。該方法中PCR產(chǎn)物經(jīng)PvuII酶切后可產(chǎn)生三種長度的DNA片段，即246bp(A單倍體型)和185bp、65bp(B單倍體型)，而1997年Short，TH等人所發(fā)表的引物PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)PvuII酶切后產(chǎn)生另外三種不同長度的DNA片段即121bp(A單倍體型)和65bp、56bp(B單倍體型)，兩者相比，我們所發(fā)明的方法中使用較低濃度的瓊脂糖凝膠(2.5-3％)就能將三個片段很好的分開，而1997年Short，TH等人的方法中需要使用4％的瓊脂糖凝膠才能將三個DNA片段分開，因而我們的方法改進了ESR基因的PCR-RFLPs的檢測方法，降低了檢測時瓊脂糖凝膠的濃度并同時提高PCR-RFLPs條帶分辨的清晰程度，使得ESR基因型的檢測更為經(jīng)濟而且簡單。
參照趙要風(fēng)1998年的博士論文的內(nèi)容合成一對檢測FSH-beta基因PCR-RFLPs多態(tài)的引物，將我們所重新建立的ESR基因多態(tài)檢測方法中所使用的引物和FSH-beta基因多態(tài)檢測引物合并，將兩對引物放于同一反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)，并用PvuII切割PCR產(chǎn)物，從而建立了一個能在同一個體系中同時檢測ESR基因和FSH-Beta基因的多態(tài)的方法，該方法一方面，大大降低了兩個基因多態(tài)檢測中的成本，節(jié)約了時間和人力、物力，同時使檢測結(jié)果中雜合頻率大為提高，從而增加了分析結(jié)果的多態(tài)信息含量，為育種工作中標(biāo)記輔助選擇或標(biāo)記輔助滲入的工作提供了一個更為有效、簡便易行、多態(tài)信息含量更高的分子遺傳標(biāo)記。
附圖的簡單說明圖1.3.7Kb陽性克隆的正向測序結(jié)果。
圖2.3.7Kb陽性克隆反向測序的結(jié)果。
圖3.121bp PCR產(chǎn)物測序結(jié)果。
圖1-3所列出的序列可直接用于ESR基因的多態(tài)檢測的分子標(biāo)記的研究與開發(fā)。這些序列在GenBank中未見報道。其序列的測定尚屬首次。
圖4不同檢測方法檢測ESR基因和FSH-Beta基因多態(tài)性結(jié)果(A)為應(yīng)用1997年Short，TH發(fā)表的方法，對不同豬的個體不同及品種進行的ESR基因的PCR-RFLPs分析的電泳圖譜，瓊脂糖凝膠濃度為4％。(B)為應(yīng)用我們重新建立的方法對不同豬的個體及不同品種進行的ESR基因的PCR-RFLPs分析的電泳圖譜，瓊脂糖凝膠濃度為2.5％。(C)為以1998年趙要風(fēng)博士論文中的方法對不同豬的個體及不同品種進行FSH-Beta基因PCR多態(tài)性分析的電泳結(jié)果。(D)為將我所設(shè)計的檢測ESR基因PCR-RFLPs多態(tài)性所用引物和趙要風(fēng)博士論文所用引物合并于同一反應(yīng)體系中，同時對不同豬的個體及不同品種ESR基因PCR-RFLPs多態(tài)和FSH-Beta基因PCR多態(tài)分析的電泳圖譜。
從圖4(A)和(B)中的結(jié)果可以看出(1)就單獨ESR基因多態(tài)的檢測而言，在瓊脂糖凝膠濃度降低了的情況下，應(yīng)用我們重新設(shè)計的方法也同樣得到了非常滿意的結(jié)果。從圖4的(B)、(C)和(D)中我們可以看出，將我們所設(shè)計的新的檢測ESR基因多態(tài)性的引物與FSH-Beta基因多態(tài)性檢測所用引物合并在同一個反應(yīng)體系內(nèi)同時檢測ESR基因的PCR-RFLPs多態(tài)和FSH-Beta基因的PCR多態(tài)，其特異性和電泳分辨率與單獨檢測具有相同的效果，但合并檢測大大節(jié)約了時間、人力、物力，又同時提高了分析結(jié)果的雜合頻率從而提高了分析結(jié)果的多態(tài)信息含量。因此合并檢測法為兩基因的多態(tài)檢測，豬的育種工作中的標(biāo)記輔助選擇或標(biāo)記輔助滲入等的工作提供了一個更為實用有效的檢測手段。
實施例1ESR基因的克隆測定一、實驗材料與方法1、實驗材料1.1菌株和克隆載體本發(fā)明所用菌株如下
本發(fā)明所用的克隆載體為pGEM 3zf(+/-)vectorspGEM 7zf(+/-)vectorsPGEM-T Vectors均來自Promega公司1.2.實驗動物組織樣與血樣不同品種豬的組織樣和血樣采自江蘇省常熟市國營畜禽良種場，北京市昌平縣中國小型豬繁育場，南昌市蛟橋江西省種豬場，天津?qū)幒臃N豬場，天津武清種豬場，北京市南郊豬場。1.3.探針帶有人的ESR 1.8kb cDNA探針的質(zhì)粒pSG5-EHO由美國贈送。1.4.酶與試劑各種限制性內(nèi)切酶和修飾酶分別購自華美生物工程公司、Biolab公司和Promega公司；DIG標(biāo)記和檢測試劑盒來自德國BM公司；熒光標(biāo)記和檢測試驗劑盒來自Amersham公司；尼龍膜來自Amersham公司；X光片來自天津感光材料公司。PCR引物由上海生物工程公司和西安美聯(lián)公司合成。其它常規(guī)試劑來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)物資供應(yīng)科。1.5.DNA分析軟件同源性分析軟件GENETYX-MAX8.5，PCR引物設(shè)計軟件OLIG04.0，數(shù)據(jù)分析軟件SAS(6.12版本).2、實驗方法(Methods)2.1緩沖液與常用試劑的配制TE緩沖液10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高壓滅菌。高壓滅菌條件為1.034×105Pa，20分鐘。
STE緩沖液0.1M NaCl，10mM Tris·Cl，1mMEDTA pH8.0，高壓滅菌。
50X TAE緩沖液Tris堿242g，冰乙酸57.1毫升，0.5MEDTA(pH8.0)100毫升，加水至1L。
5×TBE緩沖液Tris堿54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA(pH8.0)20毫升，加水至1L。
質(zhì)粒DNA提取溶液I50mm葡萄糖，2.5mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，高壓滅菌10磅15分鐘，貯存于4℃。
質(zhì)粒DNA提取溶液II0.2M NaOH，1％SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用。
質(zhì)粒DNA提取溶液III5M乙酸鉀溶液60毫升，冰乙酸11.5毫升，滅菌水28.5毫升。
熒光雜交稀釋液(dilution buffer A)100mM Tris·Cl，300mMNaCl，pH9.5，高壓滅菌。
IPTG溶液IPTG 1g溶解于50毫升雙蒸水中，過濾除菌，分裝貯存于-20℃。
1M Tris·Cl121.14g Tris堿溶于800毫升雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000毫升，高壓滅菌。
0.5M EDTAEDTA 186.1g溶于800毫升雙蒸水中，用NaOH調(diào)pH值至8.0，定容至1000毫升，高壓滅菌。
3M NaAc(pH7.0)NaAc·3H2O 408.1g溶于800毫升雙蒸水中，用冰乙酸調(diào)pH至7.0，定容至1000毫升，高壓滅菌。
3M NaAc(pH5.2)NaAc·3H2O 408.1g溶于800毫升雙蒸水中，用冰乙酸調(diào)pH至5.2，定容至1000毫升，高壓滅菌。
20×SSCNaCl 175.3g，檸檬酸鈉88.2g溶于800毫升水中，調(diào)pH值至7.0，定容至1000毫升，高壓滅菌。
1M CaCl2CaCl2·6H2O 27g加水至100毫升，過濾滅菌，貯存于-20℃。
10％SDSSDS 100g溶于900毫升雙蒸水中，加熱至68℃助溶，用HCl調(diào)pH值至7.2，定容至1000毫升。
堿變性液0.5N NaOH，1.5N NaCl
中和液3N NaCl，0.5M Tris·Cl(pH7.4)RNaseA溶液100mg/毫升溶于10mM Tris·Cl(pH7.5)，15mMNaCl中100℃煮沸10分鐘，室溫冷卻后，貯存于-20℃。
氯化鋰212g LiCl溶于1L雙蒸水，高壓滅菌。
顯影劑和定影劑的使用方法參照石家莊市化工十廠的使用說明配制。
雜交緩沖液5×SSC，0.1％(W/V)SDS，5％葡聚糖，1/20V封阻劑。
血液DNA提取液10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，20μg/毫升胰RNA酶，0.5％SDS。
組織DNA提取液
2.2.感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)挑取DH5α或JM109大腸桿菌原種，在LB瓊脂板上劃線培養(yǎng)，挑取剛培養(yǎng)好的新鮮單菌落，接種到100毫升LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600達到0.4～0.5。將菌轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的滅菌100毫升離心管中，冰浴10～15分鐘，4000rpm，4℃離心10分鐘，以回收細菌沉淀，加入20毫升冰預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮細菌沉淀，然后冰浴10～15分鐘，4000rpm，4℃離心10分鐘，回收細菌沉淀，加入4毫升0.1M CaCl2溶液重懸細菌沉淀，這時的細胞可直接用于轉(zhuǎn)化實驗。加甘油至終濃度為15％～20％，混勻，分裝成200μl-小份，凍存于-70℃。2.3.質(zhì)粒DNA的小規(guī)模提取——堿裂解法(1)接種一單菌落于3毫升含70ug/毫升Amp的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm，37℃振蕩培養(yǎng)過夜(8-10小時)。
(2)10,000rpm，4℃離心5分鐘(無4℃條件常溫亦可)，收集菌體。
(3)適量STE重懸細菌沉淀，3毫升培養(yǎng)物沉淀在一個1.5毫升離心管中，4℃離心5分鐘，收集菌體。
(4)倒盡STE液體，加入200ul溶液I，振蕩充分懸浮細胞于溶液I中。
(5)加入新配制的溶液II 200ul，將管迅速顛倒混勻10次，室溫靜置5分鐘。
(6)加入溶液III 200ul，將管倒置振蕩1分鐘，冰浴5分鐘。
(7)1,2000rpm離心8分鐘，小心取上清于離心管中。
(8)用與上清等體積的Tris飽和酚、酚/氯仿、氯仿順次抽提一次，保留水相。
(9)加入1/10體積的pH5.2的3M NaAc，再加2體積的無水乙醇，-70℃冰箱內(nèi)沉淀15分鐘。
(10)離心棄上清，加入70％乙醇洗滌沉淀。
(11)離心棄上清，真空抽干，去除痕量乙醇。
(12)加入50ul TE同時加1ul RNase放入37℃中2小時。
(13)電泳檢查含量。2.4.質(zhì)粒DNA的大量制備接種大腸桿菌單菌落于100毫升LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，以4000rpm，4℃離心10分鐘，收集菌體，棄上清，將細菌沉淀用20毫升冰預(yù)冷的STE溶液重懸，按上述方法重新離心，去上清，倒置，吸干殘留液，加入冰預(yù)冷的質(zhì)粒提取溶液I2毫升，將細菌沉淀重懸，加入200μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/毫升溶于10mM Tris·Cl，pH8.0)，混勻，加入4毫升新配制的質(zhì)粒提取溶液II，蓋緊離心管蓋，緩慢顛倒數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，于室溫放置5～10分鐘，加2毫升用冰預(yù)冷的質(zhì)粒提取溶液III，將離心管顛倒數(shù)次，冰浴15分鐘，可看見有白色絮狀沉淀產(chǎn)生，12,000rpm，4℃離心20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加0.6倍體積異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘，10000rpm，室溫離心15分鐘，回收質(zhì)粒沉淀，去除上清，用70％乙醇洗沉淀一次，稍抽干，溶于1毫升TE中，加入5μl RNaseA(5mg/毫升)，37℃消化1小時，轉(zhuǎn)移至小離心管，用等體積的苯酚，苯酚氯仿，氯仿，各抽提一次，加入1/5體積的10M NH4AC，再加入2倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置30分鐘，12,000rpm，室溫離心10分鐘，棄上清，用70％乙醇洗沉淀兩次，真空抽干，溶于適量TE中，儲存于-20℃。
2.5.重組質(zhì)粒大小的快速鑒定——Cracking法挑取轉(zhuǎn)化后在x-gal平板培養(yǎng)的白色菌落，在另一塊含有Amp的LB板上劃線培養(yǎng)12～16小時，同時挑一藍斑做對照，用牙簽挑取少量菌體，涂于含有20μl滅菌水的離心管內(nèi)，振蕩，充分懸浮菌體后，加入等體積20μl的2×Cracking buffer，劇烈振蕩2分鐘，12,000rpm離心5分鐘后，取上清10～20μl上樣電泳，以藍斑的裂解物作對照，檢測質(zhì)粒是否有插入及其大致大小。
2.6.豬血DNA的提取收集約10毫升新鮮血液，加1.5毫升ACD，混勻，新鮮血液以1300g離心15分鐘，棄上層血漿，將中間的淡黃層移至一管中；冷凍血液則在室溫融化以后，移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液，于室溫以3500g離心15分鐘，棄去上清液。加入5毫升DNA抽提緩沖液，重懸沉淀物，于37℃溫育1～2小時，加入蛋白酶k至終濃度為100μg/毫升，混勻，55℃消化6～10小時，直至溶液中不再有粘稠的團塊，將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，反復(fù)顛倒離心管，直至兩相混合形成乳濁液，12,000rpm，室溫離心15分鐘，取上清，再用等體積酚氯仿，氯仿各抽提1次，取上清加1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積無水乙醇沉淀DNA，將DNA挑出放到一1.5毫升離心管中，用70％乙醇洗兩次，將DNA干燥后(注意不能太干)溶于適量TE或滅菌雙蒸水中。
2.7.豬組織DNA提取1.盡力剪碎組織塊；2.將剪碎的組織于真空機中抽干(10分鐘)；3.加入600ul組織DNA提取液，混勻；
4.加RNase至終濃度為20ug/毫升，37℃消化1-2小時；5.加蛋白酶K至終濃度為100～200ug/毫升，55℃消化12～24小時；6.酚氯仿(1∶1)抽提兩次；7.氯仿抽提一次；8.2倍體積無水乙醇和0.1體積的NaAc(3M，pH 5.2)沉淀；9.將沉淀轉(zhuǎn)入另一管中；10.70％乙醇洗一次；11.真空抽干或自然晾干；12.適量的無菌水或TE溶解DNA；13.電泳檢測DNA濃度；14.-20℃保存。
2.8.目的片段的制備(凍融法)1.取10μg質(zhì)粒DNA，200μl體系，10u內(nèi)切酶37℃酶切3小時。
2.加入25.8μl 1M Tris Cl(pH7.5)，10u內(nèi)切酶，加ddH2O至300μl 37℃酶切2小時。
3.取少量酶切產(chǎn)物檢查酶切效果。
4.0.8％瓊脂糖，膠上電泳分離目的片段。
5.切下含目的片段凝膠，切碎，置于1.5毫升離心管。
6.加入等體積苯酚混勻。
7.液氮中放置3-5分鐘，室溫解凍，重復(fù)二次。
8. 8000g，離心8分鐘。
9.取上清加等積酚仿，氯仿各抽一遍。
10.加2倍體積無水乙醇1/10倍體積3M NaAc(pH5.2)，于-20℃放20分鐘。11. 1,2000rpm離心10分鐘。12. 70％乙醇洗一遍，抽干溶于20μl TE(pH8.0)。13.測OD值，電泳檢查。
2.9.熒光素基因成像探針標(biāo)記1.取1μg目的片段稀釋至20μl封好。
2. 100℃水浴變性10分鐘，冰浴10分鐘。
3.依次加入熒光素基因成象標(biāo)記試劑盒中的核苷酸混合物10μl，引物5μl，Klenow(4u/μl)1μl，加水至50μl。
4.混勻，瞬時離心，37℃水浴標(biāo)記過夜。
5.加EDTA(pH8.0)至終濃度20mM，終止反應(yīng)。
6.-20℃避光保存。2.10.探針質(zhì)量鑒定1.將對照探針稀釋至5，1，0.5，0.2，0.1pg/μl。
2.各點1μl于尼龍膜上，同時點上對照探針，0.000625μl，0.0025μl，0.025μl，0.25μl，0.5μl。
3.取出膜放入GS.Gene LinkerTMUV chamber中用C3程序烘烤1-2次。
4.用2×SSC，60℃洗15分鐘。
5.將膜放濾紙上吸干，在暗室里壓上一張X光片。
6.曝光30分鐘后，顯影5分鐘，定影10分鐘。
7.估計標(biāo)記探針的濃度。2.11.雜交1.將預(yù)雜交液加熱至60℃。
2.將膜封好，加入22毫升預(yù)雜交液，60℃輕搖3小時。
3.將探針變性，加到預(yù)雜交液中，使探針終濃度達到30pg/毫升。
4. 60℃雜交過夜。2.12.洗膜1. 200毫升1×SSC，0.1％SDS，60℃輕搖15分鐘。
2. 200毫升0.5×SSC，0.1％SDS，60℃輕搖15分鐘。
3.將膜放入稀釋緩沖液中潤濕。
4.在15毫升含1/10V封阻劑的稀釋緩沖液A中輕搖1小時。
5.重復(fù)步驟(3)一次。
6.用3毫升稀釋緩沖液A，加BSA至0.5％(w/v)，稀釋熒光素抗體10,000倍，將膜在室溫下?lián)u1小時。
7.用含0.3％(V/V)Tween20的稀釋緩沖液A，洗膜10分鐘。
8.重復(fù)(7)兩次。
9.重復(fù)(3)一次。2.13.信號產(chǎn)生和檢測1.洗好的膜瀝干多余的稀釋緩沖液A。
2.將尼龍膜封入塑料袋中，樣品面朝上。
3.加入0.5毫升檢測試劑，抹勻。
4.轉(zhuǎn)至暗室壓上X光片，曝光2小時。
5.顯影5分鐘，定影10分鐘。
6.對照X光片和電泳照片，進行分析。2.14.將變性DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上DNA電泳完畢后，取出凝膠，用0.25M的氫氧化鈉浸泡凝膠20分鐘。去除凝膠無用部分，用一塊大于凝膠的有機玻璃或平皿作為平臺，放入一個大的平皿內(nèi)，上面放3張20×SSC浸濕的厚濾紙做成紙橋，注意趕除氣泡。在濾紙上依次放上凝膠，與凝膠同樣大小的尼龍膜，3層厚濾紙，一摞紙巾，在大平皿內(nèi)倒入20×SSC，使液面略低于平臺表面。整個系統(tǒng)用保鮮膜封閉后，在紙巾上加一重物。轉(zhuǎn)移6～12小時后，取出尼龍膜，用5×SSC溶液浸泡濾膜5分鐘，將膜放在干凈濾紙上晾干。
120℃烘烤30分鐘或用UV crosslinker照射后，進行雜交。2.15.DIG探針的標(biāo)記和雜交檢測I.探針標(biāo)記將1μg DNA模板，溶解在16μl滅菌水中，在沸水中煮10分鐘，插在冰上10分鐘。加入4μl DIG High Primer溶液，混勻，離心。37℃標(biāo)記過夜，加入2μl 5M LiCl，80μl乙醇，-70℃沉淀2小時。離心，沉淀干燥后，溶于50μl TE中，測定標(biāo)記效率。II.DIG標(biāo)記探針的雜交將膜放入雜交袋中并加入DIG標(biāo)記雜交液，體積為20毫升/100cm2膜，在42℃恒溫振蕩水浴預(yù)雜交2小時。將預(yù)雜交液倒掉，加入含有標(biāo)記探針的雜交液(5毫升/100cm2膜)，封口后，在42℃水浴雜交16小時。回收雜交液，將膜用2×SSC，0.1％SDS的洗膜液在室溫洗2×5分鐘，然后用0.1×SSC，0.1％SDS的洗膜液在68℃漂洗2×15分鐘。
將膜放在DIG Buffer I中簡單漂洗一下，放在適量的DIG Buffer II中于室溫溫育30分鐘，不時搖動。將膜放入適量的抗體稀釋液中(含150mU/毫升抗體的DIG Buffer II)中浸泡30分鐘，持續(xù)地輕輕晃動。用DIG Buffer I洗膜2×15分鐘。將膜放入Buffer III中平衡2分鐘。取出膜，放入一塑料袋中，加入適量顯色劑，在暗處進行顯色反應(yīng)。A2.16.雜交膜的重復(fù)利用1.5×SSC洗膜1-2分鐘。
2.將煮沸的0.1％SDS溶液，澆在膜上，在搖床上搖動洗膜15分鐘。
3.重復(fù)2兩次，將洗好的膜貯于4℃?zhèn)溆谩?.17.克隆載體的去磷酸化1.用SmaI消化20ug pGEM7zf(+)，切成線性后用等體積的酚/氯仿抽提DNA一次。
2.上清液中加0.1體積的3M NaAc(pH7.0)，2倍體積的無水乙醇，冰上放置15分鐘后，1,2000rpm離心15分鐘，棄上清，用70％的乙醇洗滌，離心，室溫下干燥蒸發(fā)乙醇后用90ul 10mM Tris.cl(pH8.3)溶解DNA沉淀，取出約200ng DNA，-20℃保存，作為DNA連接試驗時的對照組。
3.剩余的DNA(1ul點樣檢測濃度，4ul做對照)。加入10×CIP buffer10ul，加CIP 1ul(1u)，加4ul H2O，37℃保溫15分鐘，接著加入0.5ul CIP在55℃水浴保溫45分鐘(2ug 5Kb大小線狀DNA大約含1.4pmol/左右的5’磷酸基團，5’-突出的DNA每100pmol/L 5’磷酸基團加入1個單位的CIP，37℃反應(yīng)30分鐘，平末端或3’-突出的DNA每2pmol5’磷酸基團加1u CIP反應(yīng)條件見前)。
4.反應(yīng)完后在75℃，10分鐘滅活CIP。
5.冷至室溫后，加入等體積的酚、酚/仿分別抽提一次。
6.上清移入Eppendoff管中，加入0.1體積的3M NaAc(pH7.0)2倍體積的無水乙醇混勻。0℃放置15分鐘，離心。
7.去上清，沉淀用70％的乙醇洗，離心，去上清。
8.真空干燥，TE溶解，-20℃貯存。2.18.陽性克隆的篩選——菌落原位雜交1.將轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)好的平板放入4℃ 2小時。
2.將膜鋪在板上，用玻棒推平，放10分鐘。
3.用針在膜上做3個不對稱的孔，再在孔內(nèi)點進無菌藍墨水小心取出膜，在另一Amp板上復(fù)印一份，將Amp板放在37℃培養(yǎng)。
4.將膜放在用10％SDS浸透的濾紙上，菌落面向上，處理3分鐘。
5.將膜放在變性液浸透的濾紙上，菌落面朝上，處理5分鐘。
6.將膜放入中和液中處理10分鐘。
7.放入2×SSC中處理10分鐘。
8.取出膜放入GS.Gene LinkerTMUV chamber中用C3程序烘烤1-2次。
9.雜交方法同2.14熒光雜交雜交方法。2.19.將PCR產(chǎn)物連到T載體上連接體系10×T4 DNA連接酶緩沖液1μlT4DNA連接酶(3u/μl) 1μlT載體(30ng/μl) 1μlPCR產(chǎn)物 60ng加ddH2O至 10μl16℃水浴過夜2.20.轉(zhuǎn)化1.從-70℃取出保存的感受態(tài)細胞，冰浴助融。
2. 200μl感受態(tài)細胞加入5μl連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘。
3. 42℃水浴熱激90秒，冰浴2分鐘。
4.加800μlLB，37℃水浴復(fù)活50分鐘。
5.鋪200μl于含X-gal，IPTG，Amp的LB平板。
6. 37℃培養(yǎng)9-16小時。2.21.篩選重組子1.挑取白斑劃線于涂有X-gal，IPTG，Amp的平板。
2.接劃線菌于2毫升LB中，過夜培養(yǎng)。
3.堿變性提取重組質(zhì)粒。
4.內(nèi)切酶消化0.5μg DNA。
5.電泳檢查。A2.22.制備模板1.堿變性制備模板。
2.調(diào)濃度至0.1-0.2μg/μl。2.23.Dye Primer對陽性克隆作部分測序1.堿裂解法準(zhǔn)備模板，稀釋至0.1-0.2μg/μl2.PCR測序反應(yīng)體系
3.PE9600 PCR反應(yīng)(1).95℃，30秒；55℃，30秒；70℃，1分鐘；15個循環(huán)。
(2).95℃，30秒；70℃，1分鐘，15個循環(huán)。
4.沉淀PCR產(chǎn)物(1).將反應(yīng)物加入到含100μl 95％乙醇，1.5毫升離心管中。
(2).冰上放置15分鐘。
(3).12,000rpm，離心15分鐘。
(4).250μl70％的乙醇洗一遍。
(5).抽干，-20℃保存，準(zhǔn)備測序上樣。2.24.利用玻璃奶洗脫法回收PCR產(chǎn)物1.從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段，放在1.5毫升Eppendorff管中搗碎，動作輕柔。
2.加入3倍體積的溶膠液，室溫下放置5分鐘(或50℃保溫3
分鐘)，其間輕搖Eppendorff管幾次，使膠完全溶化。
3.加入10μl玻璃奶，顛倒混勻，冰浴下放置10分鐘。并且間隔2-3分鐘混勻一次。
4. 12,000rpm離心30秒，吸棄上清。
5.加250μl漂洗液，用加樣器吸漂洗液輕柔地將玻璃奶沖散均勻，離心棄上清。
6.重復(fù)第5步一次。吸取完漂洗液后，再離心10秒鐘，用Tip頭將最后一點兒漂洗液吸干凈。然后，放置于37℃溫箱干燥20分鐘。
7.加適量無菌蒸餾水或TE(10-30μl)，混勻。60℃水浴5分鐘。
8.12,000rpm離心1分鐘，回收上清備用，重復(fù)第7-8步1-2次。二、實驗結(jié)果1.ESR基因的RFLPs特異性片段的克隆和部分序列分析1.1探針的制備帶有人ESR基因1.8Kb cDNA質(zhì)粒(PSG5-EHO)經(jīng)EcoRI酶切后，經(jīng)電泳分離，回收1.8Kb的片段。酶切結(jié)果見圖5，回收結(jié)果見圖6。1.2.基因組DNA的制備從豬耳組織塊中提取基因組DNA，可直接用于PCR擴增。如果需要用于做分子雜交，應(yīng)經(jīng)電泳檢測，初步確定DNA的純度及分子量的大小以及DNA是否降解等，純度高，分子量完全的基因組DNA是保證實驗成功的關(guān)鍵步驟，DNA越純越好。純度不高的DNA很難被限制性內(nèi)切酶消化，會直接影響以后的實驗。豬耳組織DNA見圖7。
由于ESR基因是單拷貝基因，在RFLPs雜交分析時，為了得到較理想的雜交信號，酶切的基因組DNA量應(yīng)為10ug-20ug左右，要使酶能充分消化DNA，最好將DNA分成5ug/管，然后在50ul反應(yīng)體系中進行消化，最后將幾個酶切管消化液合并到1管中，然后用乙醇沉淀，用TE或滅菌雙蒸水重新溶解，以備電泳用。電泳電壓為30V，時間為18小時，酶切良好的基因組DNA，電泳后應(yīng)該為消化均勻的酶切條帶。酶切基因組DNA結(jié)果見圖9。
1.4.雜交結(jié)果通過對不同品種豬基因組DNA的southern雜交結(jié)果表明主要的多態(tài)性出現(xiàn)在大小為3.7Kb，4.3Kb左右的條帶。由于基因組DNA選擇的原因，在這6個DNA樣品中，沒有檢測到AA型(即只有4.3Kb條帶，而不出現(xiàn)3.7Kb條帶)。
1.5.陽性克隆的篩選及鑒定選擇上述雜交中包含有3.7kb帶的豬基因組DNA經(jīng)PvuII完全消化后，回收大小在3.0Kb-4.0Kb左右片段。連接到經(jīng)線性化和去磷酸化的PGEM-7zf+)載體上，用菌落原位雜交的方法篩選出陽性克隆，然后作酶切鑒定。通過對4塊平板，大約600個單菌落的篩選，篩選出3個陽性克隆。然后經(jīng)酶切鑒定后進行序列分析。
1.6.部分序列分析對篩選出的3.7Kb陽性克隆，利用Dye Prime Kit作正向及反向測序。(1)3.7Kb陽性克隆的正向測序結(jié)果1 CTGTTCTTGT CAAGTCCCCA TTCCACCCTA TTCTAATTGG ACTGACCCTC GAAGTGTTTC TGCATGTGGT71 GCTGCTCTTG GGAGTGAATA GCTGCAGATG GGGCACAGGT GAGATGCTGG TTCGAGCCGA GGTGAGCAAG141 GGACTTGCCA ATGCCCCTTA GCATTGATTT GCTCTCAACT GATCTCTGCT TGTCATGAAA CAAGACTGGT211 TTATTTTTGT TTTTATTTCC ATTTCCCAAG GTGATGGAAC CAAAAAGATA TTGCTGTGAT TTATGGCAGA281 GTGTTCTGCC TATGTTTTCC TCTAAGAGTT TATAATACCT GGTTTTGCAT TTAGGTTTTT GATCTGCTTG351 AGTTTATTTT GTGTGTGGTG TTAGCATTCT CATCATTATT TTATATGTAT TGCGGTCCAC TTTCCAAGCA421 CCACTGCATG ATATGGCTTA ATGCAGAATA TAAAAAATGA TACAAATGAG CTAATTACAA AACAGAATAG491 ACTCACAGGA CATTGAAACA AACTATGGTA CCAAGGGGGA AAGTGAGGGN GAATAATAAG ACTTGGGATA561 ACAGATACNC CTGATATATA TAATNAGGGG GGTANCCAAA NGGCCAATGG CATACNCAGG GNGCGGACCC631 AAAACCTGGA AAACCCACAA NGGNAAGAAC NAAGAAGATT NTTATGCCNN NANGATACCG GNCNCTTGGA701 NAACCTGNAC CA(2)3.7Kb陽性克隆反向測序的結(jié)果001 ATTTATGTGA CACTATAGAA TACTCAAGCT ATGCATCCAA CGCGTTGGGA GCTCTCCGGA TCCAATCTTA071 TCGATTTCGA ACCCCTGTGG CTCCAATTCA ACCCCTAGGC TGGGAACTTC CATATGCCAC AGGTATGGCC141 CTGAAAAGCA AAAAAAGCAA AAAAAATAAA AAATAGATAA GCAAACAAAC AGACAAAAGC AAACAAAAAG211 AAGCATAGGT CGTACACCTG AAACTAACAC AATATTGTAA ATCTACTATA TTTTTTTCNA AAAAAAGAAG281 CAAAGGTAGA AACATCAAGG GTTAAACATA GAATGTTATT GTCAAATTCT TAAACAGTTA AAGAATAATA351 TTCTAAATGA CAAAAAAGAC ATTCCTTGAA CAAGTTGTAA TAGGCATAAA AATTTATACA CTAAAAAATA421 GCTAAGAGCA AAATCTCTTG GAAATGAAGA GAATTCAATA AAAAAGGGNA ACCATATTGA GAGTCTAAAA491 TACCTCTCTT CCAATTTTTT AATTAAACAG CCAAAAAGGG GTATGTATAT AAATANNTTT GACAGCATAT561 TACCCATCTT GNTTTATGGG NTTTGGAANG GGGATCCCAT CNCTAAAGGG GGATTATCCT TTNNCCCNTA631 AGNTTGAAAA目前對豬ESR基因的全序列還不知道，通過與GenBank中豬及其它動物ESR基因的已知序列比較分析(豬ESR基因的已知序列有激素結(jié)合區(qū)Exon5-8，5′側(cè)翼區(qū)Exonl的序列)，其同源性很低(均在40-50％左右)。因而，這一段序列為未知序列。
實施例2ESR基因的PCR-RFLPs多態(tài)性分析一.PCR反應(yīng)條件的最優(yōu)化PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為25μl，10×緩沖液成分為100mmol/LTris·Cl，pH8.0，500mmol/L KCl，15mmoLMgCl2，0.1％明膠。dNTPs終濃度為200μmol/L，引物終濃度為0.5μmol/L，1u Taq DNA聚合酶。DNA的量為50-100ng。
PCR反應(yīng)條件 72℃ 8分鐘 →4℃ ∞PCR儀為Gene Amp PCR System 9700、9600、或2400。
豬ESR基因的PCR擴增參照Short，TH等人(1997年)所發(fā)表的引物序列合成引物。
引物I5′--CCT，GTT，TTT，ACA，GTG，ACT，TTT，ACA，GAG--3′引物II5′--CAC，TTC，GAG，GGT，CAG，TCC，AAT，TAG--3′對二花臉豬、大白豬、長白豬、香豬、杜洛克豬、雙肌臀豬的基因組DNA進行PCR擴增，均得到一條長為121bp的條帶。二、PCR-RFLPs反應(yīng)條件的最優(yōu)化PCR產(chǎn)物的酶切取10μl PCR產(chǎn)物，加入0.5ul(10u/ul)PvuII內(nèi)切酶，37℃消化過夜(5-12小時)，4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。豬ESR基因PCR產(chǎn)物PvuII酶切結(jié)果(PvuII酶切的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)CAGCTG)，有PvuII酶切位點的PCR產(chǎn)物酶切后為兩條帶，大小分別為56bp，65bp。三、PCR擴增產(chǎn)物的克隆測序由于Genbank中無此序列的有關(guān)報道，同時為進一步證明3.7Kb克隆是正確的及新的ESR基因檢測方法的建立，我們將PCR產(chǎn)物(以PCR產(chǎn)物中具有PvuII酶切位點的個體基因組為模板的PCR產(chǎn)物)連接到T-vector上，對陽性克隆作雙酶切鑒定。質(zhì)粒DNA5ulBuffer43ulNcoI 1ulSalI 1ulddH2O 20ul37℃消化4-5小時，然后電泳檢測。
利用Dye Prime Kit對陽性克隆進行測序。PCR擴增區(qū)的測序結(jié)果1020304050605’ CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAGAATAGGGTGGAATGGGGACTTGACAAGAACAGCTGG
708090100 110 120TCTCATAAAACTTGATTCTGCATCTTTAGATATACTCTGTAAAAGTCACTGTAAAAACAG G3’PvuII酶切位點的位置DNASIS ***** RESTRICTION ENZYME SITE MAP LIST *****FILE NAME121. SEQ ENZYME FILE DNASIS CATSTYLELINEAR INDICATION MODE ACTUAL CUTTING SITE*** RESTRICTION ENZYME SITE *** NORMAL1-12110203040 50 605’ CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAGAATAGGGTGGAATGGGGACTTGACAAGAACAGCTGG∧^PvuII708090100 110 120TCTCATAAAACTTGATTCTGCATCTTTAGATATACTCTGTAAAAGTCACTGTAAAAACAGG3’[GENETYX-MACSearch Restriction Fragment]Filename ！120. rev. SEQSequence Size121Sequence Position1-121(1)PvuII CAGCTG1 Sites1-6565 base66- 12156 base同源性比較分析PCR擴增區(qū)序列與3.7Kb特異性RFLPs片段陽性克隆正向序列的比較分析。同源性比較分析表明PCR擴增區(qū)56bp的PvuII酶切片段位于3.7Kb正向序列的起始部分。[GENETYX-MACNucleotide Sequence Homology Data]lst Nucleotide SequenceFile Name！0737SEQSequence Size7122nd Nucleotide SequenceFile Name！56.SEQSequence Size 56[100.0％/56 bp] OPT. Score<224>1’CTGTTCTTGTCAAGTCCCCATTCCACCCTATTCTAATTGGACTGACCCTCGAAGTGTTTC********************************************************1″CTGTTCTTGTCAAGTCCCCATTCCACCCTATTCTAATTGGACTGACCCTCGAAGTG四、引物設(shè)計為了能夠更簡便地檢測ESR的基因型，降低電泳時瓊脂糖凝膠的濃度，根據(jù)3.7Kb特異性RFLPs片段正反向測序結(jié)果及121bpPCR擴增區(qū)的測序結(jié)果，我們設(shè)計了一條PCR反向引物引物III5′--CAG，TTG，AGA，GCA，AAT，CAA，TGC，TAA，G--3′與前述引物I合并使用，擴增片段長度為246bp，經(jīng)PvuII酶切后為181bp和65bp如PCR產(chǎn)物中無PvuII位點則只產(chǎn)生一個246bp的DNA片段。這樣一來，我們可以將電泳時瓊脂糖凝膠的濃度降低為2.5-3.0％并同時提高條帶分辨的清晰程度，使得ESR基因型的檢測更為經(jīng)濟而且簡單。
PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為25μl，10×緩沖液成分為100mmol/LTris·Cl，pH8.0，500mmol/L KCl，mmoLMgCl2，0.1％明膠。dNTPs終濃度為200μmol/L，引物終濃度為0.5μmol/L，1u Taq DNA聚合酶。DNA的量為50-100ng。
PCR反應(yīng)條件
60℃ 1分鐘31個循環(huán)72℃ 1分鐘72℃ 8分鐘→4℃ ∞PCR儀為Gene Amp PCR System 9700、9600、或2400。五、ESR和FSH-Beta基因頻率分析表2-1不同品種豬FSH-Beta和ESR基因的分布頻率
注York大約克豬，Duro杜洛克豬，Land長白豬，Doub雙肌臀豬，Erhua二花臉豬，Xiang香豬，Wuzhi五指山豬。*檢測頭數(shù)。六、FSH-Beta基因的PCR多態(tài)性分析PCR引物參見趙要風(fēng)博士論文。
引物IV5’--ACT，GGT，CTA，TTC，ATC，CTC，TC--3’引物V5’--CCT，TTA，AGA，CAG，TCA，ATG，GC--3’PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為25μl，10×緩沖液成分為100mmol/LTris·Cl，pH8.0，500mmol/L KCl，15mmoLMgCl2，0.1％明膠。DNTPs終濃度為200μmol/L，引物終濃度為0.5μmol/L，1u Taq DNA聚合酶。DNA的量為50-100ng。
PCR反應(yīng)條件94℃4分鐘94℃30s58℃30s30個循環(huán)
72℃30s72℃8分鐘 →4℃ ∞PCR儀為Gene Amp PCR System 9700、9600、或2400。
實施例3ESR基因與FSH-Beta基因的單倍體型分析一、PCR反應(yīng)條件的最優(yōu)化PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為25μl，10×緩沖液成分為100mmol/LTris·Cl，pH8.0，500mmol/L KCl，20mmoLMgCl2，0.1％明膠。DNTPs終濃度為200μmol/L，引物終濃度為0.5μmol/L，1u Taq DNA聚合酶。DNA的量為50-100ng。PCR反應(yīng)條件 72℃ 8分鐘 →4℃ ∞二、PCR-RFLPs反應(yīng)條件的最優(yōu)化PCR產(chǎn)物的酶切取10μl PCR產(chǎn)物，加入0.5ul(10u/ul)PvuII內(nèi)切酶，37℃消化過夜(5-12小時)，4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。三、ESR基因與FSH-Beta基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)的影響1.線形模型Y1＝均方差+FSH-Beta基因型+ESR基因型+FSH-Beta基因與ESR基因間的互作+場間及品種間效應(yīng)+殘差(Y1＝μ+sows+FSH-Beta genotype+ESR genotype+FSH-Beta*ESRinteraction+farm/breed+residuals)Y2＝均方差+母體效應(yīng)+單倍體型+場間及品種間效應(yīng)+殘差(Y2＝μ+sows+haplotypes+farm/breed+residuals.)最小二乘均數(shù)是該基因型母豬的產(chǎn)仔成績，而簡單均數(shù)則是包括環(huán)境、農(nóng)場等因素的影響，列出兩者，可以評估各種影響的效應(yīng)有多大。
表5-1中 國本地豬的基因型分布及簡單均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差
表5-2中國本地豬的單倍體型分布及簡單均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差
表5-3外國豬種的基因型分布及簡單均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差
表5-4外國豬種的單倍體型分布及簡單均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差
表5-5外來品種豬FSH-BETA和ESR基因型的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的最小二乘均數(shù)
長白豬，大白豬，雙肌臀豬分別來自江蘇常熟畜禽良種場及江西南昌種豬場表5-6中國本地豬FSH-BETA和ESR基因型的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的最小二乘均數(shù)
二花臉豬來自江蘇常熟畜禽良種場，香豬來自中國農(nóng)大北京昌平實驗站表5-7外來品種豬單倍體型的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的最小二乘均數(shù)
長白豬，大白豬，雙肌臀豬分別來自江蘇常熟畜禽良種場及江西南昌種豬場表5-8中國本地豬種單倍體型的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的最小二乘均數(shù)
二花臉豬來自江蘇常熟畜禽良種場，香豬來自中國農(nóng)大北京昌平實驗站四、結(jié)論與分析1、以含有人ESR基因1.8Kb cDNA質(zhì)粒作為探針跟不同品種豬的基因組DNA進行southern雜交，對RFLPs結(jié)果進行分析。其主要多態(tài)性出現(xiàn)在3.7Kb和4.3Kb條帶，結(jié)合1996年Rothschild的報道，含有3.7Kb條帶的基因為B基因(優(yōu)勢基因)，克隆了豬ESR基因的3.7Kb特異性RFLPs片段，對陽性克隆進行正反向測序(正向約712bp，反向約640bp)。目前對豬ESR基因的全序列還不知道，通過與GeneBank中豬及其它動物ESR基因的已知序列比較分析，其同源性很低(均在40-50％左右)。因而，這一段序列為未知序列即我們是首次克隆了該基因序列，另外我們對豬的1997年Short.TH等人的檢測ESR基因PCR-RFLPs多態(tài)方法中PCR擴增區(qū)121bp序列的測定也尚屬首次。這些序列是開發(fā)與豬的產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)的ESR基因多態(tài)標(biāo)記的重要參考信息。
2、克隆豬ESR基因PCR擴增區(qū)的121bp片段，進行序列分析。發(fā)現(xiàn)ESR基因座等位基因的的差異是由于B等位基因發(fā)生點突變，從而產(chǎn)生了一個PvuII限制性酶切位點。通過對121bp片段與3.7Kb片段的同源性比較分析，結(jié)果表明PCR擴增區(qū)56bp的PvuII酶切片段位于3.7Kb正向序列的起始部分。因此，設(shè)計了一條反向引物，改進了ESR基因的PCR-RFLPs的檢測方法。以降低檢測時瓊脂糖凝膠的濃度并同時提高PCR-RFLPs條帶分辨的清晰程度，使得ESR基因型的檢測更為經(jīng)濟而且簡單。
3、建立了一套穩(wěn)定地同時對ESR位點與FSH-BETA位點單倍體型進行檢測的檢測系統(tǒng)，可節(jié)約大量的時間和經(jīng)費，同時也提高了分析結(jié)果的信息含量。
4、采用PCR-RFLPs的方法，對不同品種豬的基因型檢測發(fā)現(xiàn)，ESR基因和FSH-BETA基因的基因頻率分布差異極顯著(P＜0.01)。ESR基因與FSH-BETA基因優(yōu)勢基因(B)的頻率分別為大約克豬為0.4718、0.8748；長白豬為0.1591、0.1982；杜洛克豬為0.1860、0.7852；二花臉豬為1.0000、0；五指山豬為0.7308、0.6583；雙肌臀豬為0.4166、0.8647；香豬為0.6017、0。不同品種豬的ESR基因頻率分布未見有關(guān)報道；1998年趙要風(fēng)報道(18)，不同品種豬FSH-BETA基因優(yōu)勢基因(B)的頻率分別為大約克為0.9074；長白豬為0.8196；杜洛克豬為0.8163；二花臉豬為0；香豬為0；民豬為0.5385。
5、通過對ESR基因及FSH-BETA基因的基因型與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性分析表明ESR基因與FSH-Beta基因在商業(yè)豬種中均為控制豬高產(chǎn)仔數(shù)的主效基因或與控制豬高產(chǎn)仔數(shù)的主效基因緊密連鎖，但是它們對產(chǎn)仔數(shù)的影響存在顯著的場間和品種間差異。ESR位點BB基因型母豬平均比AA基因型母豬多1.40-3.37頭總產(chǎn)仔數(shù)/胎，0.63-3.58頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎；FSH-Beta位點BB基因型母豬平均比AA基因型母豬多1.07-2.40頭總產(chǎn)仔數(shù)/胎，0.55-2.21頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎，這與以前Rothschild研究組(ESR基因控制約0.44-1.15頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎)和李寧研究組(FSH-BETAeta基因控制約1.5-2.0頭產(chǎn)仔數(shù)/胎)對這兩個基因的報道結(jié)果相一致。
這兩個基因座的單倍體型BBBB母豬平均比ABAA母豬多1.85-3.01頭總產(chǎn)仔數(shù)/胎，2.0-3.0頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎。顯然，這兩個基因座的優(yōu)勢等位基因的效應(yīng)足以用于育種實踐來改良豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀。
6、通過常規(guī)的育種技術(shù)，豬的許多重要生產(chǎn)性狀都在遺傳上得到了很好的改良，如瘦肉率、背膘等，但對產(chǎn)仔數(shù)性狀的改變卻十分有限，主要原因是產(chǎn)仔數(shù)的遺傳力很低，只有0.1左右，同時又是限性別表達性狀(只有母豬產(chǎn)仔)。FSH-Beta和ESR基因都已證明是影響豬養(yǎng)仔數(shù)的主效基因，但這兩種基因的頻率在外國商業(yè)品種和中國本地品種的分布卻有較大差別。特別是FSH-Beta基因座，表現(xiàn)出極端的偏態(tài)分布，在外國商業(yè)種豬群中，缺乏AA基因型，而在中國本地種豬群中，則罕見BB基因型，這也是造成在本研究中方差檢驗FSH-BETA基因型間影響產(chǎn)仔效應(yīng)不顯著的原因，一個較為合理的解釋，在外國商業(yè)品種中，由于長期對產(chǎn)仔數(shù)選擇(特別約克夏品種)，導(dǎo)致了BB基因型的積累。
單倍體型的效應(yīng)不是各自基因型效應(yīng)的簡單相加，但卻要稍高于單個最好的基因型效應(yīng)，這個結(jié)論對于利用DNA標(biāo)記進行輔助選擇特別有意義，表明評估品種或種群的遺傳改良必須以單倍體型的影響效應(yīng)為準(zhǔn)，同時還要考慮到單倍體型的分布頻率。無論是FSH-Beta或ESR單個基因型或單倍體型，品種的不同，影響效應(yīng)也不完全相同，因為各品種的遺傳背景不可能相同。此外，各基因型和單倍體型對產(chǎn)仔數(shù)的影響在胎次間亦有差異，通常是對頭胎產(chǎn)仔數(shù)的影響顯著地高于其他經(jīng)產(chǎn)胎次。此外，ESR基因與FSH-Beta基因座間不存在互作，因此可以簡單地依據(jù)單倍體型的效應(yīng)值來對種豬排隊進行選擇育種。在“中國超級大約克豬”的培育過程中，已經(jīng)在利用FSH-Beta和ESR基因型分析方法進行選種，并清楚地觀察到了各世代中對產(chǎn)仔數(shù)的顯著改良效果。
7、根據(jù)模型I計算的FSH-Beta和ESR基因型最小二乘均數(shù)總結(jié)于表5-5、表5-6；根據(jù)模型II計算的單倍體型最小二乘均數(shù)總結(jié)于表5-7、表5-8。單倍體型和ESR基因型對總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的影響為極顯著(P＜0.001)，而FSH-Beta和FSH-Beta與ESR基因的互作效應(yīng)對總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的影響均不顯著(P＞0.05)。無論是在中國地方種豬群內(nèi)還是外國商品種豬群內(nèi)，F(xiàn)SH-Beta和ESR基因型BB均為優(yōu)良基因型，而單倍體型BBBB是最優(yōu)秀的單倍體型。從基因的代換效應(yīng)來看，在外國商品豬種內(nèi)，F(xiàn)SH-Beta基因型為BB的母豬要比AA基因型母豬多產(chǎn)2頭仔豬，ESR基因型為BB的母豬也要比AA基因型的母豬多產(chǎn)2頭仔豬，然而單倍體型為BBBB的母豬也只比ABAA單倍體型的母豬多產(chǎn)2點多頭仔豬，顯然單倍體型的遺傳效應(yīng)不是各個基因型效應(yīng)的簡單之和。
在中國本地豬品種中，盡管基因型或單倍體型的效應(yīng)有細微的差別，趨勢和結(jié)論完全相同。
8、ESR基因與FSH-BETA基因的顯性度表6-1ESR基因和FSH-BETA基因在外來品種豬中的顯性度
a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(AA+BB)/2；D＝d/a.
表6-2ESR基因和FSH-BETA基因在中國地方豬種中的顯性度
a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(AA+BB)/2；D＝d/a.
這些結(jié)果與美國Rothschild研究組的結(jié)果(見表4)不大一致，可能是由于本實驗的樣本不夠大的原因?qū)е碌摹Ｍ瑫r也表明不在一定群體規(guī)?；A(chǔ)上的分析，其結(jié)果會有較大的差異，得到結(jié)論的參考價值大小也不一樣。
9、ESR基因與FSH-Beta基因單倍型與其它繁殖性狀(初生窩重，斷奶窩重，有效乳頭數(shù))及生產(chǎn)性狀之間(背膘厚，生長速度)的關(guān)系將有待于研究。
10、從ESR和FSH-Beta基因的單倍型分布來看，很明顯每個單倍型的樣本數(shù)還不夠大，而且在中國地方豬中沒有檢測到AAA單倍型，在外來品種豬中沒有檢測到BBBB單倍型，因而還應(yīng)該擴大樣本含量，進行大量的單倍型分析，以得到更有力的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
從上述我們開發(fā)的新的ESR基因多態(tài)性檢測方法和ESR基因和FSH-Beta基因多態(tài)性合并檢測的方法的實際應(yīng)用情況看，這兩種方法具有很好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。而且與以前的方法相比具有簡單快速、成本低、效率高等優(yōu)點，后者還具有多態(tài)信息含量高的獨特優(yōu)點，因此為豬的產(chǎn)仔數(shù)育種工作提供了很好的標(biāo)記輔助選擇或標(biāo)記輔助滲入的檢測標(biāo)記和方法。我們所測定的ESR基因的部分序列為ESR基因多態(tài)性檢測的分子標(biāo)記的開發(fā)提供了很好的參考信息。


圖13.7kb陽性克隆的正向測序結(jié)果。
圖23.7kb陽性克隆反向測序的結(jié)果。
圖3121bp PCR產(chǎn)物測序結(jié)果。
圖4不同檢測方法檢測ESR基因和FSH-Beta基因多態(tài)性結(jié)果。
圖5PSG5-EHO質(zhì)粒PvuII酶切。
圖61.8Kb探針回收結(jié)果。
圖7DIG標(biāo)記探針效率的檢測。
圖8豬耳組織基因組DNA。
圖9基因組DNA/PvuII酶切結(jié)果；M11Kb ladder，M2λDNA/HindIII Marker。
圖10不同品種豬基因組DNA的southern雜交結(jié)果；M1Kb Ladder，Ppositive controling(PSG5-EHO/EcoRI 1.8Kb回收片段)；1五指山，2大約克，3二花臉，4長白豬，5香豬，6杜洛克)。
圖11豬ESR基因的PCR結(jié)果；M為DNA分子量參照物(PBR322/HaeIII Marker)，其它各泳道為不同品種豬的PCR結(jié)果。
(PBR322/HaeIIIMarker587，540，504，458，434//267，234，213，192，184//124，123，109，89，80//64，57，51//21，18，11，8).
圖12豬ESR基因的PCR-RFLPs結(jié)果M為DNA分子量參照物(PBR322/HaeIII Marker)，1-11不同品種豬ESR基因的PCR-RFLPs結(jié)果(其中3、10、11、12泳道為AA型；1、2、4、8、9泳道為AB型；5、6、7泳道為BB型)。
圖13ESR基因的PCR擴增區(qū)的陽性克降酶切鑒定。
M11kb Ladder，M2PBR322/HaeIII Marker，1陽性克隆，2陽性對照(藍斑)。
圖14豬ESR基因的PCR-RFLPs結(jié)果1AA，2AB，3BB，4AA，5AB，MPBR322/HaeIII Marker。
圖15FSH-Beta基因PCR多態(tài)性分析結(jié)果。
(注1Kb Ladder12.216kb，11.198kb，10.180kb，9.162kb，8.144kb，7.126kb，6.108kb，5.090kb，4.072kb，3.054kb，2.036kb，1.636kb，1.018kb，506bp，396bp，344bp，298bp，200bp，154bp，134bp)。
圖16ESR基因和FSH-Beta基因的PCR結(jié)果。
圖17ESR基因和FSH-Beta基因的PCR-RFLPs結(jié)果。
1ABAB，2BBAB，3AABB，4ABAA，5BBBB，6AAAB，7AAAA，8BBAA，9ABBB，10AAAB，11ABAB，MPBR322/HaeIII Marker.(基因型FSH-BETA/ESR)。
權(quán)利要求
1.豬的雌激素受體(ESR)基因的部分序列，它是附圖1或2所述的序列。
2.檢測豬的ESR基因多態(tài)性的PCR-RFLPs方法，其特征之一將正向引物序列(引物I5′-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3′，和一條反向引物(引物III5′-CAGTTGAGAGCAAATCAATGCTAAG-3′)相結(jié)合，利用常規(guī)的PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件，酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件和PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶PvuII裂解，在2.5-3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測ESR基因的PCR-RFLPs多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中PCR反應(yīng)體系為2.5μl 10×Taq DNA聚合酶緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明膠)，2μl dNTPs(2.5mmol/L for each)，引物終濃度0.5μ mol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng，終體積25μl；PCR反應(yīng)條件94℃ 4分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘2個循環(huán)，然后94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘31個循環(huán)，最后72℃ 8分鐘，4℃長期保存；酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件10μl PCR產(chǎn)物，加入0.5μl(10U)的PvuII限制性內(nèi)切酶，37℃消化過夜(5-12小時)。
4.同時檢測豬的ESR基因和FSH-Beta基因的多態(tài)性的方法，其特征在于合成兩對檢測FSH-beta基因PCR-RFLPs多態(tài)的引物引物IV5′-ACTGGTCTATTCATCCTCTC-3′引物V5′-CCTTTAAGACAGTCAATGGC-3′將權(quán)利要求2所述的ESR基因多態(tài)檢測引物I、III和FSH-beta基因多態(tài)檢測引物IV、V合并，將兩對引物放于同一反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)，使用合適的PCR反應(yīng)條件，應(yīng)用該反應(yīng)體系在所述的PCR反應(yīng)條件下進行PCR反應(yīng)，然后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物用PvuII進行酶切，用4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，從而對不同品種豬的群體進行分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中PCR反應(yīng)體系為2.5μl 10×Taq DNA聚合酶緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明膠)，2μl dNTPs(2.5mmol/L for each)，引物終濃度0.5μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng。終體積25μl；PCR反應(yīng)條件94℃ 4分鐘58℃ 1分鐘70℃ 1分鐘1個循環(huán)，然后94℃ 1分鐘58℃ 1分鐘70℃ 1分鐘31個循環(huán)，最后72℃8分鐘，4℃長期保存；酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件10μl PCR產(chǎn)物，加入0.5μl(10U)的PvuII限制性內(nèi)切酶，37℃消化過夜(5-12小時)。
全文摘要
本發(fā)明涉及雌激素受體(ESR)基因的部分序列,以及一種新的檢測豬的ESR基因多態(tài)性的PCR－RFLPs方法,該方法改進了ESR基因的PCR－RFLPs的檢測方法,降低了檢測時瓊脂糖凝膠的濃度并同時提高PCR－RFLPs條帶分辨的清晰程度,使得ESR基因型的檢測更為經(jīng)濟而且簡單。本發(fā)明還公開了同時檢測豬的ESR基因和FSH－Beta基因的多態(tài)性的方法,該方法大大降低了兩個基因多態(tài)檢測中的成本,節(jié)約了時間和人力、物力,同時使檢測結(jié)果中雜合頻率大為提高,從而增加了分析結(jié)果的多態(tài)信息含量,為育種工作中標(biāo)記輔助選擇或標(biāo)記輔助滲入的工作提供了一個更為有效、簡便易行、多態(tài)信息含量更高的分子遺傳標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK1357625SQ00134188
公開日2002年7月10日 申請日期2000年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月8日
發(fā)明者李寧, 趙要風(fēng), 吳常信 申請人:李寧