專利名稱：真核細(xì)胞的增強(qiáng)內(nèi)轉(zhuǎn)譯因子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為真核細(xì)胞的多順?lè)醋踊虮磉_(dá)而構(gòu)建的增強(qiáng)內(nèi)轉(zhuǎn)譯因子及其應(yīng)用，具體涉及腦心肌炎病毒的增強(qiáng)內(nèi)轉(zhuǎn)譯因子及其應(yīng)用。
內(nèi)轉(zhuǎn)譯因子，也稱內(nèi)核蛋白體的進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。用IRES來(lái)驅(qū)使多種基因的轉(zhuǎn)譯和表達(dá)是近十年來(lái)發(fā)展的一種表達(dá)技術(shù)，尤其在近五年內(nèi)這種技術(shù)被研究得較多而且被廣泛地應(yīng)用于基因治療和重組蛋白表達(dá)的載體組建。其特點(diǎn)是兩個(gè)基因編碼順序利用IRES的連接存在于同一個(gè)信使RNA(mRNA)，使得兩個(gè)基因的表達(dá)相關(guān)相連。這在某些應(yīng)用上是有意義的，例如，當(dāng)要表達(dá)一個(gè)蛋白復(fù)合體的兩個(gè)亞基時(shí)，或者通過(guò)一個(gè)指示蛋白(如熒光蛋白)來(lái)監(jiān)測(cè)另一個(gè)藥用蛋白的表達(dá)工藝過(guò)程。最常用的IRES來(lái)自于腦心肌炎病毒(EMCV)。它已經(jīng)被美國(guó)專利局注冊(cè)(US Patent#4,937,190)。該專利中描述的是原始的較弱的IRES，沒(méi)有被突變修改過(guò)。
EMCV是最大動(dòng)物病毒族(小RNA病毒)之一，象小RNA病毒家族的其它成員一樣，EMCV具有一個(gè)單鏈RNA基因組。與大多數(shù)真核生物的mRNA不同，它的RNA基因在5′末端上缺乏一個(gè)常規(guī)帽型結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)為核糖體掃描模型所提出的。它的5′非轉(zhuǎn)譯區(qū)，其長(zhǎng)度為834核苷酸(nt)，并由多個(gè)AUG三聯(lián)體組成，據(jù)信可引起內(nèi)核糖體的結(jié)合并指導(dǎo)帽型獨(dú)立轉(zhuǎn)譯。在nt403和nt811間的一段較小EMCV區(qū)域，其內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)已被測(cè)定足以引導(dǎo)充分的轉(zhuǎn)譯(Jang，S.K and Wimmer，E.(1990)Genes & Development 4，1560-1572)。后來(lái)的研究已經(jīng)啟示EMCV-IRES屬于一組稱為類型IIIRES因子。上述類型IIIRES因子被認(rèn)為是在AUG密碼的起始位點(diǎn)上直接連接核糖體的。EMCV-IRES在細(xì)胞體(in vitro)外，以及在各類不同的細(xì)胞類型中，當(dāng)在沒(méi)有任何病毒編碼蛋白情況下，能充分起作用。因?yàn)檫@種重要特點(diǎn)，它在生物技術(shù)工業(yè)中已被廣泛利用來(lái)制造基因治療和異源基因表達(dá)的載體。這些載體能夠從一簡(jiǎn)單的mRNA(Kleiman，S.E.，Pastan，I.，Puck，J.M and gottesman，M.M.(1998)Gene Therapy 5，671-676)中共譯二個(gè)或多個(gè)編碼序列。通常情況下在這些雙順?lè)醋雍腿樂(lè)醋拥倪B接中，第二或第三基因的表達(dá)比第一基因表達(dá)的效率較低(低2到15倍)，然而，由EMCV-IRES片段所驅(qū)使的第二和第三基因的表達(dá)都是相近的(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。由于第一基因的轉(zhuǎn)譯被設(shè)計(jì)成是由帽型掃描機(jī)制驅(qū)使，這些結(jié)果表明了EMCV-IRES導(dǎo)致了一個(gè)比常規(guī)帽形掃描模型效率較低的轉(zhuǎn)譯。這種較低的轉(zhuǎn)譯效率在某些等量的二種或多種蛋白須要同時(shí)表達(dá)的應(yīng)用中可能很不理想。例如，表達(dá)一個(gè)受體的二個(gè)當(dāng)量亞基或一個(gè)抗體的重鏈和輕鏈時(shí)即如此。
本發(fā)明的目的是提供一組經(jīng)突變修飾的EMCV的IRES(EMCV-mIRES)，使用mIRES連接的串聯(lián)基因可以等量相關(guān)的表達(dá)，也即可以使第二或第三基因的表達(dá)增強(qiáng)。
本發(fā)明的目的是提供一種包含上述EMCV-IRES突變子的表達(dá)載體。
本發(fā)明的目的是提供一種用包含EMCV-IRES突變子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明目的是提供上述的任一種EMCV-IRES突變子在引導(dǎo)多個(gè)編碼基因在真核細(xì)胞中相關(guān)表達(dá)的應(yīng)用；在制備基因治療相關(guān)試劑中的應(yīng)用；蛋白表達(dá)在線監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明中的“相關(guān)表達(dá)”指二個(gè)或多個(gè)基因在真核細(xì)胞內(nèi)通過(guò)雙順?lè)醋踊蚨囗樂(lè)醋愚D(zhuǎn)錄物的共表達(dá)，下游基因的表達(dá)與上游有相互關(guān)系。
為了增強(qiáng)EMCV-IRES在多順?lè)醋舆B接中的轉(zhuǎn)譯功效，本發(fā)明引進(jìn)了一系列單一的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)原始IRES的3′-末端上進(jìn)行修改。原始EMCV-IRES的3’-末端結(jié)構(gòu)顯示出一個(gè)富于-嘧啶的序列和在富于-嘧啶序列與第二基因轉(zhuǎn)譯起始之間的空間距離的特征。雖然保守的富嘧啶序列被表明對(duì)有效的轉(zhuǎn)譯是極重要的，在它和AUG間的序列在不同的心病毒種屬及其菌株中而言并不是高度保守的，進(jìn)一步說(shuō)，該序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)(Sachs，A.B.，Sarnow，P andHetze，M.W.(1997)Cell 89，831-838)反而可能對(duì)IRES的轉(zhuǎn)譯效率較重要。因此，在空間距離中引進(jìn)一個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)來(lái)突變EMCV-IRES聽來(lái)很具合理性。對(duì)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，我們利用在體外選用的RNAaptamer序列，尤其是一個(gè)妥布拉霉素aptamer(Patel，d.，Suri，A.K.，Jiang，F(xiàn).，Jiang，L，F(xiàn)an，P.，Kumar，R.A.and Nonin，S.(1997)J.Mol.Biol.272，645-664)，這些序列簡(jiǎn)短適當(dāng)，而且它已被很好研究。在保留相似莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的前提下，設(shè)計(jì)了一系列突變，包括莖長(zhǎng)、序列等因素的改變。在EMCV-IRES 3’末端上引進(jìn)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)在功能上可分為二類，一類增強(qiáng)了下游eGFP的表達(dá)(例如mIRES0，mIRES3，圖2)；而另一類則減低了表達(dá)(如mIRES4，圖2)。比較這些結(jié)果是很有趣的，我們注意到單一的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)它代替了處于富嘧啶和轉(zhuǎn)譯起始間的原始序列，能夠提高下游eGFP的表達(dá)(圖3B和C)。而且這種能力很少受到小序列變化的影響，這些變化只要不影響莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(見圖2)。但是如果序列過(guò)長(zhǎng)也會(huì)影響到增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)移效率(Jang，S.K and Wimmer，E.(1990)Genes & Development 4，1560-1572)。這顯然是真的，即使對(duì)第二基因的KOZAK序列進(jìn)行改變(如mIRES3)，這種提高下游表達(dá)的能力還是很少受影響。由此表明IRES引導(dǎo)的轉(zhuǎn)譯可能獨(dú)立于KOZAK原理。然而，當(dāng)這種二級(jí)結(jié)構(gòu)受到修改，如刪除一個(gè)在環(huán)上的核苷酸，并略為增加莖的長(zhǎng)度(圖2，mIRES4)，其效應(yīng)在GFP表達(dá)(圖3D)上，呈現(xiàn)相反的激烈減縮。這些結(jié)果表明了引進(jìn)mIRES0，mIRES3莖-環(huán)結(jié)構(gòu)在增強(qiáng)轉(zhuǎn)譯效應(yīng)上起著重要作用。
本發(fā)明優(yōu)選了二種典型的有利突變的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)mIRES0、mIRES3。
EMCV-mIRES突變修飾產(chǎn)生的方法。這些變更是靠PCR亞克隆化完成的。一個(gè)PCR正向引物，CCT CTG GAA GCT TCT TGAAGA被合成，它跨越EMCV-IRES的中心區(qū)域，并擁有一個(gè)原始的HindIII位點(diǎn)(在引物中部以斜體字顯示)。一組反向引物被設(shè)計(jì)在近IRES的3’末端，包括在其中部的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)和在引物5’末端的一個(gè)Ncol位點(diǎn)。然后完成的PCR反應(yīng)產(chǎn)生HindIII-Ncol IRES，它們帶有在3’末端上(


圖1，圖2)突變結(jié)構(gòu)的片段。這些PCR片段和一個(gè)蛋白編碼序列eGFP的Ncol-Xhol片段，eGFP是從peGFP-C1(Clontech，Palo Alto，.CA)來(lái)的，靠標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)，被插入載體pCep4-eBFP-IRES-eGFP中。構(gòu)建了含EMCV-mIRES的表達(dá)載體，如pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP。
上述含EMCV-mIRES的表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。如可用脂質(zhì)體方法把DNA轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)(LifeTech.試劑盒)。
EMCV-mIRES篩選的方法等。采用兩個(gè)不同的綠色熒光蛋白作為第一、第二編碼序列，用mIRES連接，在活的哺乳細(xì)胞中表達(dá)，選擇可導(dǎo)致各熒光蛋白等量相關(guān)表達(dá)的EMCV-mIRES結(jié)構(gòu)，即為所需。綠色熒光蛋白可以是BFP、CFP、GFP、YFP。eBFP和eGFP二者的表達(dá)已被先前發(fā)表的液相流動(dòng)細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FCM)的檢測(cè)方法所測(cè)定和計(jì)量(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。
流動(dòng)細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FCM)。簡(jiǎn)言之，表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48到72小時(shí)后，細(xì)胞用一種FACS Vantage TM(Becton-Dickinson，San Jose，CA)流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)分析。用二個(gè)Innova305(Coherent Laser Group相干激光公司，Santa Clara，CA)多線Ar激光器撥置到360-nm和488-nm上而產(chǎn)生激發(fā)波長(zhǎng)。過(guò)濾探測(cè)構(gòu)型對(duì)FLI/FL2光徑使用一個(gè)525-nm短路二色鏡，而對(duì)FLI(eGFP熒光)探測(cè)器則采用一個(gè)510/20的通帶濾器。對(duì)eBFP的蘭色熒光靠用一個(gè)在FL4探測(cè)器中的405/20通帶濾器而測(cè)得。過(guò)濾器購(gòu)自O(shè)mega Optical光學(xué)公司(Brattleboro，VT)。正向和側(cè)散射被用來(lái)設(shè)置一個(gè)收集通道，死亡的細(xì)胞及廢渣因此可通過(guò)此通道而除去。在GFP和BFP熒光間未見光譜重疊，因此在實(shí)驗(yàn)中不需補(bǔ)償。對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用了一覽明細(xì)的公式來(lái)收集一萬(wàn)到五萬(wàn)次。用CellQuestTM v.3.0在蘋果Apple Power MacIntosh G3計(jì)算機(jī)上獲得并分析了數(shù)據(jù)。
流動(dòng)細(xì)胞計(jì)量術(shù)可分析多順?lè)醋樱嗷驑?gòu)建在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，例如，四個(gè)雙串連eGFP和eBFP的構(gòu)建，即原始的IRES和IRES的三個(gè)修改物，mIRES0，mIRES3和mIRES4的表達(dá)分析。圖3展示了四個(gè)被完成實(shí)驗(yàn)之一的代表數(shù)據(jù)。原始的IRES結(jié)構(gòu)(圖3A)展示了相當(dāng)多的轉(zhuǎn)染細(xì)胞種群，在第一和第三對(duì)數(shù)值間測(cè)到胞內(nèi)熒光，并測(cè)到了共表達(dá)的eGFP(FL1)和eBFP(FL4)。我們觀察到在共表達(dá)細(xì)胞中，GFP和BFP強(qiáng)度之間有一個(gè)直接的相互關(guān)系?？啃薷腎RES，我們觀察到了GFP強(qiáng)度的重要的改變。這種改變來(lái)自于雙串連結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中。例如，mIRES0的修改導(dǎo)致GFP的強(qiáng)度上移了(圖3B)0.5-1.0的對(duì)數(shù)值。mIRES3的修改相對(duì)于原始的IRES而言，也導(dǎo)致相似的增強(qiáng)(圖3C)。然后使用mIRES4的修改(圖3D)我們也觀察到了有害的效果，GFP的強(qiáng)度被嚴(yán)重地減弱了。
四個(gè)各別的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是對(duì)不同增殖年令數(shù)的293細(xì)胞進(jìn)行的。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，右上方種群(quadrant population)，亦即GFP和BFP共表達(dá)的細(xì)胞種群被測(cè)定了。表1以MFI’s的平均值總結(jié)了從四個(gè)各別轉(zhuǎn)染來(lái)的結(jié)果。作為比較對(duì)照，GFP(MF1＝1645)或BFP(MF1＝39)的單一構(gòu)造結(jié)果也被提供了。對(duì)一個(gè)親體的雙重構(gòu)造(peBFP-IRES-eGFP)，其GFP的MFI平均值的比單一構(gòu)造低二、三倍(729比1645)，而其BFP的MFI平均值則不太受影響，它證實(shí)了一個(gè)較弱IRES-驅(qū)使的表達(dá)。為了增加表達(dá)水平，使用了一個(gè)哺乳類附加型的載體(pCep4)，來(lái)帶有相同親體的雙重連接，即pCep4-eBFP-IRES-eGFP。與peBFP-IRES-eGFP構(gòu)造比較，GFP和BFP二者的MFI在附加型的載體中都顯示了略高的水平。mIRES0和mIRES3的修改顯示了GFP胞內(nèi)的熒光平均值比其親體IRES來(lái)得高(分別為3506和2717)。另一方面，mIRES4與其親體IRES比較而言，其GFP胞內(nèi)熒光平均值(157)是極其弱的。在mIRES0和mIRES3中，來(lái)自位于IRES 5’的BFP表達(dá)所引發(fā)的熒光和在原始IRES中的BFP熒光顯現(xiàn)相似。它表明了此修改對(duì)上游基因表達(dá)的影響甚小，而對(duì)其下游eGFP表達(dá)的增強(qiáng)并非以犧牲上游基因作為代價(jià)的。用熒光顯微鏡觀察，這些結(jié)果是一貫的。
表1 通過(guò)FCM測(cè)量帽形-和IRES-驅(qū)使的GFP表達(dá)GFP Constructs Blue MFI Green MFIpeBFP-N1 39peGFP-N1 1645pIRES-eGFP11 167peBFP-IRES-eGFP 61 729pCep4-eBFP-IRES-eGFP 83 1205pCep4-eBFP-m IRES0-eGFP 94 3506pCep4-eBFP-m IRES3-eGFP 77 2717pCep4-eBFP-m IRES4-eGFP 183 157表中peBFP-N1，peGFP-N1來(lái)自Clontech，第3至第5個(gè)質(zhì)粒來(lái)源(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。
另外。為證實(shí)從修改過(guò)的IRES來(lái)的mRNAs的完整性，作了Northen印跡法的分析(圖4)。正如預(yù)期的那樣，用不同修改過(guò)的IRES構(gòu)造(9-13電泳泳道)以及原始IRES構(gòu)造(第6和第8泳道)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞展示出一個(gè)長(zhǎng)度類似的mRNA條帶，其長(zhǎng)度約為2.6千堿基(圖4)。這些結(jié)果表明IRES 3’末端的修改并未改變轉(zhuǎn)錄物的大小，而eBFP和eGFP的表達(dá)極可能是來(lái)自被各種IRES片段所連接的雙順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄物。因此其轉(zhuǎn)譯功效有了顯著的提高，這已通過(guò)檢測(cè)IRES下游的熒光蛋白的表達(dá)水平有所證實(shí)。
綜上所述，本發(fā)明的EMCV-mIRES可以使多個(gè)編碼基因在1比1當(dāng)量水平表達(dá)。如果將需要表達(dá)的蛋白基因代替熒光蛋白基因，則可廣泛應(yīng)用于遺傳工程領(lǐng)域。
EMCV-IRES突變子可用于引導(dǎo)多個(gè)編碼基因在真核細(xì)胞中相關(guān)表達(dá)的應(yīng)用。本發(fā)明所述的EMCV增強(qiáng)IRES能使其連接的上游和下游基因表達(dá)水平相當(dāng)接近，而非象原始的IRES其下游的基因表達(dá)比上游基因表達(dá)要低十多倍。這一特點(diǎn)能使一個(gè)復(fù)合蛋白的兩個(gè)亞基的表達(dá)相當(dāng)，減少由于兩個(gè)亞基表達(dá)的水平不一樣而可能導(dǎo)致的有害作用。例如有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)抗體的重鏈和輕鏈表達(dá)不平衡時(shí)，重鏈多而輕鏈少，累積的重鏈就會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒性。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是兩個(gè)亞基的相當(dāng)表達(dá)可以減少浪費(fèi)，不會(huì)使任一亞基累積無(wú)用。具體方法是參照上述EMCV-mIRES引入的方法，將eBFB和eGFP編碼序列用目的蛋白的編碼序列替代，按標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)裝入載體，轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，在表達(dá)目的蛋白的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，獲得產(chǎn)物。
EMCV-IRES突變子在制備基因治療相關(guān)試劑中的應(yīng)用。例如將EMCV-mIRES及其連接的基因引入用于基因治療的載體中，再采用本領(lǐng)域常規(guī)的基因治療技術(shù)進(jìn)行。Kleiman，S.E.，Pastan，I.，Puck，J.M.and Gottesman，M.M.(1998)Gene Therapy 5，671-676.；Zhou，Y.，Aran，J.，Gottesman，M.M.and Pastan，I.(1998)Human Gene Therapy 9，287-293.。
EMCV-IRES突變子在蛋白表達(dá)在線監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。尤其在藥用蛋白和工業(yè)用蛋白生產(chǎn)中。當(dāng)用它把藥用蛋白和熒光蛋白(GFP)聯(lián)起來(lái)(通過(guò)重組技術(shù))即能以1比1的比例把兩種蛋白的關(guān)系如實(shí)的相關(guān)起來(lái)。測(cè)定GFP是極其簡(jiǎn)便，快速而且不會(huì)影響到動(dòng)物細(xì)胞的正常生理狀態(tài)(Gilbert，P.A.，Garnier，A.，Jacob，D.AndKamen，A.(2000))。因此藥用蛋白的生產(chǎn)工藝流程也可得到在線監(jiān)測(cè)，及時(shí)報(bào)告生產(chǎn)狀況。也可以使目前的工藝篩選跟蹤縮短十倍的時(shí)間，成本降低十到一千倍。這種方法本身已經(jīng)用于數(shù)種藥用蛋白的生產(chǎn)而得到證實(shí)。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于EMCV-IRES突變子的轉(zhuǎn)譯效率能夠增加到象帽形轉(zhuǎn)譯水平那樣的相同水平，而其第一和第二順?lè)醋拥谋磉_(dá)以線形形式而相互關(guān)聯(lián)。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述。
圖1.用莖-環(huán)結(jié)構(gòu)引起EMCV-IRES 3’-末端修改的策略。
圖2.在mIRES 3’-末端上的具有代表性的莖-環(huán)序列。在下游eGFP的AUG上的Ncol點(diǎn)下面已被劃線。
圖3.增強(qiáng)的IRES元素的FACS分析。
圖4.各種單順?lè)醋雍碗p順?lè)醋覩FP轉(zhuǎn)錄物的Northen印跡法分析。
泳道1，無(wú)DNA；2，peBFP-N1；3，peGFP-N1 4，peYFP-N1；5，pIRES-eGFP；6，peBFP-IRES-eGFP；7，pCep4-eGFP；8，pCep4-eBFP-IRES-eGFP；9，pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP；10，pCep4-eBFP-mIRES 1-eGFP；11，pCep4-eBFP-mIRES2-eGFP；12，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP；13，pCep4-eBFP-mIRES4-eGFP；14，pCep4-eBFP-IRES-eGFP-IRES-eYFP。
實(shí)施例1 EMCV-IRES 3′末端上的突變方法這些變更是靠PCR亞克隆化完成的。引物合成一個(gè)PCR正向引物，CCT CTG GAA GCT TCT TGA AGA被合成，它跨越EMCV-IRES的中心區(qū)域，并擁有一個(gè)原始的HindIII位點(diǎn)(在引物中部以斜體字顯示)。
一組反向引物被設(shè)計(jì)在近IRES的3’末端，包括在其中部的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和在引物5’末端的一個(gè)Ncol位點(diǎn)以及在3’末端的富嘧啶序列。PCR反應(yīng)靠標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Perkin-Elmer Corp，F(xiàn)oster City，CA)。
產(chǎn)生HindIII-Ncol IRES，它們帶有在3’末端上(
圖1，圖2)突變結(jié)構(gòu)的片段。這些PCR片段和一個(gè)編碼eGFP的Ncol-Xhol片段，它從peGFP-C1(Clontech，Palo Alto，CA)來(lái)的，靠標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版))，被插入pCep4-eBFP-IRES-eGFP載體中(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry37，51-59)。
實(shí)施例2 增強(qiáng)的IRES元素的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和FACS分析。
mIRES表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人的293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染技術(shù)用脂質(zhì)體方法把DNA轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)(Life Tech.試劑盒)。在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48到72小時(shí)后細(xì)胞被收獲。采用前述所設(shè)置的濾器和檢測(cè)器對(duì)同時(shí)發(fā)生的蘭色(FL4，eBFP)和綠色(FL1，eGFP)熒光發(fā)射進(jìn)行分析。雙重激發(fā)的Ar-激光線(360-nm和488-nm)被使用了(見圖3)。
在四個(gè)各別實(shí)驗(yàn)中按不同的實(shí)驗(yàn)日期，用不同增殖年齡數(shù)的細(xì)胞，人的293細(xì)胞被8個(gè)不同的單一基因或雙重串聯(lián)基因構(gòu)造而分別轉(zhuǎn)染。根據(jù)模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照來(lái)劃分四個(gè)散型區(qū)域。平均熒光強(qiáng)度[MFls]是從有效區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞點(diǎn)數(shù)來(lái)測(cè)定。通過(guò)n＝4實(shí)驗(yàn)，取得MFIs的平均值。所得的平均數(shù)據(jù)的方差系數(shù)少于40％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
實(shí)施例3 各種單順?lè)醋雍碗p順?lè)醋覩FP轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡法分析293細(xì)胞是用下列質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)染，2，peBFP-N1；3，peGFP-N1 4，peYFP-N1；5，pIRES-eGFP；6，peBFP-IRES-eGFP；7，pCep4-eGFP；8，pCep4-eBFP-IRES-eGFP；9，pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP；10，pCep4-eBFP-mIRES1-eGFP；11，pCep4-eBFP-mIRES2-eGFP；12，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP；13，pCep4-eBFP-mIRES4-eGFP；14，pCep4-eBFP-IRES-eGFP-IRES-eYFP。并使用Northern印跡法進(jìn)行分析。質(zhì)粒2-4購(gòu)自Clontech公司，其余質(zhì)粒按(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)構(gòu)建或按實(shí)施例1構(gòu)造。在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48到72小時(shí)后細(xì)胞被收獲。總的RNA樣品都從293細(xì)胞中提取。具體方法按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)。
權(quán)利要求
1.一組腦心肌炎病毒的增強(qiáng)轉(zhuǎn)譯因子(EMCV-IRES)突變子，其特征在于EMCV-IRES的3′-末端的結(jié)構(gòu)改變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EMCV-IRES突變子，其特征在于EMCV-IRES的3′-末端引入一個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的EMCV-IRES突變子，莖-環(huán)由下述序列之一形成(1)GAG-GUUUAGCUACACUA(2)UAG-GUUUAGCUACGCU
4.包含權(quán)利要求1、2或3所述EMCV-IRES突變子的表達(dá)載體。
5.一種用包含1、2或3所述的EMCV-IRES突變子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1、2或3的任一種EMCV-IRES突變子用于引導(dǎo)多個(gè)編碼基因在真核細(xì)胞中相關(guān)表達(dá)的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1、2或3的任一種EMCV-IRES突變子在制備基因治療相關(guān)試劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1、2或3的任一種EMCV-IRES突變子在蛋白表達(dá)在線監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
一種增強(qiáng)內(nèi)轉(zhuǎn)譯因子及其用途。在腦心肌炎病毒增強(qiáng)轉(zhuǎn)譯因子(EMCV－IRES)的3′末端引入莖－環(huán)結(jié)構(gòu)的修飾,新的增強(qiáng)轉(zhuǎn)譯因子可以使連接的串聯(lián)基因等量相關(guān)表達(dá)。本發(fā)明同時(shí)提供該類EMCV－IRES突變子在引導(dǎo)多個(gè)編碼基因在真核細(xì)胞中相關(guān)表達(dá)的應(yīng)用;在制備基因治療相關(guān)試劑中的應(yīng)用;蛋白表達(dá)在線監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。還提供了含EMCV－IRES突變子的表達(dá)載體及宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1361131SQ0013720
公開日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
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