專利名稱：一種肝癌靶向性基因表達(dá)元件ae及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及基因表達(dá)調(diào)控，具體地說(shuō)，涉及一種特異性針對(duì) 甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌的靶向性基因表達(dá)元件AE的設(shè)計(jì)、制備及其在甲胎蛋白陽(yáng) 性的肝癌細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)細(xì)胞內(nèi)加工后可以有效地抑制肝癌細(xì) 胞內(nèi)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)新的蛋白質(zhì)合成因完整的真 核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物缺乏而無(wú)法進(jìn)行，從而達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的 作用。本發(fā)明可用于制備靶向性腫瘤基因治療藥物。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是目前人類主要"殺手"之一，近年來(lái)隨著人們生活方式及環(huán)境的 改變，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在許多城市已成為第一位死亡原因，在農(nóng)村位列 第二位。肝癌在我國(guó)是最常見(jiàn)的危害極大的惡性腫瘤之一，和肺癌、胃腸道腫 瘤、乳癌等其它常見(jiàn)惡性腫瘤相比，目前的手術(shù)和化療等常規(guī)方式的療效和預(yù) 后均不理想。
被稱為腫瘤治療新模式的生物治療目前正顯示出越來(lái)越良好的應(yīng)用前景。 在各種腫瘤生物治療手段中，基因治療始終是一個(gè)主要方向，我國(guó)研制的世界 上第一個(gè)正式進(jìn)入臨床使用的基因藥物、針對(duì)許多腫瘤細(xì)胞中發(fā)生突變的抑癌 基因p53的、可表達(dá)野生型p53的腺病毒注射液"今又生"即是其代表。隨著醫(yī) 學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)和知識(shí)的飛速發(fā)展，各種先進(jìn)的分子生物學(xué)手段都運(yùn)用到腫 瘤的基因治療研究中。但是由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及眾多基因，而目前的研究 大都僅針對(duì)個(gè)別靶基因，因此，這些研究雖然都顯示出較好的細(xì)胞水平的體外 抑瘤效果甚至荷瘤動(dòng)物模型的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)，但實(shí)際效果并不理想。因此，探 索、嘗試新的腫瘤基因治療手段具有十分重要的意義。
正常細(xì)胞在各種致癌因素的作用下逐漸發(fā)生變化直至最后發(fā)生癌變，有相 當(dāng)多的基因表現(xiàn)出過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象，尤其是一些促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲等惡性表 型的基因的過(guò)量表達(dá)。針對(duì)腫瘤中異常表達(dá)的基因，人們?cè)O(shè)計(jì)了許多耙向性基 因治療的方法，其中以封閉促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲等相關(guān)基因的表達(dá)的研究是一 個(gè)相當(dāng)熱門的領(lǐng)域。在以往大量的研究中，人們利用反義RNA(antisense RNA) 對(duì)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)基因進(jìn)行封閉，但由于反義RNA本身存在的限制，這類研 究在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、控制細(xì)胞侵襲遷移等方面雖然取得了較大的成績(jī)，其封閉基因表達(dá)的效果仍不理想。
小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的發(fā)現(xiàn)為人為干預(yù)細(xì)胞中基 因的表達(dá)提供了一個(gè)有力的工具。利用化學(xué)合成的雙鏈形式的siRNA，或是由 III型啟動(dòng)子帶動(dòng)轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)類似的小發(fā)卡樣RNA (small hairpin RNA, shRNA)，可以通過(guò)序列特異性匹配原則降解靶基因，從而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn) 行有效的抑制，因此也被嘗試應(yīng)用于基因治療。但是由于化學(xué)合成的siRNA代 價(jià)太高，而shRNA的表達(dá)又不利于調(diào)控，這些因素大大地限制了這一技術(shù)的 應(yīng)用。
微小RNA (microRNA)是細(xì)胞內(nèi)天然存在的一種小分子RNA，是在基因 轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行表達(dá)調(diào)控的一種重要方式，能在序列完全匹配的情況下降解靶 基因mRNA，也可以在序列非完全匹配的情況下抑制靶基因的翻譯，是目前生 命科學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，在腫瘤相關(guān)microRNA方面也有大量研究，而 且大都集中在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間表達(dá)有差異的各種天然microRNA的發(fā) 現(xiàn)以及功能鑒定。
由于天然microRNA是由II型啟動(dòng)子帶動(dòng)轉(zhuǎn)錄，因此如果人工設(shè)計(jì)類似的 microRNA分子，也應(yīng)該可以由II型啟動(dòng)子引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，而II型啟動(dòng)子的特點(diǎn)是 其轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)功能可以調(diào)控，所以其下游的人工miRNA的表達(dá)應(yīng)該可以受到人 為控制，而microRNA的作用方式最近的一些文獻(xiàn)報(bào)道已證實(shí)這一設(shè)想。
在本發(fā)明中我們選擇細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成這一重要環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)人工 microRNA的序列，抑制蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的重要蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過(guò)阻斷蛋 白質(zhì)合成而使細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖停止。由于蛋白質(zhì)的合成是一個(gè)復(fù)雜而又精密調(diào) 控的過(guò)程，需要由十幾個(gè)真核細(xì)胞翻譯起始因子組成的起始復(fù)合物引導(dǎo)mRNA 結(jié)合于核糖體、啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯，其中真核細(xì)胞翻譯起始因子4E負(fù)責(zé)結(jié)合 mRNA的5，帽結(jié)構(gòu)，具有重要的作用，因此對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的抑 制將有效阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的啟動(dòng)，從而使細(xì)胞因缺少完整的翻譯起始復(fù) 合物而停止新的蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。
為了達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性作用，針對(duì)我國(guó)高發(fā)的、惡性程度高、療效 及預(yù)后均較差的肝癌這一瘤種，利用在正常細(xì)胞中不表達(dá)但在肝癌細(xì)胞中高表 達(dá)的肝癌細(xì)胞特異性甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的特點(diǎn)，重組了 AFP 基因上游的表達(dá)調(diào)控序列，用來(lái)調(diào)控人工設(shè)計(jì)的microRNA的表達(dá)。這一基因 表達(dá)元件在導(dǎo)入正常細(xì)胞后不會(huì)有任何表達(dá)，而在導(dǎo)入AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞 后，可以表達(dá)出相應(yīng)的microRNA并有效地阻斷肝癌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，從而達(dá)到靶向性抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
基于本發(fā)明的思路，還可以以真核細(xì)胞翻譯起始因子4E基因的其它位點(diǎn) 做為靶序列進(jìn)行人工microRNA的設(shè)計(jì)，或是以細(xì)胞蛋白質(zhì)合成途徑中其它重 要基因作為耙基因來(lái)進(jìn)行細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的阻斷，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供的一種肝癌靶向性基因表達(dá)元件AE，為一種DNA分 子，具有SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。其中第7位至第827位為人甲胎 蛋白(AFP)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第-4113位至第-3292位，該區(qū)域含有多個(gè)轉(zhuǎn) 錄增強(qiáng)因子和肝細(xì)胞核因子結(jié)合位點(diǎn)；第831位至第1012位為人甲胎蛋白
(AFP)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第-182位至第-l位，該區(qū)域含有AFP的基本啟 動(dòng)子功能；從第1位至第1012位的1012 bp片段組成重組的AFP陽(yáng)性細(xì)胞表 達(dá)調(diào)控序列；第1019位至第1828位為6個(gè)串聯(lián)連的針對(duì)人真核細(xì)胞翻譯起始 因子4E基因的人工設(shè)計(jì)的microRNA;第1829位至第2177位為牛生長(zhǎng)激素基 因多聚腺苷酸信號(hào)區(qū)，為基因表達(dá)提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該表達(dá)元件AE在制備甲胎蛋白(AFP)陽(yáng)性 的肝癌的靶向基因治療藥物中的應(yīng)用。該表達(dá)元件AE在導(dǎo)入AFP陽(yáng)性的腫瘤 細(xì)胞后，可以在細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的人工microRNA， 并有效抑制細(xì)胞內(nèi)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的表達(dá)，進(jìn)而影響到細(xì)胞中完整 的翻譯起始復(fù)合物的形成，最終阻斷蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。
該表達(dá)元件AE可構(gòu)建靶向性基因治療藥物載體，用于AFP陽(yáng)性的肝癌的 靶向基因治療。該表達(dá)元件中的重組AFP表達(dá)調(diào)控元件可用于調(diào)控其它基因 的表達(dá)、針對(duì)人真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的人工microRNA序列可以用于其 它表達(dá)載體達(dá)到抑制相應(yīng)細(xì)胞中真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的表達(dá)目的。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果利用本發(fā)明提供的表達(dá)元件 可以制備的基因治療藥物，其特點(diǎn)在于以肝癌細(xì)胞特異性表達(dá)的胚胎性抗原 AFP為腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)調(diào)控手段、以腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)合成 中所需的翻譯起始復(fù)合物中關(guān)鍵蛋白真核細(xì)胞翻譯起始因子4E為作用靶點(diǎn)進(jìn) 行表達(dá)抑制，有效地阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，特異性地抑制AFP陽(yáng)性的肝癌 細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。


圖1為重組AFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列構(gòu)建PCR產(chǎn)物電泳圖。
圖2為針對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的人工microRNA構(gòu)建PCR產(chǎn)物電泳圖。
圖3為pDC312-AE酶切鑒定電泳圖。
圖4為Western blot法檢測(cè)AE對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E表達(dá)的抑制。 圖5為MTT法檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明，但 不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1:
重組AFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列的克隆
首先從GenBank檢索得到人AFP基因的mRNA序列(GenBank登錄號(hào) NM—001134)，然后再經(jīng)網(wǎng)上基因組比對(duì)分析方法從GenBank中得到人包括 AFP基因在內(nèi)的第4號(hào)染色體的基因組序列(GenBank登錄號(hào):NTJ)06216.14)， 并以AFP基因mRNA序列為基準(zhǔn)，將其5'端作為AFP基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，根據(jù) 其上游的基因組序列設(shè)計(jì)合成 引物1: 5'-AGA TCT CAG ATT GAA TTA TTT GCCTGTCA國(guó)3'、弓l物2: 5，國(guó)GGA TCC TAG GAA GTT TTC GCA ATA ATA C國(guó)3 ，、引物3:5 ，國(guó)AGA TCT GCC CCA AAG AGC TCT GTG T-3 ，和引物4:5 ，國(guó)GGA TCC AAA TCA TGC TGA AAT TCT TTT ATA CTC-3 ，，利用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)
(Polymerase Chain Reaction, PCR)以人肝癌細(xì)胞SMMC7721的基因組DNA 為模板，用上述引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增(引物1與引物2、引物3與引物4)，獲得 擴(kuò)增產(chǎn)物A(821 bp)和B(180bp)，參見(jiàn)圖1，其中泳道1，4為lkbDNALadder， 泳道2為擴(kuò)增產(chǎn)物A (821bp)，泳道3為擴(kuò)增產(chǎn)物B (180bp)。
將擴(kuò)增產(chǎn)物A、 B以T-A克隆的方式分別克隆至pGEM T-easy載體
(Promega公司，美國(guó))，經(jīng)DNA序列測(cè)定并與基因組序列(NT_006216.14) 核對(duì)驗(yàn)證其正確性。然后將A經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和BglII雙酶切后連至 B的5，端的BglII位點(diǎn)，成為重組的AFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列。
實(shí)施例2:
針對(duì)人真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的人工microRNA的克隆
從GenBank檢索得到人真核細(xì)胞翻譯起始因子4E基因的mRNA序列 (GenBank登錄號(hào)NM_001968)，利用網(wǎng)上軟件分析該mRNA序列上合適的 位點(diǎn)，確定人工microRNA的作用靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成引物1:5'-TGC TGT TGA CAGTA畫3，、引物2: 5，- TCC GAG GCA GTA GGC ATG GAG CAC TAG TTT GAT TAT TAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TA -3 ，、引物3: 5 ，-AGA TCT GAT CCA AGA AGG TAT ATT GCT GTT GAC AGT GAG CG-3，和引物4: 5'國(guó)GGA TCC ATC GTA GCC CTT GAA GTC CGA GGC AGT AGG CA-3 ，。先將引物1和引物 2進(jìn)行重疊延伸PCR，得到97 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物C，再以此擴(kuò)增產(chǎn)物C為模板， 用引物3和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到142 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物D，參見(jiàn)圖2，其 中泳道1為DL2000 DNALadder，泳道2為擴(kuò)增產(chǎn)物D (142bp)。
以T-A克隆的方式克隆至pGEM T-easy載體，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證其正確性。 此即針對(duì)人真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的人工microRNA序列。為了加強(qiáng)其作 用效果，用限制性內(nèi)切酶BamH I和BglII雙酶切后回收該人工microRNA序 列并重新插入同一載體的BamH I位點(diǎn)，獲得6個(gè)串聯(lián)連接的人工microRNA 序列。
實(shí)施例3:
肝癌靶向性基因表達(dá)元件AE的構(gòu)建及腺病毒載體的制備
首先構(gòu)建pDC312-BGHpA載體將腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312載體(Microbix 公司，美國(guó))用限制性內(nèi)切酶XbaI單酶切開(kāi)，用Klenow酶補(bǔ)平，再用限制 性內(nèi)切酶HindIII單酶切，去掉Xba I到HindIII之間的部分(從HindIII、 Sac I 、 Ecll36H、 Accl、 Sal I到Xba I )，回收部分一端為平端，另一端為HindIII 粘性末端。pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司，美國(guó))用限制性內(nèi)切酶PvuII 和HindIII雙酶切，回收包括HindIII、 Asp718、 Kpn I 、 BamH I 、 BstXI、 EcoR I 、 EcoRV、 BstXI、 Not I 、 Xho I 、 Xba I 、 DraII 、 Apa I和Pme I多克隆位點(diǎn) 和牛生長(zhǎng)因子基因多聚腺苷酸信號(hào)(BGHpA)的片段， 一端為HindIII粘性末 端，另一端為PvuII的平端。將上述兩個(gè)片段連接起來(lái)，即成pDC312-BGHpA 載體，可在多克隆位點(diǎn)上插入啟動(dòng)子和目的基因編碼區(qū)。
再將實(shí)施例1中的重組AFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列從載體上用限制性內(nèi) 切酶BamH I和Bgl II雙酶切后回收，并插入pDC312-BGHpA的BamH I位點(diǎn)， 得到帶有重組AFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列和BGHpA的腺病毒穿梭質(zhì)粒。最后 將6個(gè)串聯(lián)連接的針對(duì)人真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的人工microRNA序列從 載體上用限制性內(nèi)切酶BamH I和BglII雙酶切后回收，插入此穿梭質(zhì)粒的 BamHl位點(diǎn)，得到帶有完整肝癌靶向性表達(dá)元件AE的腺病毒穿梭質(zhì)粒，酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期完全相符，參見(jiàn)圖3，其中泳道l為1Kb Plus DNAMarker; 泳道2為pDC312-AE經(jīng)BamH I 、 Bgl I 、 EcoR I酶切。
將上述帶有完整肝癌靶向性表達(dá)元件AE的腺病毒穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架 質(zhì)粒pBHGlox(ddta)El,3cre (Microbix公司，美國(guó))共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞293 細(xì)胞，得到帶有表達(dá)元件AE的腺病毒載體。
實(shí)施例4:
基因表達(dá)元件AE對(duì)AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的靶向性抑制
A、 Western blot法檢測(cè)AE對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E表達(dá)的抑制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞，按3xl()S細(xì)胞/孔的密
度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)使其貼壁并達(dá)到80%的匯合度。用培養(yǎng)基稀 釋上述帶有表達(dá)元件AE的腺病毒，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI) 為100pfli/cell和10pfu/cell感染細(xì)胞，48hr后中止作用，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn) 行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10X分離膠，5X濃縮膠)，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后與l : 1000稀釋抗真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.，美國(guó)，elF4E (P隱2): sc-9976)結(jié)合，室溫2hr后，用 TBST洗膜3次，再結(jié)合HRP標(biāo)記抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù) 有限公司)，再次洗膜，然后用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Roche公司，美國(guó))顯影，X 光片暴光。以GAPDH為內(nèi)參照，用HRP標(biāo)記的GAPDH抗體(上?？党缮?物技術(shù)有限公司)同樣結(jié)合、顯影及暴光。實(shí)驗(yàn)設(shè)帶綠熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的腺病毒感染和無(wú)腺病毒感染的細(xì)胞作對(duì)照。結(jié)果參 見(jiàn)圖4，顯示感染帶有表達(dá)元件AE的腺病毒的AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Hep3B中的 真核細(xì)胞翻譯起始因子4E表達(dá)明顯受到抑制。圖中G:帶AE腺病毒MOI分 別為100和10感染Hep3B肝癌細(xì)胞后真核細(xì)胞翻譯起始因子4E表達(dá)；GFP: 帶GFP腺病毒MOI分別為100和10感染Hep3B肝癌細(xì)胞后真核細(xì)胞翻譯起 始因子4E表達(dá)；N:未感染腺病毒的Hep3B肝癌細(xì)胞中真核細(xì)胞翻譯起始因 子4E表達(dá)。
B、 體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)(MTT法)
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Hep3B、 HepG2、 SMMC7721和乳癌細(xì)胞Bcap37 (非肝癌細(xì)胞)，按2><103細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)使其 貼壁。將帶AE的腺病毒以MOI為200pfii/ce11、 100pfU/cell、 50pfli/ce11、 10 pfu/cel1、 lpfo/cell和OpfU/cell感染細(xì)胞。在病毒感染4天后，每孔加入MTT 8溶液(5mg/ml) 20ul， 37。C繼續(xù)培養(yǎng)4hr，中止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清液，每孔 加入DMSO200ul，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè) 定各孔570nm波長(zhǎng)OD值。細(xì)胞存活率=(病毒作用組OD值/病毒未作用組 OD值)xl00%。每組設(shè)立5復(fù)孔，重復(fù)3遍。從圖5可以看出，不同MOI 的帶AE的腺病毒對(duì)不同的肝癌細(xì)胞Hep3B、 HepG2和SMMC7721的生長(zhǎng)均 有不同程度的抑制，而對(duì)乳癌細(xì)胞(非肝癌細(xì)胞)Bcap37則無(wú)明顯抑制。本發(fā)明涉及的序列
<120>—種肝癌靶向性基因表達(dá)元件AE及其應(yīng)用 <160>9
<210> 1 <211>2177 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞特異性表達(dá)元件AE序列
<400> 1
DNASIS
SEQ
agatctcaga ttgaattatt tgcctgtcat acagctaata attgaccata agacaattag 60 atttaaatta gttttgaatc tttctaatac caaagttcag tttactgttc catgttgctt 120 ctgagtggct tcacagactt atgaaaaagt aaacggaatc agaattacat caatgcaaaa 180 gcattgctgt gaactctgta cttaggacta aactttgagc aataacacat atagattgag 240 gattgtttgc tgttagtata caaactctgg ttcaaagctc ctctttattg cttgtcttgg 300 aaaatttgct gttcttcatg gtttctcttt tcactgctat ctatttttct caaccactca 360 catggctaca ataactgtct gcaagcttat gattcccaaa tatctatctc tagcctcaat 420 cttgttccag aagataaaaa gtagtattca aatgcacatc aacgtctcca cttggagggc 480 ttaaagacgt ttcaacatac aaaccgggga gttttgcctg gaatgtttcc taaaatgtgt 540 cctgtagcac atagggtcct cttgttcctt aaaatctaat tacttttagc ccagtgctca 600 tcccacctat ggggagatga gagtgaaaag ggagcctgat taataattac actaagtcaa 660 taggcataga gccaggactg tttgggtaaa ctggtcactt tatcttaaac taaatatatc 720 caaaactgaa catgtactta gttactaagt ctttgacttt atctcattca taccactcag 780 ctttatccag gccacttatt tgacagtatt attgcgaaaa cttcctagga tctgccccaa 840 agagetctgt gtccttgaac ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa 900 atgtcccatt ttcaacctaa ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta 960 ctagttaaca ggcattgcct gaaaagagta taaaagaatt tcagcatgat ttggatctga 1020 tccaagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgcggagca ctagtttgat tattatagtg 1080 aagccacaga tgtataataa tcaaactagt gctccatgcc tactgcctcg gacttcaagg 1140 gctacgatgg atctgatcca agaaggtata ttgctgttga cagtgagcgc ggagcactag 1200 tttgattatt atagtgaagc cacagatgta taataatcaa actagtgctc catgcctact 1260 gcctcggact tcaagggcta cgatggatct gatccaagaa ggtatattgc tgttgacagt 1320 gagcgcggag cactagtttg attattatag tgaagccaea gatgtataat aatcaaacta 1380 gtgctccatg cctactgcct cggacttcaa gggctacgat ggatctgatc caagaaggta 1440 tattgctgtt gacagtgagc gcggagcact agtttgatta ttatagtgaa gccacagatg 1500 tataataatc aaactagtgc tccatgccta ctgcctcgga cttcaagggc tacgatggat 1560 ctgatccaag aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgcgg agcactagtt tgattattat 1620 agtgaagcca cagatgtata ataatcaaac tagtgctcca tgcctactgc ctcggacttc 1680 aagggctacg atggatctga tccaagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgcggagca 1740 ctagtttgat tattatagtg aagccacaga tgtataataa tcaaactagt gctccatgcc 1800 tactgcctcg gacttcaagg gctacgatgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 1860 agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1920
10gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1980 ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 2040 cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 2100 gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 2160 gcggaaagaa ccagctg 2177
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)AFP基因組序列設(shè)計(jì)的AFP上游表達(dá)調(diào)控序列擴(kuò)增用引物1 <400> 2
agatctcaga ttgaattatt tgcctgtca 29
<210> 3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)AFP基因組序列設(shè)計(jì)的AFP上游表達(dá)調(diào)控序列擴(kuò)增用引物2 <400> 3
ggatcctagg aagttttcgc aataatac 28
<210> 4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)AFP基因組序列設(shè)計(jì)的AFP上游表達(dá)調(diào)控序列擴(kuò)增用引物3 <400> 4
agatctgccc caaagagctc tgtgt 25
<210> 5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)AFP基因組序列設(shè)計(jì)的AFP上游表達(dá)調(diào)控序列擴(kuò)增用引物4 <400> 5
ggatccaaat catgctgaaa ttcttttata etc 33
<210> 6 <211>59<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>針對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E基因設(shè)計(jì)的人工microRNA擴(kuò)增用引物1 <400> 6
tgctgttgac agtgagcgcg gagcactagt ttgattatta tagtgaagcc acagatgta 59
<210> 7 <211>59 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>針對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E基因設(shè)計(jì)的人工microRNA擴(kuò)增用引物2 <400> 7
tccgaggcag taggcatgga gcactagttt gattattata catctgtggc ttcactata 59
<210> 8 <211>41 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>針對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E基因設(shè)計(jì)的人工microRNA擴(kuò)增用引物3 <400> 8
agatctgatc caagaaggta tattgctgtt gacagtgagc g 41
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>針對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E基因設(shè)計(jì)的人工microRNA擴(kuò)增用引物4 <400> 9
ggatccatcg tagcccttga agtccgaggc agtaggca 38
權(quán)利要求
1.一種肝癌靶向性基因表達(dá)元件AE，為一種DNA分子，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，其中第7位至第827位為人甲胎蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第-4113位至第-3292位，該區(qū)域含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子和肝細(xì)胞核因子結(jié)合位點(diǎn)，第831位至第1012位為人甲胎蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第-182位至第-1位，該區(qū)域含有甲胎蛋白的基本啟動(dòng)子功能，從第1位至第1012位的1012bp片段組成重組的甲胎蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列，第1019位至第1828位為6個(gè)串聯(lián)連的針對(duì)人真核細(xì)胞翻譯起始因子4E基因的人工設(shè)計(jì)的microRNA，第1829位至第2177位為牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷酸信號(hào)區(qū)，為基因表達(dá)提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌靶向性基因表達(dá)元件AE在制備甲胎蛋白陽(yáng)性的肝癌的靶向基因治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種肝癌靶向性基因表達(dá)元件AE，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。該表達(dá)元件AE在導(dǎo)入甲胎蛋白陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞后，可以在細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的人工microRNA，并有效抑制細(xì)胞內(nèi)真核細(xì)胞翻譯起始因子4E的表達(dá)，進(jìn)而影響到細(xì)胞中完整的翻譯起始復(fù)合物的形成，最終阻斷蛋白質(zhì)合成，特異性地抑制AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，可在制備甲胎蛋白(AFP)陽(yáng)性的肝癌的靶向基因治療藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101671669SQ20091010181
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者江 曹, 毛晨宇, 賈振宇, 萍 陳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)