專利名稱：人子宮頸癌1原癌基因以及所編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的原癌基因以及所編碼的蛋白質(zhì)，具體地說，本發(fā)明涉及人子宮頸癌1原癌基因及由該基因編碼的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)可被用于各種腫瘤的診斷。
背景技術(shù)：
高等動(dòng)物包括人在內(nèi)都攜帶大約100,000個(gè)基因，但其中只有15％得到表達(dá)，并且個(gè)體生物過程的特征，例如起源、分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、對(duì)刺激應(yīng)答、細(xì)胞分裂的控制、衰老和凋亡(程序化細(xì)胞死亡)，決定于某些基因的表達(dá)(參見Liang，P.和A.B.Pardee，科學(xué)(Science)，257967-971(1992))。
病理現(xiàn)象，例如腫瘤發(fā)生，是由導(dǎo)致基因表達(dá)模式發(fā)生變化的基因突變所引起的。因此，進(jìn)行了不同細(xì)胞中基因表達(dá)的比較研究，從而為建立理解多樣性生物現(xiàn)象的可行方法提供基礎(chǔ)。
例如，由Liang和Pardee所建議的mRNA差異顯示(DD)方法，有效地闡明了控制細(xì)胞凋亡的腫瘤抑制基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因明的本質(zhì)(參見Liang，P.和A.B.Pardee同上)。而且，DD方法已經(jīng)廣泛用于檢查細(xì)胞內(nèi)各種基因的相互關(guān)系。
據(jù)報(bào)道，腫瘤發(fā)生是由各種遺傳變化，例如染色體雜合性的丟失、致癌基因的活化以及腫瘤抑制基因例如p53基因的失活，所引起的(參見Bishop，J.M.，細(xì)胞(Cell)，64235-248(1991)；以及Hunter，T.，細(xì)胞(Cell)，64249-270(1991))。而且，據(jù)報(bào)道，10％到30％的人類癌癥發(fā)生于癌基因通過原癌基因擴(kuò)增的活化。
因此，原癌基因的活化在許多癌癥的病因?qū)W中發(fā)揮重要作用，因而需要對(duì)原癌基因進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明人致力于揭示并檢查子宮頸癌的腫瘤發(fā)生所涉及的機(jī)制；而且，已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的原癌基因一人子宮頸癌1(HCCR-1)在癌細(xì)胞中特異性過度表達(dá)。此原癌基因可被有效地用于各種腫瘤例如白血病，淋巴瘤，腎、肝、卵巢及子宮頸癌癥的診斷、預(yù)防和治療。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的原癌基因及其片段。
本發(fā)明的其它目的是提供一種含有所說原癌基因或其片段的重組載體以及用此載體轉(zhuǎn)化的微生物一種由所說的原癌基因或其片段編碼的蛋白質(zhì)；一種含有所說的原癌基因或其片段的診斷癌癥的試劑盒；一種含有所說的蛋白質(zhì)或其片段的診斷癌癥的試劑盒；一種具有與所說的原癌基因互補(bǔ)的堿基序列或其片段的反義基因；以及一種利用所說的反義基因治療或預(yù)防癌癥的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新的具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的原癌基因或其片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有所說的原癌基因或其片段的重組載體以及一種用所說的載體轉(zhuǎn)化的微生物。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了具有從所說的原癌基因或其片段衍生而來的具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其片段的蛋白質(zhì)。
附圖簡要描述本發(fā)明的上述目的及特征以及其它目的及特征通過下文中參照附圖的描述將顯而易見。


圖1在正常的子宮頸組織、原發(fā)性子宮頸癌組織、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織以及CUMC-6子宮頸癌細(xì)胞中已被改變的基因表達(dá)的DD鑒定。
圖2利用TMPRED程序?qū)Ρ景l(fā)明的原癌基因中跨膜區(qū)的疏水性的進(jìn)行預(yù)測(cè)。
圖3在正常的子宮頸組織、子宮頸癌組織以及子宮頸癌細(xì)胞系(CaSki和CUMC-6)中表達(dá)的HCCR-1的Northern印跡分析結(jié)果。
圖4在正常的肺組織和肺癌細(xì)胞系(NCI-H358、NCI-H460、NCI-H441、NCI-H1229、NCI-H520、NCI-H2009及NCI-H157)中表達(dá)的HCCR-1的Northern印跡分析結(jié)果；圖5A在正常的人十二指腸組織中表達(dá)的HCCR-1基因的Northern印跡分析結(jié)果；圖5B用圖5A的相同的樣品與β肌動(dòng)蛋白雜交所獲得的結(jié)果。
圖6A在人癌細(xì)胞系中表達(dá)的HCCR-1基因的Northern印跡分析結(jié)果；圖6B用圖6A的相同的樣品與β肌動(dòng)蛋白雜交所獲得的結(jié)果。
圖7A在人的腫瘤組織以及于之相對(duì)應(yīng)的正常組織中表達(dá)的HCCR-1的Northern印跡分析結(jié)果；圖7B用圖7A的相同的樣品與β肌動(dòng)蛋白雜交所獲得的結(jié)果。
圖8一張說明原位雜交的人子宮頸癌組織的代表性特征的顯微照片；圖9單層培養(yǎng)的野生型NIH/3T3細(xì)胞的一個(gè)相差照片；
圖10單層培養(yǎng)的HCCR-1細(xì)胞的一個(gè)相差照片；
圖11單層培養(yǎng)的HCCR-1細(xì)胞的蘇木精-伊紅染色；
圖12說明培養(yǎng)的HCCR-1細(xì)胞的代表性特征的透射電子顯微照片；
圖13HCCR-1在裸鼠中的致癌性；
圖14從裸鼠取得的皮下腫瘤瘤塊的蘇木精-伊紅染色；
圖15說明來源于裸鼠的皮下腫瘤組織的代表性特征的透射電子顯微照片；
圖16單層培養(yǎng)的來源于裸鼠的HCCR-1N細(xì)胞的相差照片；
圖17十二烷基硫酸鈉(SDS)-PAGE結(jié)果，顯示IPTG誘導(dǎo)之前和之后的蛋白質(zhì)表達(dá)模式；
圖18未轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(野生型)、只用pcDNA3載體轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(pcDNA3)以及HCCR-1細(xì)胞的Western印跡分析結(jié)果；
圖19人的腎、肺、卵巢及子宮頸腫瘤組織以及與之對(duì)應(yīng)的正常組織的Western印跡分析結(jié)果；圖20HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞針對(duì)網(wǎng)硬蛋白纖維的免疫組織化學(xué)研究(x250)；
圖21HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞中，上皮細(xì)胞標(biāo)記一角蛋白質(zhì)的表達(dá)(x250)；圖22HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞中，上皮膜抗原的表達(dá)(x250)；圖23HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞中，間葉細(xì)胞標(biāo)記—波狀蛋白質(zhì)的表達(dá)(x250)；圖24在未轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(野生型)、只用pcDNA3載體轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(pcDNA3)及HCCR-1原癌基因轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(HCCR-1細(xì)胞)的PKC活性；圖25在293細(xì)胞、＋核糖核酸酶(RNase)、未轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(野生型)、只用pcDNA3載體轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(pcDNA3)以及HCCR-1原癌基因轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(HCCR-1細(xì)胞)中的端粒酶活性；圖26A在用反義寡脫氧核糖核苷酸處理過的H-358肺細(xì)胞癌細(xì)胞系中HCCR-1 cDNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖26B用圖26A的相同的樣品與β肌動(dòng)蛋白雜交所獲得的結(jié)果。
圖27用被正義、錯(cuò)義或反義HCCR-1 ODN處理過的H-358肺癌細(xì)胞系及沒有處理過的親本細(xì)胞系的生長曲線；圖28HCCR-1蛋白質(zhì)在胎兒期16天-(F16)、18天-(F18)、20天-(F20)、出生后1天-(P1)、7天-(P7)、14-天(P14)，及成年大鼠的腎的組織提取物中的表達(dá)；圖2920日齡的胎兒期大鼠的腎的免疫組織化學(xué)染色(x42)；以及圖3018日齡的胎兒期大鼠的腎的微分干擾相差顯微術(shù)，說明基底膜外側(cè)的髓袢集合導(dǎo)管(x220)的HCCR-1免疫組織化學(xué)。
發(fā)明詳述本發(fā)明的新的原癌基因，即，人子宮頸癌1(以下稱為“HCCR-1原癌基因”)，是由2118個(gè)堿基對(duì)組成的，并具有SEQ ID NO1所示的DNA序列。
在SEQ ID NO1中，對(duì)應(yīng)于第9到1088位堿基的完整的開放閱讀框是一個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)，預(yù)測(cè)的由此衍生而來的氨基酸序列表示于由360個(gè)氨基酸組成的SEQ ID NO2(“HCCR-1蛋白質(zhì)”)。而且，對(duì)應(yīng)于SEQID NO1的第9到83位堿基的區(qū)域編碼一個(gè)具有SEQ ID NO2中第1到25位氨基酸的預(yù)測(cè)氨基酸序列的信號(hào)肽；由SEQ ID NO1的第435到494位核苷酸所代表的區(qū)域編碼一個(gè)具有SEQ ID NO2第143到162位氨基酸的預(yù)測(cè)氨基酸序列的單一跨膜區(qū)域。這表明本發(fā)明的原癌基因是一種膜結(jié)合蛋白質(zhì)基因。
一個(gè)單一的潛在N-糖基化位點(diǎn)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第945到第953位堿基以及SEQ ID NO2的第313到315位氨基酸)，存在于HCCR-1蛋白質(zhì)的C-末端，這表明，HCCR-1蛋白質(zhì)是一種II型膜蛋白質(zhì)。聚腺苷酸化信號(hào)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第2008-2012位核苷酸。
預(yù)測(cè)的HCCR-1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于第495-1088位堿基，具有第163-360位氨基酸的預(yù)測(cè)氨基酸序列，由198個(gè)氨基酸組成，其中有5個(gè)半胱氨酸殘基。預(yù)測(cè)的HCCR-1細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有117個(gè)氨基酸(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第84-434位核苷酸及SEQ ID NO2的第26-142位氨基酸)，在Ser-42及Ser-48位點(diǎn)有兩個(gè)潛在的蛋白質(zhì)激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)，在Gly-34及Gly-38位點(diǎn)有兩個(gè)潛在的N-十四烷基化位點(diǎn)。進(jìn)一步的計(jì)算機(jī)輔助分析表明，HCCR-1具有顯著的疏水性并擁有一個(gè)特征性的單一跨膜結(jié)構(gòu)域和前分泌信號(hào)肽，如圖2所示。
考慮到密碼子的簡并性，以及要在其中表達(dá)本發(fā)明的原癌基因的特定動(dòng)物的偏好密碼子，可以進(jìn)行SEQ ID NO1的DNA序列的變化和修飾，例如在其編碼區(qū)域進(jìn)行變化或修飾，而不改變所表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或者在非編碼區(qū)域進(jìn)行變化或修飾，而不改變所表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。因此，本發(fā)明在其范圍之內(nèi)，還包括一條具有與本發(fā)明的原癌基因或其片段基本相同的堿基序列的多聚核苷酸。這里所使用的“基本相同的多聚核苷酸”是指其堿基序列顯示出與本發(fā)明的原癌基因具有80％或更多，優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％或更高同源性的多聚核苷酸。
用本發(fā)明的原癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)由360個(gè)氨基酸組成，并具有SEQID NO2的氨基酸序列。此蛋白質(zhì)的分子量是大約40kDa。然而，可以對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸殘基的各種取代、增加或/缺失而不影響蛋白質(zhì)的功能。而且，當(dāng)要完成一個(gè)特定的目的時(shí)，可以使用此蛋白質(zhì)的一部分。這些被修飾的氨基酸及其片段也被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明在其范圍之內(nèi)，包括一種與從本發(fā)明的癌基因或其片段所衍生而來的蛋白質(zhì)具有基本相同的氨基酸序列的多肽。這里所使用的“基本相同的多肽”是指其氨基酸序列顯示與SEQ ID NO2具有80％或更多，優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％或更高同源性的多肽。
本發(fā)明的原癌基因或蛋白質(zhì)可從人癌癥組織獲得，或者利用常規(guī)的DNA或肽合成方法合成。而且，可將這樣制備的基因插入到一種常規(guī)載體中從而得到表達(dá)載體，隨后將表達(dá)載體導(dǎo)入到一種合適的宿主例如E.coli或酵母細(xì)胞中。用含有HCCR-1原癌基因或其片段的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在下文稱為“HCCR-1細(xì)胞”。
被轉(zhuǎn)化的宿主此后可用于大規(guī)模生產(chǎn)本發(fā)明的DNA或核酸。例如，通過使用pGEM-T easy載體，用HCCR-1原癌基因轉(zhuǎn)化E.coli JM109，此JM109/HCCR-1已于1999年10月11日，依據(jù)布達(dá)佩斯條約關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利程序之目的的微生物保藏的規(guī)定，保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures(KTCC)，地址KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，其保藏號(hào)為KCTC0667BP。
在制備載體時(shí)，表達(dá)控制序列，例如，啟動(dòng)子、終止子、自我復(fù)制序列以及分泌信號(hào)，依據(jù)所使用的宿主細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)選擇。
本發(fā)明的原癌基因的過度表達(dá)不發(fā)生于正常的子宮頸及肺組織中，而是發(fā)生于子宮頸癌組織、子宮頸癌細(xì)胞系以及肺癌細(xì)胞系。這暗示，本發(fā)明的原癌基因誘導(dǎo)子宮頸癌及肺癌。而且，當(dāng)正常的成纖維細(xì)胞，例如NIH3T3細(xì)胞系，用本發(fā)明的原癌基因轉(zhuǎn)化時(shí)，產(chǎn)生了一種不正常的細(xì)胞。用光學(xué)及電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)鑒定表明，不正常的細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的形式。
當(dāng)用本發(fā)明的原癌基因轉(zhuǎn)化的正常的成纖維細(xì)胞被注射進(jìn)裸鼠的后側(cè)面時(shí)，注射之后大約21天觀察到腫瘤發(fā)生，腫瘤的大小在40天內(nèi)變成1.5cm×1.5cm。使用蘇木精-伊紅染色法可以證明腫瘤細(xì)胞是癌性的。上皮細(xì)胞癌的形成還可通過使用透射電子顯微術(shù)及免疫組織化學(xué)染色的方法來證明。
除了上皮組織例如子宮頸和肺癌組織之外，在其它癌癥組織中也觀察到本發(fā)明的原癌基因的過度表達(dá)，例如白血病，淋巴癌，腎、肝以及卵巢癌。因此本發(fā)明的原癌基因被認(rèn)為是一種各種形式的癌癥的共同因子，因而可將其方便地用于各種癌癥的診斷及轉(zhuǎn)化動(dòng)物的生產(chǎn)，以及反義基因治療。
可使用本發(fā)明的原癌基因進(jìn)行診斷的方法可以包括，例如，用含有本發(fā)明的原癌基因或其片段的探針與從受試者的體液分離的核酸雜交，以及通過使用本領(lǐng)域中常規(guī)檢測(cè)方法來確定受試者是否含有此原癌基因的步驟?？梢酝ㄟ^用同位素或酶來標(biāo)記探針，而容易地檢測(cè)此原癌基因的存在。因此，一種含有本發(fā)明的原癌基因或其片段的癌癥診斷試劑盒也被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
通過將本發(fā)明的原癌基因?qū)胍环N哺乳動(dòng)物，例如大鼠，來生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化動(dòng)物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在生產(chǎn)這樣一種轉(zhuǎn)化的動(dòng)物時(shí)，優(yōu)選在第8細(xì)胞周期之前將本發(fā)明的原癌基因?qū)雱?dòng)物的受精卵。轉(zhuǎn)化的動(dòng)物可以方便地用于篩選致癌物及抗癌物藥物，例如抗氧化劑。
本發(fā)明還提供一種可用于基因治療的反義基因。本文所使用的術(shù)語“一種反義基因”指一條包括了與從具有SEQ ID NO1的堿基序列的原癌基因或其片段轉(zhuǎn)錄出的mRNA的序列完全或部分互補(bǔ)的堿基序列的多聚核苷酸，所說的核苷酸能夠通過將自身結(jié)合到mRNA的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，從而阻礙原癌基因的開放閱讀框(ORF)表達(dá)。
本發(fā)明的反義基因的一個(gè)例子是具有SEQ ID NO3的堿基序列的18-聚體HCCR-1反義寡聚脫氧核糖核酸(ODN)。因此，本發(fā)明在其范圍之內(nèi)還包括一種包括了與SEQ ID NO3的序列基本相同的堿基序列或其片段的多聚核苷酸。
本發(fā)明在其范圍之內(nèi)還包括一種通過施用治療有效量的本發(fā)明的反義基因在受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法。
在發(fā)明的反義基因治療中，按照常規(guī)方式給受試者給藥本發(fā)明的反義基因，從而阻礙此原癌基因的表達(dá)。例如，根據(jù)Kim，J.S.，等，(控釋雜志(J.Controlled Release)，53，175-182(1998))所公開的方法，通過靜電相互作用將反義ODN與疏水化的聚-L-賴氨酸衍生物混合，所產(chǎn)生的混合ODN通過靜脈對(duì)受試者給藥。
在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，還包括含有本發(fā)明的反義基因作為活性成分，并且如果有必要，還與制藥上可接受的載體、賦形劑或其它添加劑組合的抗癌組合物。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選制備成可通過注射給藥的劑型。
實(shí)際給藥的反義基因的量應(yīng)該根據(jù)各種相關(guān)因素，包括所要治療的病態(tài)、選定的給藥途徑、患者個(gè)體的年齡及體重以及患者癥狀的嚴(yán)重程度來確定。
由發(fā)明的原癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可以用來生產(chǎn)用作診斷工具的抗體。本發(fā)明的抗體，可根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，通過使用一種具有SEQID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其片段，以單克隆或多克隆抗體的形式制備。癌癥診斷可以使用本領(lǐng)域中公知的任何方法進(jìn)行，例如，在聚丙烯酸凝膠上進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫試驗(yàn)(RIA)、三明治試驗(yàn)、Western印跡或免疫印跡，從而評(píng)價(jià)此蛋白質(zhì)是否在受試者的體液中表達(dá)。因此，一種含有具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其片段的癌癥診斷試劑盒也被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可使用本發(fā)明的原癌基因建立一種永生性癌癥細(xì)胞系，而這樣一種細(xì)胞系可以從，例如，通過注射用本發(fā)明的原癌基因轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞而在裸鼠背部形成的腫瘤組織獲取。這樣制備的細(xì)胞系可以方便的用于尋找抗癌物質(zhì)。
下文描述實(shí)施例和試驗(yàn)實(shí)例，這些實(shí)施例和試驗(yàn)實(shí)例僅用于說明之目的，而不用于限定本發(fā)明之范圍。實(shí)施例1腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)以及總DNA的分離步驟1-1腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)從接受過根治性子宮頸切除術(shù)的子宮頸癌患者獲取正常的子宮頸組織，未處理過的原發(fā)性子宮頸癌組織和轉(zhuǎn)移性常見回腸淋巴結(jié)組織，用于mRNA差異顯示試驗(yàn)。用于差異顯示方法的人子宮頸癌細(xì)胞系是由Kim，等，(婦科腫瘤學(xué)(Gynecol.Oncol.)，62230-240(1996))所描述的CUMC-6細(xì)胞系。
來自上述組織的細(xì)胞及CUMC-6維持于補(bǔ)充了2mmol/L谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素以及10％胎牛血清(Gibco)的Waymouth’s MB 752/1培養(yǎng)基(Gibco)。利用Freshney(“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè)(Culture of Animal CellsA Manual of Basic Techniques)”，第2版，A.R.Liss，New York(1987))所描述的臺(tái)盼藍(lán)染劑拒染試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，只有活度大于95％的細(xì)胞懸液才用于本試驗(yàn)。步驟1-2總RNA的分離及mRNA的差異顯示使用由Qiagen(QiagenInc.，Germany)提供的商品化系統(tǒng)(RNeasy totalRNA kit試劑盒)，從步驟1-1所獲取的正常子宮頸組織、原發(fā)性子宮頸癌組織、轉(zhuǎn)移性常見回腸淋巴結(jié)組織以及CUMC-6細(xì)胞提取總RNA，使用Message clean kit試劑盒(GenHunter Corp.，Brookline，MA)從RNA中去除污染的DNA。實(shí)施例2差異顯示逆轉(zhuǎn)錄(DDRT)-PCR根據(jù)Liang和Pardee(1992)，同上，所描述的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法，稍做修改，進(jìn)行差異顯示逆轉(zhuǎn)錄。
首先，使用實(shí)施例1步驟1-2中所獲得的各總RNA 0.2μg，及三個(gè)引物中任何一個(gè)，即，H-T11G、H-T11C或H-T11A，作為錨定的oligo dT引物(RNAimage kit試劑盒，GenHunter Cor.，MA，USA)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
然后，使用相同的錨定引物和一種隨機(jī)5′引物13聚體(RNAimageprimer sets1-4，H-AP1-32)，在存在0.5mM[α-35S]-標(biāo)記的dATP(1200Ci/mmol)的條件下進(jìn)行PCR。PCR熱循環(huán)重復(fù)40次，循環(huán)包括95℃40秒，40℃ 2分鐘和72℃40秒，最后在72℃下進(jìn)行反應(yīng)5分鐘。
將PCR擴(kuò)增的片段在6％聚丙烯酸測(cè)序凝膠上電泳。通過檢查放射自顯影來鑒定差異表達(dá)的片段。
將大于200堿基的帶CC214，從干測(cè)序凝膠中切除。通過煮沸15分鐘將CC214 cDNA洗脫下來，并使用相同的引物對(duì)及上述擴(kuò)增步驟所使用的PCR條件使其再次擴(kuò)增，只是不使用[α-35S]-標(biāo)記的dATP而使用20μMdNTP。實(shí)施例3克隆根據(jù)制造商的使用說明，使用TA克隆系統(tǒng)(Promega，USA)將如上所獲得的再次擴(kuò)增的CC214 PCR產(chǎn)物插入到pGEM-T Easy載體中。步驟3-1連接將2μl在實(shí)施例2中所獲得的再次擴(kuò)增的CC214 PCR產(chǎn)物、1μlpGEM easy載體(50μg、1μlT4DNA連接酶，10X緩沖液，以及1μl的T4 DNA連接酶(3weiss units/ul；T4連接酶，Promega，USA)加到0.5ml管中，向其中加入蒸餾水使最終體積為10μl。連接反應(yīng)混合物14℃過夜溫育。步驟3-2TA克隆轉(zhuǎn)化使用以下程序進(jìn)行TA克隆轉(zhuǎn)化。
E.coli JM109(Promega，WI，USA)在10ml LB肉湯培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白質(zhì)胨10g，Bacto-酵母提取物5g，NaCl 5g)中溫育直到600nm處的光密度達(dá)到大約0.3到0.6。將培養(yǎng)混合物置于0℃10分鐘，并在4℃下按4000rpm離心10分鐘。去除上清而收獲細(xì)胞。所收獲的細(xì)胞小團(tuán)暴露于10ml 0.1M CaCl20℃ 3分鐘到1小時(shí)，從而獲得感受態(tài)細(xì)胞。產(chǎn)物在4℃下按4000rpm又離心10分鐘，將收獲的細(xì)胞懸浮在0℃ 2ml 0.1MCaCl2中。
將20μl的感受態(tài)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一支微量離心管中，并加入2μl在步驟3-1中所獲得的連接產(chǎn)物。將此混合物在42℃水浴中溫育90秒，并迅速冷卻到0℃。向其中加入800μl SOC培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白質(zhì)胨2.0g，Bacto-酵母提取物0.5g，1M NaCl 1ml，1M KCl 0.25ml，TDW 97ml，2M Mg2+1ml，2M葡萄糖1ml)，并將此混合物在旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)培養(yǎng)箱中按220 rpm轉(zhuǎn)動(dòng)，37℃溫育45分鐘。
用玻璃涂布器(spreader)將25μl X-gal(40mg/ml溶于二甲基甲酰胺的原液)涂布在瓊脂上面，制備含有氨芐青霉素(50μl/ml)LB瓊脂平板。將25μl如此獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于其上，將這些平板在37℃溫箱溫育過夜。將白色的克隆加載到含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，將轉(zhuǎn)化的E.coli，即，JM 109/CC214，選擇出來并在terrific肉湯(TDW 90ml，Bacto-胰蛋白質(zhì)胨12g，Bacto-酵母提取物24g，甘油4ml，0.17M KH2PO4，0.72NK2HPO4100ml)中溫育。實(shí)施例4重組質(zhì)粒DNA的分離根據(jù)制造商的使用說明，使用WizardTMPlus Pinipreps DNAPurification Kit試劑盒(Promega，USA)分離了轉(zhuǎn)化的E.coli的CC214質(zhì)粒DNA。
用EcoRI酶處理如此分離的一部分質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行凝膠電泳以證明質(zhì)粒中CC214部分序列的插入。實(shí)施例5DNA的序列分析在實(shí)施例2中所獲得的CC214 PCR產(chǎn)物，根據(jù)常規(guī)的方法進(jìn)行PCR，而克隆的、再次擴(kuò)增的CC214PCR片段，根據(jù)雙脫氧鏈終止法，按照制造商的使用說明，使用Seqenase version 2.0 DNA sequencing kit試劑盒(United Sates Biochemical，Cleveland，OH)進(jìn)行序列分析。
此DNA的堿基序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第1883-2088位核苷酸，并被命名為“CC214”。
使用一個(gè)5′隨機(jī)引物H-AP21及一個(gè)3′H-T11C錨定引物進(jìn)行206bp cDNA片段，即以上所獲得的CC214的差異顯示逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(DDRT-PCR)，并通過電泳分離。通過DD方法鑒定的在原發(fā)性子宮頸癌、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織和CUMC-6細(xì)胞中改變的基因表達(dá)表示于
圖1中。如
圖1所見，這個(gè)206bp片段，即CC214，在子宮頸癌、轉(zhuǎn)移性組織以及CUMC-6細(xì)胞中表達(dá)，而在正常的細(xì)胞中不表達(dá)。實(shí)施例6HCCR-1原癌基因的全長cDNA的序列分析通過與作為探針的32P-標(biāo)記的CC214進(jìn)行噬斑雜交，篩選噬菌體λgt11人肺胚胎成纖維細(xì)胞cDNA文庫(參見Miki，T.，等，基因(Gene)，83137-146(1989))。從人肺胚胎成纖維細(xì)胞cDNA文庫獲得了在pCEV-LAC載體中含有的一個(gè)2118bp插入的全長HCCR-1cDNA克隆，并于1999年11月5日在GenBank注冊(cè)，登記號(hào)為AF195651。
通過NotI切割將插入到λpCEV載體(參見，Miki，T.，等，同上)的HCCR-1克隆以氨芐青霉素抗性的pCEV-LAC噬菌粒載體的形式(參見，Miki，T.，等，同上)切出來。
用T4 DNA連接酶連接含有HCCR-1基因的pCEV-LAC載體，從而制備HCCR-1質(zhì)粒DNA，并將連接好的克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli JM109。
如此獲得的轉(zhuǎn)化的E.coli JM 109/HCCR-1，已于1999年10月11日，依據(jù)布達(dá)佩斯條約關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利程序之目的的微生物保藏的規(guī)定，保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collectionfor Type Cultures(KTCC)，地址Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejion，305-333，Republic of Korea)，保藏號(hào)為KCTC 0667BP。
HCCR-1的全長序列由SEQ ID NO1中所示的2118bp組成。
在SEQ ID NO1中，本發(fā)明的HCCR-1原癌基因的全長的開放閱讀框?qū)?yīng)于第9-1088位核苷酸，并預(yù)測(cè)編碼表示于SEQ ID NO2的由360個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列。而且，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第9到83位核苷酸的區(qū)域編碼一個(gè)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第1到25位氨基酸的25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽；SEQ ID NO1的第435到494位核苷酸的區(qū)域編碼一種單一跨膜結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第143-162位氨基酸。這表明，本發(fā)明的原癌基因是一種膜結(jié)合基因。
在HCCR-1蛋白質(zhì)的C-末端存在一個(gè)單一的潛在N-糖基化位點(diǎn)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第945到953位堿基，和SEQ ID NO2的第313到315位氨基酸)，這暗示，HCCR-1是一種II型膜蛋白質(zhì)。聚腺苷酸化信號(hào)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第2008-2012位核苷酸。
預(yù)測(cè)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域含有198個(gè)氨基酸，其中有5個(gè)半胱氨酸殘基。預(yù)測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有117個(gè)氨基酸(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第84-434位核苷酸及SEQ ID NO2的第26-142位氨基酸)，在Ser-42及Ser-48處具有兩個(gè)潛在的PKC磷酸化位點(diǎn)，在Gly-34及Gly-38位具有兩個(gè)潛在的N-十四烷基化位點(diǎn)。進(jìn)一步的計(jì)算機(jī)輔助分析表明，HCCR-1是顯著疏水的，并且如圖2所示，擁有一個(gè)特征性的單一跨膜結(jié)構(gòu)域及前分泌信號(hào)肽。在圖2中，X-軸代表本發(fā)明的肽的氨基酸序列編號(hào)，而Y-軸代表肽的疏水性。實(shí)施例7各種細(xì)胞中HCCR-1基因的Northern印跡分析如實(shí)施例1一樣，從各種組織和細(xì)胞系提取總RNA。
將20μl變性的來自每種組織及細(xì)胞系的總RNA在1％甲醛瓊脂凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Boehringer-Mannheim，Germany)，從而確定HCCR-1基因表達(dá)的水平。用32P-標(biāo)記的隨機(jī)引發(fā)的HCCR-1全長cDNA探針與這些印跡斑點(diǎn)雜交，這種32P-標(biāo)記的隨機(jī)引發(fā)的HCCR-1全長cDNA探針是使用rediprimeII隨機(jī)引物標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham，England)制備的。重復(fù)Northern印跡分析兩次，結(jié)果用密度計(jì)量法定量并用β-肌動(dòng)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化。
圖3表示正常的子宮頸組織、子宮頸癌組織以及子宮頸癌細(xì)胞系(CaSki和CUMC-6)中表達(dá)的HCCR-1基因的Northern印跡分析結(jié)果。如在圖3所見，HCCR-1的轉(zhuǎn)錄水平在子宮頸癌組織及癌細(xì)胞系(CaSki(ATCCCRL 1550)和CUMC-6)中是高的，但是在正常的子宮頸組織中是低的或者是檢測(cè)不到。
圖4表示在正常的肺組織及7種肺癌細(xì)胞系，即H358(ATCC NCI-H358)、H460(ATCC NCI-H460)、H441(ATCC NCI-H441)、H299(ATCCNCI-H299)、H520(ATCC NCI-H520)、H2009(ATCC NCI-H2009)及H157(ATCC NCI-H157)中表達(dá)的HCCR-1基因的Northern印跡分析結(jié)果。如圖4所示，HCCR-1轉(zhuǎn)錄水平在肺癌細(xì)胞系H358、H460、H1299、H520和H157中處于高水平，而在正常的肺組織中檢測(cè)不到。
圖5A表示正常的人十二指腸；腦、心、骨骼肌、結(jié)腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺及白細(xì)胞組織(Clontech)中表達(dá)的HCCR-1基因的Northern印跡分析結(jié)果。圖5B表示用相同樣品與β-肌動(dòng)蛋白雜交從而證明mRNA完整性的結(jié)果。如圖5A所見，HCCR-1 mRNA(～2.1kb)在許多正常的組織中存在量很小或者不存在，但是在正常的腎組織中卻有高表達(dá)水平。
圖6A表示在人癌細(xì)胞系；HL-60、HeLa、K-562、MOL-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中表達(dá)的HCCR-1基因的Northern印跡分析結(jié)果。圖6B表示用相同樣品與β-肌動(dòng)蛋白雜交從而證明mRNA完整性的結(jié)果。如在圖6A所見，HCCR-1在人白血病及淋巴瘤細(xì)胞細(xì)胞系，例如慢性骨髓性白血病K-562、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)Raji、淋巴母細(xì)胞性白血病MOLT-4和前骨髓細(xì)胞性白血病HL-60以及HeLa細(xì)胞中被高水平地轉(zhuǎn)錄。
特別地，K-562、MOLT-4及HL-60，與正常的白細(xì)胞相比，顯示更高的轉(zhuǎn)錄水平，增加的倍數(shù)分別是約190，90和70。HCCR-1在結(jié)直腸癌SW480、肺癌A59和黑色素瘤G361細(xì)胞系中的表達(dá)水平比在白血病和淋巴瘤中的表達(dá)水平低。
還進(jìn)行了人的腎、肝、肺、卵巢及子宮頸腫瘤組織，以及與之對(duì)應(yīng)的正常組織的Northem印跡分析。如圖7A所示，HCCR-1在人癌細(xì)胞中高水平地轉(zhuǎn)錄，而在正常的細(xì)胞中HCCR-1基因的表達(dá)幾乎觀察不到。圖7B顯示用相同樣品與β-肌動(dòng)蛋白雜交從而證明mRNA完整性的結(jié)果。實(shí)施例8人子宮頸癌組織原位雜交的顯微照片為了進(jìn)行原位雜交，人子宮頸癌組織用高碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定，根據(jù)Ahn筑(美國生理學(xué)雜志(Am.J Physiol.)265，F(xiàn)792-F801(1993))所描述的程序用石蠟包埋，并做切片(5μm)。用全長的HCCR-1 cDNA片段合成一種地高辛標(biāo)記的RNA探針。用通過DIG RNA Labelling Kit試劑盒(Boehringer Mannheim)制備的反義RNA探針進(jìn)行RNA原位雜交。正義RNA探針作為陰性對(duì)照。
圖8表示一張說明人子宮頸癌組織原位雜交的代表性特征的顯微照片。如圖8中所見，原位雜交的人子宮頸癌組織被證明含有高水平的HCCR-1基因。在周圍的正常纖維組織沒有檢測(cè)到染色。實(shí)施例9表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞的轉(zhuǎn)化步驟9-1含有HCCR-1的載體的制備如下構(gòu)建一種含有HCCR-1的編碼區(qū)的表達(dá)載體。
首先，將在實(shí)施例6中所獲得的完整的HCCR-1 cDNA插入到一種原核表達(dá)載體pCEV-LAC的Sal I限制性位點(diǎn)(參見Miki，T.等，基因(Gene)，83137-146(1989))。然后，從pCEV-LAC/HCCR-1載體分離SalI片段。
然后，用XhoI消化pcDNA3(Invitrogen)從而產(chǎn)生一個(gè)與SalI匹配的末端。將這個(gè)含有全長HCCR-1編碼序列的SalI片段插入用XhoI消化的pcDNA3中。使用轉(zhuǎn)脂胺(Lipofectamine)(Gibco BRL)將所產(chǎn)生的pcDNA/HCCR-1表達(dá)載體導(dǎo)入NIH/3T3細(xì)胞(ATCC CRL 1658，USA)，隨后在補(bǔ)充G418(Gibco)的培養(yǎng)基中選擇。所產(chǎn)生的用HCCR-1轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細(xì)胞命名為“HCCR-1細(xì)胞”。制備了另一群只含有pcDA3的NIH/3T3細(xì)胞，作為對(duì)照，命名為“pcDNA3細(xì)胞”。步驟9-2用HCCR-1原癌基因轉(zhuǎn)化的NIH/3T3成纖維細(xì)胞如
圖10所示，野生型的正常NIH/3T3細(xì)胞—一種分化的成纖維細(xì)胞系，是一種具有如圖9所示的細(xì)長形細(xì)胞核及少量細(xì)胞漿的紡錘形細(xì)胞。當(dāng)HCCR-1在步驟9-1中所獲得的表達(dá)HCCR-1的NIH/3T3(HCCR-1細(xì)胞)中表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的形狀變成具有卵形細(xì)胞核和圓胖細(xì)胞漿的多角形形式。
如
圖11所示，被蘇木精-伊紅染色的單層培養(yǎng)的HCCR-1轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細(xì)胞，表現(xiàn)出多態(tài)性、清晰可辯的細(xì)胞核、顆粒狀染色質(zhì)形式、腫瘤巨細(xì)胞及不典型的有絲分裂圖。
為了進(jìn)行透射電子顯微術(shù)(TEM)，用溶于磷酸緩沖液(pH7.4)的2.5％戊二醛固定細(xì)胞和組織。然后用2％四氧化鋨將它們后固定(postfix)。然后用乙醇梯度使標(biāo)本脫水，并用環(huán)氧樹脂812(Epon 812)進(jìn)行包埋。用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對(duì)其超薄切片進(jìn)行染色，并用TEM照相(JOEL1，200EX，Tokyo，Japan)。
如
圖12所示的TEM照片揭示，所培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有微絨毛及發(fā)育良好的細(xì)胞器(inset)。如在
圖12所見，此HCCR-1細(xì)胞在細(xì)胞表面上具有微絨毛，分成小葉狀的具有突出的核仁的細(xì)胞核及發(fā)育良好的粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rER)以及高爾基復(fù)合體(圓狀)。在
圖12中，定標(biāo)線條相當(dāng)于3μm。而在由圓環(huán)所示的范圍的更高的放大倍數(shù)中，定標(biāo)線條相當(dāng)于1μm。實(shí)施例10動(dòng)物中HCCR-1原癌基因的腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移為了分析腫瘤發(fā)生，在9只小鼠(5周齡，無胸腺nu/nu，Balb/c背景)的軀干后側(cè)部皮下注射5×106HCCR-1細(xì)胞。當(dāng)皮下的腫瘤直徑達(dá)到1.5-2.5cm時(shí)處死裸鼠。
如
圖13所示，全部9只注射HCCR-1細(xì)胞的小鼠在21天之后都表現(xiàn)可觸知的腫瘤。
負(fù)荷HCCR-1同種異體移植物的裸鼠表現(xiàn)了上皮細(xì)胞瘤的特征。
圖14顯示了從裸鼠獲得的皮下腫瘤瘤塊的蘇木精-伊紅染色。這些腫瘤瘤塊的切片揭示了典型的被纖維性基質(zhì)隔離的上皮細(xì)胞巢。實(shí)施例11HCCR-1原癌基因誘導(dǎo)的腫瘤組織的電子顯微術(shù)及其癌細(xì)胞系的建立用電子顯微鏡檢查了從實(shí)施例10的裸鼠上形成的腫瘤瘤塊所取得的腫瘤組織，這揭示腫瘤瘤塊表現(xiàn)發(fā)育良好的細(xì)胞器而腫瘤細(xì)胞細(xì)胞橋粒被連接(
圖15)。如
圖15所示，腫瘤組織包括緊密粘附著的具有胞間連接的細(xì)胞(圓環(huán))。在
圖15中，定標(biāo)線條相當(dāng)于3μm。而在由圓環(huán)所示范圍的說明細(xì)胞橋粒的更高放大倍數(shù)中，定標(biāo)線條相當(dāng)于0.5μm。
從以上腫瘤組織所獲得的細(xì)胞，用20％胎牛血清按常規(guī)方式培養(yǎng)，如
圖16所示，所培養(yǎng)的細(xì)胞被命名為HCCR-1N，此細(xì)胞具有與HCCR-1細(xì)胞相似的體外細(xì)胞學(xué)特征。實(shí)施例12在用HCCR-1原癌基因轉(zhuǎn)化E.coli之后所表達(dá)的蛋白質(zhì)的大小的測(cè)定將對(duì)應(yīng)于第123-473位核苷酸及預(yù)測(cè)的第39-155位氨基酸的HCCR-1原癌基因的一部分插入到pET-32b(＋)載體(Novagen)的多克隆位點(diǎn)中，將產(chǎn)生的pET-32b(＋)/HCCR-1載體轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli BL21(ATCC 47092)。轉(zhuǎn)化的E.coli使用LB肉湯培養(yǎng)基在旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)培養(yǎng)箱中溫育，1/100稀釋，并溫育3小時(shí)。向其中加入1mM異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG，Sigma)，從而誘導(dǎo)此蛋白質(zhì)合成。
培養(yǎng)物中的E.coli利用超聲破碎，并在IPTG誘導(dǎo)之前和之后使用12％十二烷基硫酸鈉(SDS)進(jìn)行凝膠電泳。
圖17表示SDS-PAGE結(jié)果，此結(jié)果表示了用pET-32b(＋)/HCCR-1載體轉(zhuǎn)化的E.coli BL21菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)模式。在IPTG誘導(dǎo)之后，在大約35kDa處觀察到一條明顯的蛋白質(zhì)帶。這個(gè)35kDa融合蛋白質(zhì)含有一個(gè)由pET-32b(＋)載體中一個(gè)基因表達(dá)的大約20kDa的Trix.Tag硫氧還蛋白質(zhì)。實(shí)施例13抗體的生產(chǎn)使用His-Bind Kit試劑盒(Novagen)純化從用實(shí)施例12中pET-32b(＋)/HCCR-1載體轉(zhuǎn)化的E.coli BL21菌株所分離的35kDa融合蛋白質(zhì)。所純化的肽的免疫印跡證明了存在較多量的35kDa蛋白質(zhì)。
然后，用1mg這樣純化的肽給兩只體重大約150g的6周齡的Sprague-Dawley大鼠皮下免疫，每周1次免疫3次。從被免疫的小鼠取得血液樣品，并進(jìn)行離心從而得到多克隆血清。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定和證明了此多克隆抗體的抗-HCCR-1活性(1∶10,000)。實(shí)施例14免疫印跡證明抗體特異性為了進(jìn)行Western印跡分析，根據(jù)Laemmli(自然(Nature)227680-685(1970))所描述的方法，收獲
圖18和19中已經(jīng)鑒定的細(xì)胞，并用Laemmli樣品緩沖液裂解。利用10％SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，然后將其電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。將這些膜與在實(shí)施例13中制備的大鼠多克隆抗-HCCR-1血清溫育16小時(shí)。洗滌之后，將這些膜與一種含有1∶10,000稀釋的作為第二抗體的連接了過氧化物酶的羊抗大鼠免疫球蛋白質(zhì)(Jackson ImmunoResearch)的封閉液溫育。利用ECL-Western blot detectionkit試劑盒(Amersham)顯示此蛋白質(zhì)。
如
圖18所示，HCCR-1蛋白質(zhì)在HCCR-1細(xì)胞中過量表達(dá)，而在野生型和只轉(zhuǎn)化載體(pcDNA3)的細(xì)胞僅觀察到微弱的帶。此結(jié)果說明了多克隆血清中抗HCCR-1抗體的特異性。
而且，多克隆血清中HCCR-抗體識(shí)別了不同組織的人蛋白質(zhì)提取物中的大約40kDa的蛋白質(zhì)。如
圖19所示，包括腎、肺、卵巢及子宮頸細(xì)胞癌在內(nèi)的人腫瘤組織，在將它們和與之對(duì)應(yīng)的正常組織比較時(shí)，顯示HCCR-1表達(dá)增加。實(shí)施例15免疫組織化學(xué)將在實(shí)施例9的裸鼠中形成的腫瘤瘤塊分別與抗-波狀蛋白質(zhì)、抗-角蛋白質(zhì)、抗-EMA(上皮細(xì)胞膜抗原)抗體(DAKO)及抗HCCR-1的多克隆抗體溫育。然后，在溫育的腫瘤瘤塊的5um-低溫切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)。
利用生物素化的第二抗體、親合素、生物素化的辣根過氧化物酶及AEC(Aminoethyl Carbaxzole Substrate Kit試劑盒)生色團(tuán)(HISTrAIN-BULK KITS，Zymed)顯示第一抗體的結(jié)合。免疫組織化學(xué)研究顯示，HCCR-1轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞引起了細(xì)胞性質(zhì)從間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ぜ?xì)胞。這些細(xì)胞巢由網(wǎng)硬蛋白纖維包被。
這些細(xì)胞顯示了上皮細(xì)胞標(biāo)記，例如角蛋白質(zhì)(圖21)和上皮細(xì)胞膜抗原(圖22)，及間葉細(xì)胞標(biāo)記，例如波狀蛋白質(zhì)的共表達(dá)(圖23)。實(shí)施例16蛋白質(zhì)激酶C和端粒酶活性試驗(yàn)為了證明HCCR-1調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)激酶C(PKC)活性，使用在實(shí)施例9的步驟9-1中制備的野生型NIH/3T3細(xì)胞、含有pcDNA3的NIH/3T3細(xì)胞及HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞進(jìn)行PKC試驗(yàn)。
根據(jù)制造商的使用說明，使用SignaTECTTMProtein Kiase C AssaySystem(Promega)測(cè)量PKC活性。PKC活性定義為在存在或缺乏磷脂的條件下每分鐘摻入底物的PKC量的差異。每個(gè)數(shù)值都是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(means±s.d.)。
圖24中的結(jié)果顯示，HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞的PKC活性比野生型的高大約10倍。
為了解釋HCCR-1的腫瘤發(fā)生，根據(jù)制造商的使用說明，使用端粒酶PCR-ELISA kit試劑盒(Bohringer Mannheim)測(cè)量了野生型NIH/3T3細(xì)胞、含有pcDNA3的NIH/3T3細(xì)胞及HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞的端粒酶活性。用此試劑盒所提供的人端粒酶-陽性的永生性人腎細(xì)胞(293細(xì)胞)作為陽性對(duì)照。
用做陰性對(duì)照的是用RNase(＋RNase)預(yù)處理過的293細(xì)胞。用相當(dāng)于1×103細(xì)胞的提取量進(jìn)行此試驗(yàn)。
圖25中的結(jié)果顯示四組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的平均光密度(OD)值。與以前的研究(Holt，S.E.，Wright，W.E.，及Shay J.W.分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)162932-2939(1996)一致的，野生型NIH/3T3細(xì)胞顯示了可以檢測(cè)的端粒酶活性。與野生型細(xì)胞比較，HCCR-1轉(zhuǎn)染將端粒酶活性提高了大約7倍。通過RNase預(yù)處理可消除293細(xì)胞的高端粒酶活性。實(shí)施例17細(xì)胞周期試驗(yàn)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)中期的野生型及HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞，通過在含有0.5％牛血清的DMEM血清中溫育16小時(shí)而使其生長停滯。在胰蛋白質(zhì)酶化之后，收獲要用來分析DNA含量的細(xì)胞，用70％乙醇的固定。然后如Hedley(Flow Cytometry，DNA AnalysisfromParaffin-embedded Blocks，Darzynkiewicz，Z&Crissman，H.A.eds.，Academic Press，San Diego，1990)所描述的一樣，用碘化丙錠對(duì)被固定的細(xì)胞進(jìn)行染色。
首先，將50μg/ml碘化丙錠染色液(Sigma)和每毫升100單位的RNase(Boerhringer Mannheim)加到2×106細(xì)胞中。溫育1小時(shí)之后，使用FACSCaliber(Becton Dickinson)在488nm通過熒光分析測(cè)定細(xì)胞DNA含量。每個(gè)樣品最少有1×104細(xì)胞用Modfit 5.2軟件進(jìn)行分析。
為了研究HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞的生長性質(zhì)是否有變化，檢查了細(xì)胞周期圖。測(cè)量了處于G0/G1、S、G2/M期的野生型NIH/3T3細(xì)胞及HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(對(duì)數(shù)中期)的細(xì)胞含量，結(jié)果顯示于表I。
表I
如表I所見，野生型和HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞在S-期的百分含量分別是20.6％和31.5％(對(duì)數(shù)中期)。這些結(jié)果暗示，在HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞中，有顯著細(xì)胞群從G0/G1期轉(zhuǎn)變到S-期。
為了評(píng)價(jià)血清依賴性細(xì)胞周期的進(jìn)展，在0.5％牛血清中培養(yǎng)細(xì)胞16小時(shí)。溫育之后，用20％牛血清釋放細(xì)胞，并在所示時(shí)間收獲這些細(xì)胞。在所示時(shí)間測(cè)量了處于G0/G1、S、G2/M期的野生型NIH/3T3細(xì)胞及HCCR-1轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞的細(xì)胞含量，結(jié)果見表II。
表II
如從表II所見，在0 h測(cè)量的野生型細(xì)胞中，少數(shù)細(xì)胞維持在S-期。相反地，在0h測(cè)量的HCCR-1細(xì)胞有顯著數(shù)量的細(xì)胞仍然處于S-期(21.8％)，這暗示HCCR-1的組成型過量表達(dá)允許對(duì)血清剝奪性-誘導(dǎo)的G0/G1俘獲有一個(gè)相對(duì)量的抗性。在由于血清剝奪所引起的細(xì)胞從生長停滯釋放之后，與在各時(shí)間間隔(12h，24h和48h)所測(cè)量的野生型細(xì)胞比較，在S-期HCCR-1細(xì)胞群中有一致的超過10％的增加。因此，HCCR-1細(xì)胞的過量表達(dá)可通過縮短G0/G1-期及增加S-期細(xì)胞群而下調(diào)細(xì)胞生長。實(shí)施例18反義寡聚脫氧核苷酸的構(gòu)建利用氰乙基磷酸酰胺(cyanoethylphosphoramidite)化學(xué)方法，在自動(dòng)化DNA合成儀(Expedite Nucleic Acid System，F(xiàn)ramingham，MA)上合成了以HCCR-1 mRNA翻譯啟始位點(diǎn)作為靶的反義及正義硫代磷酸寡脫氧核苷酸(ODNs)。
18-聚體HCCR-1反義ODN的序列是5′-CCTGGACATTTTGTCACC-3′(SEQ ID NO3；對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第66到83位核苷酸)。對(duì)應(yīng)的正義序列，5′-GGTGACAAAATGTCCAGG-3′(SEQ ID NO4)，及錯(cuò)義序列，5′-CGCGGATATTTCCTCACC-3′(SEQ ID NO5)被作為對(duì)照。實(shí)施例19使用HCCR-1反義ODN進(jìn)行癌癥基因治療步驟19-1基因表達(dá)的抑制利用胰蛋白質(zhì)酶-EDTA使指數(shù)生長的2×105H-358肺細(xì)胞癌細(xì)胞(ATCC CRL-5807)脫落，在24孔板上接種。將轉(zhuǎn)脂胺(Lipofectamine)(GibcoBRL)用于寡脫氧核苷酸(ODN)處理。將轉(zhuǎn)脂胺(5μg/ml培養(yǎng)基)與適量的ODN在細(xì)胞懸液中室溫溫育30分鐘，從而獲得100nM ODN的終濃度。此后，將此混合液按各1,000μl直接加入24孔板上的細(xì)胞中，并分別溫育1，2，3，5和7天。利用臺(tái)盼藍(lán)染劑拒染試驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染試劑沒有細(xì)胞毒性。
為了觀察HCCR-1反義ODN的抑制效應(yīng)，分別用各100nM的在實(shí)施例18中所獲得的正義、錯(cuò)義及反義ODNs處理所培養(yǎng)的肺細(xì)胞癌細(xì)胞。利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，揭示了用反義ODN-處理的肺細(xì)胞癌細(xì)胞中HCCR-1表達(dá)的抑制(效應(yīng))。根據(jù)HCCR-1 cDNA的編碼區(qū)合成的、用于RT-PCR的寡核苷酸引物的序列如下正向引物5′-GGGAGATGGAGCATTTGAGA-3′(SEQ ID NO6；對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的第376-395位核苷酸)和反向引物5′-GCTTCCGGAAAGCATGATAG-3′(SEQ ID NO27，與SEQ ID NO1的第554-573位核苷酸互補(bǔ))。
反義核酸發(fā)揮抑制效應(yīng)的劑量與HCCR-1 mRNA表達(dá)的水平有關(guān)(圖26A)。用497 bp的β-肌動(dòng)蛋白質(zhì)作為內(nèi)部對(duì)照來證明mRNA的完整性(圖26B)。陰性對(duì)照(N)含有無核酸酶的水，而不含有RNA模板。還使用了1000-bp的梯形DNA分子量標(biāo)記。如圖26A所示，通過反義ODN處理，198bp的HCCR-1 RT-PCR產(chǎn)物的水平按時(shí)間依賴性方式降低。在用100nM反義HCCR-1 ODN處理7天的細(xì)胞中，HCCR-1基因表達(dá)被完全抑制。相反，在分別用100nM HCCR-1正義及錯(cuò)義ODN處理的細(xì)胞以及沒有處理的親本細(xì)胞中，檢測(cè)到了期望的198bp HCCR-1 RT-PCR產(chǎn)物。
這些結(jié)果表明，用100nM的反義HCCR-1ODN處理完全組斷了肺癌細(xì)胞中HCCR-1基因的表達(dá)。步驟19-2細(xì)胞生長的抑制利用生長曲線評(píng)價(jià)了用100nM正義、反義或錯(cuò)義HCCR-1寡聚脫氧核苷酸處理過的H-358肺癌細(xì)胞的生長表型。
在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，用胰蛋白質(zhì)酶處理H-358并在存在100nM的在實(shí)施例18中所獲得的正義、反義或錯(cuò)義HCCR-1 ODN的條件下鋪平板，每隔一天更換一次含有100nM的HCCR-1 ODN的生長培養(yǎng)基(RPMI-1640)。使在三個(gè)重復(fù)的培養(yǎng)圓盤中的細(xì)胞脫落，每隔一天使用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。
所圖27所示，直到處理的第1天，在正義(□)、錯(cuò)義(△)、反義(○)HCCR-1 ODN-處理的癌細(xì)胞之間，細(xì)胞生長沒有沒可以辨別的差異。然而，在HCCR-1 ODN處理3天之后，反義HCCR-1 ODN按時(shí)間依賴性方式抑制了肺癌細(xì)胞的生長。
在接觸反義HCCR-1ODN7天之后，H-358肺癌細(xì)胞生長抑制的程度是大約100％，而接觸正義或錯(cuò)義HCCR-1 ODN的細(xì)胞顯示了與未處理過的野生型H-358細(xì)胞相似的生長模式(對(duì)照細(xì)胞，◇)。實(shí)施例20HCCR-1基因作為胚胎腎發(fā)育的調(diào)節(jié)者因?yàn)橥ㄟ^成纖維細(xì)胞-剝奪性HCCR-1細(xì)胞獲得上皮細(xì)胞性狀，模擬了腎臟器官發(fā)生期間從間葉細(xì)胞向上皮細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)變(Giordano，S.，等，美國科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90，649-653(1993)；Tsarfaty，I.，等，科學(xué)(Science)263，98-101(1994))，所以進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來檢查HCCR-1在發(fā)育中的腎中是否表達(dá)。
用胎兒期16-、18-和20-天大鼠的腎、出生后1-、7-和14-天大鼠的腎以及成年大鼠的腎的組織提取物中的總蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE。如同在實(shí)施例14中一樣，使用大鼠抗-HCCR-1血清，利用ECL-Western印跡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了HCCR-1陽性帶中的HCCR-1蛋白質(zhì)。
圖28中的結(jié)果顯示，具有大約為40,000(Mr～40K)的相對(duì)分子量的HCCR-1蛋白質(zhì)，在胎兒期18-天開始過量表達(dá)，維持在一個(gè)高的表達(dá)水平直到出生后14-天，在成年大鼠的腎中降低到非常低的一個(gè)水平。圖28F和P分別表示了胎兒期和出生后的情形。
如實(shí)施例15一樣，使用一個(gè)20日齡的胎兒期大鼠的腎進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。正如表示大鼠的腎的染色切片的圖29所揭示的(放大倍數(shù)，x 42)，HCCR-1抗體僅染色集合導(dǎo)管(左側(cè)的骨髓)，此集合導(dǎo)管來自于輸尿管芽(Saxen，L.，腎臟器官發(fā)生學(xué)(Organogenesis of the Kidney)，88-128(Cambridge University Press，Cambridge，United Kingdom，1987)；Coles，H.S.，等，發(fā)育學(xué)(Development)118，777-784(1993))。皮質(zhì)中的發(fā)育中的腎單位不被染色(右側(cè)的腎單位區(qū)域)。
而且，如實(shí)施例15一樣使用一只18日齡的胎兒期大鼠的腎進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，然后在微分干涉相差顯微鏡下觀察。如圖30所示，髓袢集合導(dǎo)管的基底側(cè)質(zhì)膜對(duì)HCCR-1抗體特別有反應(yīng)性(放大倍數(shù)，x220)。
因?yàn)槟I單位發(fā)生是通過一種不同的輸尿管信號(hào)—擴(kuò)散限制性基底側(cè)分子刺激的(Barasch，J.，等，美國生理學(xué)雜志(Am.J.Physiol.)271，F(xiàn)50-F61(1996))，這些分子觸發(fā)從間葉細(xì)胞到上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，所以假設(shè)，HCCR-1產(chǎn)物可能是刺激腎發(fā)育過程中上皮細(xì)胞多態(tài)性以及在腫瘤轉(zhuǎn)變期間調(diào)節(jié)間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間相互作用的間葉細(xì)胞-剝奪性調(diào)節(jié)因子(Brasch，J.等，細(xì)胞(Cell)99，377-386(1999)；Brasch，J.等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)103，1299-1307(1999))。
本說明書包括后附的49個(gè)核酸及氨基酸序列的序列表。本文中引用的專利和科學(xué)期刊的內(nèi)容全部引入本文作為參考。
雖然本發(fā)明的實(shí)施方案已經(jīng)得到完整地描述和說明，但是很明顯，在這里可進(jìn)行各種變化和修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
微生物國際保藏和存活證明(譯文)
序列表<110>金振宇<120>人子宮頸癌1原癌基因以及所編碼的蛋白質(zhì)<130>PCA00211/KJW<150>KR1999-44811<151>1999-10-15<160>7<170>KOPATIN1.5<210>1<211>2118<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(9)..(1088)<220><221>sig_peptide<222>(9)..(83)<220><221>misc_feature<222>(435)..(494)<223>跨膜結(jié)構(gòu)域<400> 1ctgtgaag atg gcg ctc tcc agg gtg tgc tgg gct cgg tcg gct gtg tgg50Met Ala Leu Ser Arg Val Cys Trp Ala Arg Ser Ala Val Trp1 5 10ggc tcg gca gtc acc cct gga cat ttt gtc acc cgg agg ctg caa ctt 98Gly Ser Ala Val Thr Pro Gly His Phe Val Thr Arg Arg Leu Gln Leu15 20 25 30ggt cgc tct ggc ctg gct tgg ggg gcc cct cgg tct tca aag ctt cac 146Gly Arg Ser Gly Leu Ala Trp Gly Ala Pro Arg Ser Ser Lys Leu His35 40 45ctt tct cca aag gca gat gtg aag aac ttg atg tct tat gtg gta acc 194Leu Ser Pro Lys Ala Asp Val Lys Asn Leu Met Ser Tyr Val Val Thr50 55 60aag aca aaa gcg att aat ggg aaa tac cat cgt ttc ttg ggt cgt cat 242Lys Thr Lys Ala Ile Asn Gly Lys Tyr His Arg Phe Leu Gly Arg His65 70 75ttc ccc cgc ttc tat atc ctg tac aca atc ttc atg 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權(quán)利要求
1.一種具有SEQ ID NO1的堿基序列的人子宮頸癌1原癌基因或其片段。
2.權(quán)利要求1的原癌基因的片段，它具有相應(yīng)于SEQ ID NO1的第9到1088位堿基的堿基序列。
3.一種具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其片段。
4.一種載體，它含有權(quán)利要求1的原癌基因或片段。
5.一種用權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化的微生物。
6.權(quán)利要求5的微生物，它是E.coli JM109/HCCR-1(保藏號(hào)KCTC0667BP)。
7.一種制備權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或片段的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求5或6的微生物。
8.一種包括權(quán)利要求1或2的原癌基因或片段的診斷癌癥的試劑盒。
9.一種包括權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或片段的診斷癌癥的試劑盒。
10.一種反義基因，具有與從權(quán)利要求1或2的原癌基因或片段轉(zhuǎn)錄出的全長或部分mRNA的序列互補(bǔ)的堿基序列，并切能夠與該mRNA結(jié)合從而抑制所說的原癌基因或片段的表達(dá)。
11.權(quán)利要求10的反義基因，它具有SEO ID NO3的堿基序列。
12.一種治療或預(yù)防人類癌癥的方法，包括對(duì)人施用治療有效量的權(quán)利要求10或11的反義基因。
全文摘要
具有SEQ ID NO∶1的堿基序列或其片段的人子宮頸癌(1)原癌基因在各種癌癥組織中過度表達(dá)。它可用于診斷各種癌癥,與其互補(bǔ)的反義基因可用于治療癌癥。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1327449SQ00802273
公開日2001年12月19日 申請(qǐng)日期2000年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月15日
發(fā)明者金振宇 申請(qǐng)人:金振宇