專利名稱：產(chǎn)生三酰甘油的生物合成途徑中的新型酶類及編碼該酶類的重組dna分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼一類酶的重組DNA分子的分離、鑒別和特征化，該酶在產(chǎn)生三酰甘油的生物合成途徑中催化脂肪酸自磷脂轉(zhuǎn)移到二酰甘油。
三酰甘油(TAG)是自然界中最常見的脂類能量貯存形式?，F(xiàn)認(rèn)為TAG的主要合成途徑包括自脂酰-輔酶A到甘油主鏈的三步?；盗修D(zhuǎn)移(1，2)。多年來(lái)，脂酰-輔酶A催化第三步?；D(zhuǎn)移的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DAGAT)，被認(rèn)為是參與TAG合成的唯一的酶。其通過(guò)將來(lái)自膜脂合成(途徑)的二酰甘油(DAG)轉(zhuǎn)化成TAG而發(fā)揮作用(2)。最近在小鼠(3)和植物中(4，5)都發(fā)現(xiàn)了編碼該酶的基因，且所編碼的蛋白與脂酰-輔酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)同源。最近還有報(bào)道認(rèn)為另一種DAGAT存在于油質(zhì)真菌拉曼被孢霉中，該酶與小鼠DAGAT、ACAT家族或其他任何已知基因都無(wú)關(guān)(6)。
本發(fā)明涉及新型酶類及其用于轉(zhuǎn)化的編碼基因。更具體地，本發(fā)明涉及編碼以前從未描述過(guò)的以下稱為磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(PDAT)的一類酶的一類基因的應(yīng)用，該酶催化不依賴于脂酰-輔酶A的反應(yīng)。在轉(zhuǎn)基因有機(jī)體內(nèi)單獨(dú)表達(dá)此類基因即可提高細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的油(三酰甘油)的總量。PDAT基因與合成非普通脂肪酸的基因聯(lián)合在轉(zhuǎn)基因有機(jī)體表達(dá)時(shí)，可提高三酰甘油中非普通脂肪酸的水平。
可再生的植物資源而非不可再生的石油化學(xué)產(chǎn)品產(chǎn)生用于工業(yè)的化學(xué)原料例如脂肪酸引起世界廣泛關(guān)注?；谫Y源的保護(hù)，這種觀點(diǎn)已對(duì)制造商和消費(fèi)者產(chǎn)生了巨大的吸引力，并為農(nóng)業(yè)發(fā)展新的工業(yè)作物提供了很好的機(jī)會(huì)。
來(lái)自野生植物類的油中存在一批相異的非普通脂肪酸，其特點(diǎn)已為人們熟知。許多此類酸具有潛在的工業(yè)價(jià)值，這促使人們將注意力轉(zhuǎn)向培育有關(guān)的植物以便能夠?qū)μ囟ㄖ舅徇M(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)非普通脂肪酸的生物合成的深入了解，將來(lái)自野生品種的編碼特定脂肪酸合成過(guò)程中的主要酶類的基因轉(zhuǎn)移到培育的油料作物中已成為可能。這樣可以在花費(fèi)適中的情況下高純度并大量生產(chǎn)個(gè)別脂肪酸。
在例如油菜、向日葵、油棕櫚等的所有植物中，油(即三酰甘油)是最有價(jià)值的種子或果實(shí)產(chǎn)物，而其他化合物比如淀粉、蛋白質(zhì)或纖維則認(rèn)為是價(jià)值較低的副產(chǎn)品。提高每一基礎(chǔ)重量的油量而降低油料作物中的其他化合物會(huì)提高該作物的價(jià)值。若能夠上調(diào)使還原碳轉(zhuǎn)移至油類中(以提高其產(chǎn)量)的基因，該細(xì)胞會(huì)積累更多的油類而其他產(chǎn)物減少。此類基因不僅可用于產(chǎn)油高的細(xì)胞例如油料作物，也可明顯提高中等或少量含油作物例如大豆、燕麥、玉米、土豆、糖甜菜、蕪菁以及微生物中的產(chǎn)油量。
發(fā)明概述許多感興趣的非普通脂肪酸如中鏈脂肪酸、羥脂肪酸、環(huán)氧脂肪酸和乙炔脂肪酸，物理特性顯著有別于普通的植物脂肪酸。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，其種子油(即三酰甘油)中天然存在這些非普通脂肪酸的植物種類中，該種子的膜(磷)脂中此類酸缺乏或含量很低。膜脂中低濃度的此類酸很可能是膜行使正常功能進(jìn)而細(xì)胞行使正常功能的先決條件。本發(fā)明的一方面是若將這些脂肪酸從膜磷脂中有效去除并導(dǎo)入到種子三酰甘油中的話，可使轉(zhuǎn)基因作物的種子積累高量的非普通脂肪酸。
本發(fā)明者已在植物中發(fā)現(xiàn)一類新型的酶，該酶在三酰甘油的合成過(guò)程中通過(guò)不依賴于脂酰輔酶A的反應(yīng)催化磷脂中的脂肪酸轉(zhuǎn)移到二酰甘油，而且這些酶(磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶，縮寫為PDAT)參與去除植物磷脂中的羥基化、環(huán)氧化脂肪酸以及可能的其他非普通脂肪酸例如中鏈脂肪酸。
發(fā)現(xiàn)該酶反應(yīng)存在于面包酵母(釀酒酵母)的微粒體制品中。本發(fā)明還涉及包括SEQ ID第2號(hào)所列氨基酸序列的酶或其功能片段、衍生物、等位體、同源物或同工酶。獲得了所謂的相應(yīng)基因得以破壞的“敲除”酵母突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體的微粒體膜完全喪失PDAT活性。這樣，證明所破壞的基因編碼PDAT酶(SEQ ID 1號(hào)和2號(hào))。另外，根據(jù)SEQ ID 2號(hào)所示氨基酸序列發(fā)現(xiàn)該酶的特征為含有脂酶基序的保守序列串FXKWVEA。
本發(fā)明還涉及包括SEQ ID 16、20或22號(hào)所示氨基酸序列的酶或其功能片段、衍生物、等位體、同源物或同工酶。
還識(shí)別了一些目前功能未知的基因和/或蛋白質(zhì)，其屬于本發(fā)明范圍。識(shí)別了來(lái)自粟酒裂殖酵母，SPBC 776.14(SEQ ID 3號(hào))的基因，其推定是SPBC 776.14的開放閱讀框架CAA22887(SEQ ID 13號(hào))。另外識(shí)別了編碼推定蛋白的擬南芥基因組序列(SEQ ID 4、10和11號(hào))，還識(shí)別了來(lái)自擬南芥基因座AC 004557的推定開放閱讀框架AAC80628(SEQ ID 14號(hào))和來(lái)自擬南芥基因座AC 003027的推定開放閱讀框架AAD10668(SEQ ID 15號(hào))。
還有，識(shí)別了粗糙鏈孢霉(SEQ ID 9號(hào))cDNA克隆和玉蜀黍EST(延伸的Tac序列)克隆(SEQ ID 7號(hào))的部分序列及相應(yīng)的推定氨基酸序列(SEQ ID 8號(hào))。最后，識(shí)別了兩個(gè)cDNA克隆、一擬南芥EST(SEQ ID 5號(hào)和相應(yīng)的預(yù)計(jì)氨基酸序列SEQ ID 6號(hào))和番茄EST克隆(SEQ ID 12號(hào))。另外，包括選自SEQ ID 6、17、18、25或27號(hào)所示序列組的氨基酸序列、含有FXKWVEA脂酶基序的稱為PDAT的酶屬于本發(fā)明的范圍。還有，包括由選自SEQ ID 1、3、4、5、7、9、10、11、12、19、21、23、24、25、26、28、29、30或31所示序列組的核苷酸序列或其部分、衍生體、等位體或同源物編碼的氨基酸序列的酶，或編碼氨基酸序列的該酶的功能片段、衍生物、等位體、同源物或同工酶，屬于本發(fā)明范圍。
本酶的功能片段理解為具有磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)特異性酶活性的任何多肽序列。該功能片段的長(zhǎng)度可在例如約660±10氨基酸到660±250氨基酸的范圍內(nèi)變化，優(yōu)選自約660±50到660±100氨基酸，而此時(shí)的660氨基酸“基數(shù)”對(duì)應(yīng)由SEQ ID 1號(hào)核苷酸序列編碼的SEQ ID 2號(hào)序列的PDAT酶的多肽鏈。然后，全長(zhǎng)的功能酶的“基數(shù)”可根據(jù)編碼的核苷酸序列而變化。
本核苷酸序列的一部分是指編碼具有磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)特異性活性的多肽的任何核苷酸序列。該核苷酸部分的長(zhǎng)度根據(jù)基因編碼區(qū)或高保守序列可在大約幾百個(gè)核苷酸的大范圍內(nèi)變化。例如其長(zhǎng)度變化范圍是自約1900±10到1900±1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選自約1900±50至1900±700，更優(yōu)選自約1900±100至1900±500核苷酸。而此時(shí)1900核苷酸“基數(shù)”對(duì)應(yīng)SEQ ID1號(hào)編碼PDAT酶的核苷酸序列。因此，全長(zhǎng)功能基因的“基數(shù)”可發(fā)生變化。
本核苷酸序列的等位變異體理解為編碼具有相同功能之多肽的任何相異核苷酸序列。該等位體包括天然存在的該核苷酸序列的變異體以及應(yīng)用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生的合成核苷酸序列。導(dǎo)致酶活性和/或調(diào)節(jié)改變或抗特異性抑制劑的變異核苷酸序列也考慮在內(nèi)。本發(fā)明還包括原已分離的核苷酸序列的天然或合成突變體。這些突變可以是替代、添加、缺失、顛換或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
同源核苷酸序列理解為與本核苷酸序列互補(bǔ)和/或與之特異性雜交的序列。雜交序列包括選自在本領(lǐng)域已知的至少較嚴(yán)格的條件下與本核苷酸序列特異性作用的DNA或RNA組別的類似序列。優(yōu)選的非限制性的嚴(yán)格雜交條件為在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、約45℃下進(jìn)行雜交，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中50-65℃洗一次或多次。這還包括如10到30個(gè)核苷酸的短核苷酸序列，優(yōu)選12到15個(gè)核苷酸。引物和雜交探針也包括在內(nèi)。
本發(fā)明范圍包括的同源核苷酸序列是與SEQ ID 1號(hào)核苷酸序列至少約40％同源的序列，優(yōu)選至少約50％或60％同源，更優(yōu)選至少約70％、80％或90％或最優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％或99％或更多同源。
所有上述定義對(duì)氨基酸序列及功能性酶也有效，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能對(duì)該定義融會(huì)貫通。
同工酶理解為具有同樣或類似的底物特異性和/或催化活性但不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)的酶。
在首先的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼PDAT的核酸序列。其包括編碼具有生物活性的PDATs的序列以及用作探針、轉(zhuǎn)化載體或克隆中介的序列。PDAT編碼序列可根據(jù)所需用途編碼全部或部分序列。所有或部分基因組序列、cDNA序列、PDAT前體或成熟PDAT都包括在內(nèi)。
選自由SEQ ID 1、3、4、10、11、19、21、23、24、29或30號(hào)所示序列或其部分、衍生物、等位體或同源物組成的組別的核苷酸序列也包括在內(nèi)。本發(fā)明涉及與選自由SEQ ID5、7、9、12、25、26、28或31號(hào)所示序列或其部分、衍生物、等位體或同源物組成的組別的全長(zhǎng)核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的部分核苷酸序列。另外，包括與選自SEQID 1、3、4、5、7、9、10、11、12、19、21、23、24、25、26、28、29、30或31號(hào)所示序列組的核苷酸序列至少有40％同源的核苷酸序列的核苷酸序列，在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的該核苷酸序列的基因構(gòu)建體，其操作性連接到異源核酸上。
術(shù)語(yǔ)操作性連接指例如啟動(dòng)子、編碼序列、終止子和/或進(jìn)一步的調(diào)節(jié)元件的一系列組織，每一元件可在該核苷酸序列表達(dá)時(shí)完成其應(yīng)有的功能。
此外，包括本發(fā)明的該核苷酸序列的載體在本發(fā)明考慮范圍內(nèi)。其還包括表達(dá)載體以及還包括一可選擇的標(biāo)志基因和/或用于在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或整合入宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的核苷酸序列的載體。
另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建體的表達(dá)而在宿主細(xì)胞或其后代內(nèi)產(chǎn)生PDAT的方法，該宿主包括基因操作的油籽、酵母和霉菌或任何其他的含油有機(jī)體。作為PDAT編碼序列的產(chǎn)生結(jié)果的PDAT所含細(xì)胞也考慮位于本發(fā)明范圍內(nèi)。
此外，本發(fā)明涉及含有該核苷酸序列和/或該基因構(gòu)建體和/或該載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體。本發(fā)明目標(biāo)還包括真核轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體為酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞或植物。本發(fā)明還涉及具有更改的三酰甘油生物合成途徑的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體。含油量改變的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體也考慮位于本發(fā)明范圍內(nèi)。
此外，本發(fā)明涉及PDAT活性在其內(nèi)發(fā)生改變的細(xì)胞或有機(jī)體。PDAT活性改變的特征為該酶的基因表達(dá)、催化活性和/或活性的調(diào)節(jié)發(fā)生變化。另外，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體，其中三酰甘油改變的生物合成途徑的特征為避免在膜脂中積累非所需的脂肪酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及應(yīng)用編碼PDAT的DNA序列來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的含油量的方法。
本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)導(dǎo)入產(chǎn)生PDAT的DNA序列使細(xì)胞內(nèi)的三酰甘油含有大量非普通脂肪酸(的方法)，該P(yáng)DAT可從細(xì)胞膜脂特異性去除這些脂肪酸并將其轉(zhuǎn)移至三酰甘油內(nèi)。發(fā)生此類改變的植物細(xì)胞也考慮在內(nèi)。
此外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生三酰甘油的方法，包括使該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體在一定條件下生長(zhǎng)，其中該核苷酸序列得以表達(dá)，且包括有催化脂肪酸自磷脂轉(zhuǎn)移至二酰甘油的該酶的該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞形成三酰甘油。
另外，通過(guò)上述方法產(chǎn)生的三酰甘油包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明的目標(biāo)還有應(yīng)用本核苷酸序列和/或該酶來(lái)產(chǎn)生三酰甘油和/或含非普通脂肪酸的三酰甘油。應(yīng)用本發(fā)明的該核苷酸序列和/或該酶轉(zhuǎn)化任何細(xì)胞或有機(jī)體以便使之在該細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)表達(dá)并使該細(xì)胞或有機(jī)體產(chǎn)生變化的、優(yōu)選提高的油量，也考慮位于本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明的PDAT包括在酶反應(yīng)條件下具有催化磷脂和二酰甘油生成三酰甘油的能力的任何氨基酸序列，例如可自微生物、動(dòng)物或植物來(lái)源獲得的蛋白質(zhì)、多肽或肽片段?！懊阜磻?yīng)條件”是指環(huán)境中可得的使酶發(fā)揮功能的任何必須條件(例如溫度、pH、缺乏抑制物等因素)。
其他PDATs可取自此處提供的特異性序列。另外，很明顯可從示例性PDATs和通過(guò)應(yīng)用此類示例性序列所得PDATs，獲得天然和合成的PDATs，包括修飾過(guò)的氨基酸序列和用于合成-蛋白質(zhì)模型的起始物質(zhì)。修飾過(guò)的氨基酸序列包括突變、縮短、增加及類似變化的序列，無(wú)論該序列是部分還是全部合成。實(shí)際上從植物制品中純化的序列或與之相同或編碼相同蛋白質(zhì)的序列，不論獲得該蛋白質(zhì)或序列的方法如何，均同樣認(rèn)為來(lái)自天然。
此外，本發(fā)明的核酸探針(DNA和RNA)可用來(lái)自大量植物和微生物來(lái)源篩選和回收“同源”或“有關(guān)”的PDATs。
此外，很明顯本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本申請(qǐng)?zhí)峁┑馁Y料，在任一有機(jī)體內(nèi)識(shí)別PDAT活性、純化具有此活性的酶并因此識(shí)別編碼此酶的“非同源”核酸序列。
本發(fā)明的特征基本上可歸納為以下方面1.用于轉(zhuǎn)化的PDAT基因(基因組克隆或cDNA)的用途。
2.根據(jù)第1項(xiàng)的DNA分子的用途，其中該DNA用來(lái)轉(zhuǎn)化任何有機(jī)體以便在該有機(jī)體內(nèi)表達(dá)，并產(chǎn)生活性的重組PDAT酶以便提高該有機(jī)體的油量。
3.第1項(xiàng)的DNA分子的用途，其中該DNA用來(lái)轉(zhuǎn)化任何有機(jī)體以防止非所需脂肪酸在膜脂中的積聚。
4.根據(jù)第1項(xiàng)的用途，其中該P(yáng)DAT基因用來(lái)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因的含油有機(jī)體，該有機(jī)體經(jīng)基因操縱可產(chǎn)生任何大量存在于膜脂中時(shí)會(huì)造成有害效應(yīng)的非普通脂肪酸，如中鏈脂肪酸、羥基化脂肪酸、環(huán)氧脂肪酸和乙炔脂肪酸。
5.根據(jù)第1項(xiàng)的用途，其中該P(yáng)DAT基因用來(lái)轉(zhuǎn)化有機(jī)體，且其中該有機(jī)體與其他經(jīng)基因操縱、可產(chǎn)生任何非普通脂肪酸的含油有機(jī)體雜交，該脂肪酸在膜脂中大量存在可造成有害效應(yīng)，其包括中鏈脂肪酸、羥基化脂肪酸、環(huán)氧脂肪酸和乙炔脂肪酸。
6.根據(jù)第1項(xiàng)的用途，其中由該P(yáng)DAT基因或cDNA編碼的酶編碼具有不同的?；禺愋缘腜DAT。
7. 根據(jù)第1項(xiàng)的用途，其中該P(yáng)DAT編碼基因或cDNA源自釀酒酵母，或含有編碼與SEQ ID 2號(hào)PDAT氨基酸序列有30％或更多相同性的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.根據(jù)第1項(xiàng)的用途，其中PDAT編碼基因或cDNA源自釀酒酵母，或含有編碼與SEQ ID 2號(hào)PDAT氨基酸序列有40％或更多相同性的氨基酸序列的核苷酸序列。
9.根據(jù)第1項(xiàng)的用途，其中PDAT編碼基因或cDNA源自釀酒酵母，或含有編碼與SEQ ID 2號(hào)PDAT氨基酸序列有60％或更多相同性的氨基酸序列的核苷酸序列。
10.根據(jù)第1項(xiàng)的用途，其中PDAT編碼基因或cDNA源自釀酒酵母，或含有編碼與SEQ ID 2號(hào)PDAT氨基酸序列有80％或更多相同性的氨基酸序列的核苷酸序列。
11.根據(jù)第1項(xiàng)的用途，其中PDAT編碼基因或cDNA源自植物，或含有編碼與源自擬南芥的PDAT氨基酸序列或與部分玉蜀黍、番茄或粗糙鏈孢霉cDNA克隆對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)(基因)所編碼的蛋白質(zhì)有40％或更多相同性的氨基酸序列的核苷酸序列。
12.轉(zhuǎn)基因含油有機(jī)體，其基因組內(nèi)包括通過(guò)重組DNA技術(shù)或體細(xì)胞雜交轉(zhuǎn)移的PDAT基因。
13.根據(jù)第12項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因含油有機(jī)體，其基因組內(nèi)包括含有特定非普通脂肪酸的底物特異性的PDAT基因和該非普通脂肪酸的基因。
14.根據(jù)第12或13項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，其選自真菌、植物和動(dòng)物。
15.根據(jù)第12或13項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，其選自農(nóng)業(yè)植物。
16.根據(jù)第12或13項(xiàng)、選自農(nóng)業(yè)植物的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，其中該P(yáng)DAT基因在儲(chǔ)存器官特異性啟動(dòng)子的控制下得以表達(dá)。
17.根據(jù)第12或13項(xiàng)、選自農(nóng)業(yè)植物的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，其中該P(yáng)DAT基因在種子啟動(dòng)子的控制下得以表達(dá)。
18.來(lái)自第12-17項(xiàng)有機(jī)體的油。
19.通過(guò)改變天然編碼基因的核苷酸序列，然后產(chǎn)生編碼具有新的?；禺愋缘拿傅幕?，來(lái)改變PDAT?；禺愋缘姆椒?。
20.第1項(xiàng)的DNA分子或其功能片段編碼的蛋白質(zhì)。
21.第20項(xiàng)的蛋白質(zhì)，稱為磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶。
22.具有不同的?；禺愋缘牡?1項(xiàng)的蛋白質(zhì)。
23.第13項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID 2、13、14或15號(hào)(和SEQ ID 1、3、4、5、7、9、10、11或12所示全長(zhǎng)或部分基因編碼的蛋白質(zhì))所示氨基酸序列或與該氨基酸序列至少30％同源的氨基酸序列。
24.自釀酒酵母分離的第23項(xiàng)的蛋白質(zhì)。
一般方法酵母株和質(zhì)粒。此處應(yīng)用的野生型酵母株為FY1679(MATαhis3-Δ200 leu2-Δ1 trp1-Δ6 ura3-52)或W303-1A(MATa ADE2-1 can1-100 his3-11，15 leu2-3，112 trp1-1 ura3-1)(7)。與FY 1679同類的YNR008wKanMX2破壞株，來(lái)自Euroscarf庫(kù)(8)。以5’-TCTCCATCTTCTGCAAAACCT-3’和5’-CCTGTCAAAAACCTTCTCCTC-3’作為引物，利用Taq聚合酶從W303-1A基因組DNA擴(kuò)增到含有YNR008w基因的2751bp的片段，DNA5’旁側(cè)序列582bp，3’旁側(cè)序列183bp。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，將其克隆到pBluescript(pbluescript-pdat)的EcoRV位點(diǎn)。為補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，通過(guò)HindIII-SacI消化從pBluescript釋放克隆片段，然后在pFL39的HindIII和SacI位點(diǎn)間進(jìn)行克隆(9)，以產(chǎn)生pUS1。為過(guò)表達(dá)PDAT基因，將來(lái)自pBluescript質(zhì)粒、僅含5’旁側(cè)DNA 24bp的2202bpEcoRI片段克隆到GAL1-TPK2表達(dá)載體pJN92的BamH1位點(diǎn)，從而產(chǎn)生pUS 4。
微粒體制備。應(yīng)用Stobart和Stymne的方法(11)由日葵(Halianthus annuus)、蓖麻和Crepis palaestina的發(fā)育種子制備微粒體。為獲得酵母的微粒體，在12ml玻璃管中用8ml冰冷緩沖液(20mM Tris-Cl，pH7.9，10mM MgCl2、1mM EDTA、5％(v/v)甘油、1mM DTT、0.3M硫酸銨)重懸1g酵母細(xì)胞(新鮮重量)。向該管內(nèi)加入4ml玻璃珠(直徑0.45-0.5mm)，然后在MSK細(xì)胞勻漿器(B.BraunMelsungen AG，德國(guó))中用力搖晃該管(3×60s)。勻漿后的懸液在6℃以20,000×g離心15分鐘，產(chǎn)生的上清再以100,000×g于6℃離心2小時(shí)。將100,000×g沉淀物重懸于0.1M磷酸鉀中(pH7.2)，-80℃儲(chǔ)存。然后稱之為酵母微粒體粗組分。
脂質(zhì)底物。通過(guò)分別與取自蓖麻和Crepis palaestina的種子的微粒體制品溫育，分別從[1-14C]油酸和[1-14C]亞油酸用酶合成放射標(biāo)記的蓖麻油(12-羥基-9-十八[烷]?；?和斑鳩菊內(nèi)(12，13-環(huán)氧-9-十八[烷]?；?酸(12)。應(yīng)用酶催化(13)或合成(14)的[14C]油酸、[14C]蓖麻油酸或[14C]斑鳩菊酸酰基化，合成在sn-2位點(diǎn)含有14C-標(biāo)記的?；牧字Ｄ憠A(PC)或磷脂酰乙醇胺(PE)。按照(14)所述方法自sn-1-[14C]油基-lyso-PC和未標(biāo)記的油酸合成sn-1位點(diǎn)標(biāo)記的二油基-PC。按照(15)所述方法通過(guò)購(gòu)自B.Cereus(Sigma化學(xué)公司)的XI型磷脂酶C的作用自PC合成sn-1-油基-sn-1-[14C]蓖麻油基-DAG。按照(16)所述方法用TAG-脂酶(RizhopusArrhizus，Sigma化學(xué)公司)從取自Euphorbia lagascae的種子的TAG合成單斑鳩菊基-和二斑鳩菊基-DAG。采用同樣方法用取自蓖麻仁的TAG合成單蓖麻油基-TAG。
脂質(zhì)分析。按照Bligh和Dyer所述方法(17)，在40ml液體培養(yǎng)基中收集酵母細(xì)胞、使之在玻璃珠震蕩器中破碎并用氯仿萃取后，測(cè)量其中的總脂質(zhì)組分，然后用預(yù)包被的硅膠60板(Merck)通過(guò)在己烷/二乙醚/乙酸(80∶20∶1)中薄層層析使之分離。通過(guò)短暫接觸I2蒸氣定位脂質(zhì)區(qū)，通過(guò)恰當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行鑒別。從板中切除極性脂、固醇酯和三酰甘油，以及稱為其他脂質(zhì)的殘余小脂類。通過(guò)在干甲醇中的2％(v/v)硫酸中以85℃加熱干燥切下來(lái)的物質(zhì)60分鐘，來(lái)制備脂肪酸甲酯。用己烷萃取該甲酯，通過(guò)GLC經(jīng)50m×0.32mmCP-Wax58-CB融合硅柱(Chrompack)，甲基十七烷酸作內(nèi)標(biāo)。定量每一組分的脂肪酸含量，用其計(jì)算每一脂類的相對(duì)數(shù)量。為測(cè)量總脂含量，通過(guò)離心收集3ml酵母培養(yǎng)物，產(chǎn)生的沉淀物用蒸餾水洗滌并凍干。測(cè)定干燥細(xì)胞的重量，如上所述在轉(zhuǎn)化成甲酯后通過(guò)GLC分析定量脂肪酸含量。然后按nmol脂肪酸(FA)每mg酵母干重計(jì)算脂質(zhì)含量。
酶分析。過(guò)夜凍干一份發(fā)育的植物種子或酵母細(xì)胞的粗微粒體制品(相當(dāng)于10nmol微粒體PC)。然后將溶于苯的14C-標(biāo)記的底物脂質(zhì)加入到干燥的微粒體中。在N2流下使苯蒸發(fā)，讓脂質(zhì)與膜直接接觸，再加入0.1ml 50mM磷酸鉀(pH 7.2)。完全混勻該懸液，在30℃溫育一定時(shí)間直至90分鐘。用氯仿從反應(yīng)混合物中萃取脂質(zhì)，用硅膠60板(Merck)通過(guò)在己烷/二乙醚/乙酸(35∶70∶1.5)中薄層層析使之分離。通過(guò)電子自顯影技術(shù)(Instant Imager，Packard，US)觀察板上的放射性脂質(zhì)并定量。
酵母培養(yǎng)。在液體YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％胰蛋白胨、2％葡萄糖)、含2％(v/v)甘油和2％(v/v)乙醇的合成培養(yǎng)基(18)或含16g/l甘油的基本培養(yǎng)基(19)中、28℃下、搖床上培養(yǎng)酵母細(xì)胞。
本發(fā)明的特征還可通過(guò)以下非限制性實(shí)施例來(lái)說(shuō)明通過(guò)油籽微粒體不依賴脂酰輔酶A合成TAG。在油籽中可發(fā)現(xiàn)大量非普通脂肪酸(20)。許多此類脂肪酸，例如蓖麻油酸(21)和斑鳩菊酸(22)，是分別以sn-2位含油基或亞油基酯的磷脂酰膽堿(PC)作為直接前體而合成的。然而，即便PC可作為非普通脂肪酸合成的底物并且是主要的種子膜脂，很難在膜中發(fā)現(xiàn)非普通脂肪酸。相反，其主要進(jìn)入TAG中。因此這些非普通的?；鶑腜C有效和選擇性地轉(zhuǎn)移至TAG的機(jī)制一定存在于積累此類非普通脂肪酸的油籽中。該轉(zhuǎn)移的生化特征在蓖麻仁(蓖麻)和Crepis palaestina(分別含大量蓖麻油酸和斑鳩菊酸的植物)和向日葵(Helianthus annuus)(籽油中僅含普通脂肪酸的植物)的種子中得以發(fā)現(xiàn)。使發(fā)育種子的粗微粒體組分與sn-2位含14C-標(biāo)記的油基、蓖麻油基或斑鳩菊基(vernoloyl)的PC溫育。溫育后，萃取脂質(zhì)并通過(guò)薄層層析分析。我們發(fā)現(xiàn)摻入到中性脂質(zhì)組分的放射性活性的數(shù)量在4小時(shí)內(nèi)線性增加(數(shù)據(jù)未列)。80分鐘后分析中性脂質(zhì)組分內(nèi)14C?；姆植?圖1)。有趣的是不同中性脂質(zhì)之間的放射活性的數(shù)量和分布與植物種類和[14C]?；湹念愋兔芮邢嚓P(guān)。這樣，向日葵微粒體將多數(shù)標(biāo)記物摻入到DAG中，而不論14C?；湹念愋腿绾巍Ｏ喾?，蓖麻微粒體優(yōu)先將[14C]蓖麻油基和[14C]斑鳩菊基摻入TAG，而[14C]油基多發(fā)現(xiàn)于DAG。C.palaestina微粒體最后僅將[14C]斑鳩菊基摻入TAG，而[14C]蓖麻油基多存在于游離脂肪酸、[14C]油基存在于DAG中。這表明蓖麻和C.palaestina體內(nèi)的TAG庫(kù)分別含有的高水平蓖麻油酸和斑鳩菊酸，可通過(guò)這些有機(jī)體內(nèi)相應(yīng)的?；l(fā)生了從PC到TAG的有效和選擇性地轉(zhuǎn)移得以解釋。
發(fā)育蓖麻仁的微粒體制品中的三酰甘油體外合成途徑歸納為表1。
PDAT催化不依賴于脂酰-輔酶A的TAG合成的新型酶。研究了在油籽微粒體催化的反應(yīng)中，DAG是否既可作為酰基供體也可作為?；荏w。這樣，在蓖麻微粒體的存在下，使未標(biāo)記的二斑鳩菊基-DAG與sn-1-油基-sn-2-[14C]蓖麻油基-DAG或sn-1-油基-sn-2-[14C]蓖麻油基-PC溫育。與[14C]蓖麻油基-DAG相比，當(dāng)[14C]蓖麻油基-PC作為酰基供體時(shí)，含有[14C]蓖麻油基和斑鳩菊基的TAG分子的合成率提高了5倍(圖.1.B)。這些數(shù)據(jù)表明油籽微粒體以不依賴于脂酰輔酶A的方式合成TAG時(shí)PC是直接的?；w而DAG是?；荏w。這樣，該反應(yīng)是通過(guò)我們稱為磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的新型酶催化的。
酵母微粒體的PDAT活性。在誘導(dǎo)TAG合成的條件下培養(yǎng)野生型酵母細(xì)胞。從這些細(xì)胞制備微粒體膜，使之與sn-2-[14C]蓖麻油基-PC和DAG溫育，分析所形成的14C-標(biāo)記的產(chǎn)物。中性脂質(zhì)組分內(nèi)的PC源[14C]蓖麻油基主要見于游離脂肪酸或TAG中，而且所合成的TAG的量依賴于加入到該反應(yīng)中的DAG的量(圖2)。自外源添加的sn-2-[14C]蓖麻油基-PC和未標(biāo)記的斑鳩菊基-DAG可體外合成既含蓖麻油基又含斑鳩菊基的TAG(體內(nèi)沒有的-類TAG)(圖2，第3道)，明顯說(shuō)明在酵母微粒體膜內(nèi)存在一種不依賴于脂酰輔酶A的TAG合成途徑，該途徑以PC和DAG作為底物。這樣，酵母內(nèi)TAG的合成可由與植物的PDAT相類似的一種酶催化。
酵母PDAT編碼基因。
已知酵母基因組有一種基因(YNR008w)，但對(duì)該基因功能一無(wú)所知，只知道在正常條件下該基因并非生長(zhǎng)所必需。自FVKT004-04C(AL)(8)酵母株制備微粒體膜，在該酵母株中未知功能的上述基因已受到破壞。用sn-2位含有非標(biāo)記脂肪酸的PC來(lái)分析微粒體內(nèi)PDAT的活性。在破壞株中發(fā)現(xiàn)此活性完全消失(圖2，4道)。單拷貝質(zhì)粒pUS1上的YNR008w可部分恢復(fù)該活性(圖2，5道)。另外，磷脂酰乙醇胺(PE)的?；ㄟ^(guò)野生株的微粒體有效地?fù)饺氲絋AG中，而突變株中該底物未發(fā)生變化(數(shù)據(jù)未列)。這說(shuō)明YNR008w編碼可催化?；鶑牧字膕n-2位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到DAG、從而形成TAG的酵母PDAT。應(yīng)指出的是，由于YNR008w基因受到破壞，即便與所添加的麥角固醇溫育，放射性PC未形成膽固醇酯，PC也未形成放射性游離脂肪酸(數(shù)據(jù)未列)。這說(shuō)明酵母PDAT沒有膽固醇酯合成或磷脂酶活性。
過(guò)表達(dá)PDAT的酵母細(xì)胞TAG含量增加。通過(guò)將pUS4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生型酵母株來(lái)研究PDAT編碼基因的過(guò)表達(dá)效應(yīng)，其中該基因在半乳糖-誘導(dǎo)的GAL1TPK2啟動(dòng)子下表達(dá)。含空表達(dá)載體的細(xì)胞作為對(duì)照。在合成的甘油-乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞，添加半乳糖后2小時(shí)(早對(duì)數(shù)期)或25小時(shí)(靜止期)該基因的表達(dá)得以誘導(dǎo)。然后再溫育細(xì)胞21小時(shí)，然后收集之并進(jìn)行分析。通過(guò)光密度測(cè)量我們發(fā)現(xiàn)PDAT過(guò)表達(dá)對(duì)生長(zhǎng)速度沒有明顯的影響。然而PDAT過(guò)表達(dá)株中以μmol脂肪酸每mg酵母干重表示的脂質(zhì)總量要比對(duì)照增加47％(對(duì)數(shù)期)或29％(靜止期)。還有，PDAT過(guò)表達(dá)不改變極性脂和固醇脂的含量。相反，這些細(xì)胞內(nèi)升高的脂質(zhì)量完全是由于TAG含量增加所致(圖3A，B)。這樣，PDAT過(guò)表達(dá)的早對(duì)數(shù)期細(xì)胞內(nèi)TAG增加2倍，靜止期細(xì)胞內(nèi)增加40％。有趣的是，即使在DAGAT得以誘導(dǎo)并因此明顯促進(jìn)TAG合成的條件下(即靜止期)，過(guò)表達(dá)PDAT可使TAG含量明顯增加。PDAT過(guò)表達(dá)株微粒體中測(cè)得的體外PDAT活性比對(duì)照株高7倍，這與我們觀察到的體內(nèi)TAG升高水平相一致(圖3C)。這些結(jié)果清楚地說(shuō)明PDAT基因具有提高轉(zhuǎn)基因有機(jī)體內(nèi)含油量的潛在用途。
酵母PDAT的底物特異性。用取自PDAT過(guò)表達(dá)株的微粒體分析酵母PDAT的底物特異性(見圖4)。以二油基-PC作為供體，在圖4所給條件下TAG的合成率為0.15nmol每分鐘和每mg蛋白。標(biāo)記PC的兩個(gè)油基的話，可在給定條件下檢測(cè)到11pmol/min[14C]油基鏈到TAG的轉(zhuǎn)移和15pmol/min lyso-PC的形成。在PDAT缺陷株的微粒體中，未檢測(cè)到TAG，僅檢測(cè)到痕量lyso-PC，這明顯說(shuō)明PC和DAG作為底物時(shí)酵母PDAT催化TAG和lyso-PC等摩爾形成。lyso-PC比TAG形成稍多的現(xiàn)象可通過(guò)酵母微粒體內(nèi)存在磷脂酶來(lái)解釋，后者自PC產(chǎn)生lyso-PC和未酯化的脂肪酸。
通過(guò)使微粒體與sn-1位(圖4A柱2)或sn-2位(圖4A柱3)帶有[14C]?；亩突?PC溫育，來(lái)研究酵母PDAT對(duì)不同?；稽c(diǎn)的特異性。我們發(fā)現(xiàn)前者形成的主要14C-標(biāo)記產(chǎn)物是lyso-PC而后者是TAG。我們總結(jié)為酵母PDAT具有將磷脂sn-2位的酰基轉(zhuǎn)移到DAG的特異性，從而形成sn-1-lyso-PC和TAG。在給定分析條件下，通過(guò)CDP膽堿膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶的可逆作用sn-1標(biāo)記的PC可形成痕量14C-標(biāo)記的DAG。該標(biāo)記的DAG然后可通過(guò)PDAT活性進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為TAG。這樣難以判斷sn-1位含[14C]酰基的二油基-PC存在時(shí)所形成的痕量標(biāo)記TAG，是直接由也可作用于sn-1位點(diǎn)的PDAT從sn-1-標(biāo)記的PC合成的，還是其首先轉(zhuǎn)化為sn-1-標(biāo)記的DAG，然后通過(guò)對(duì)PCsn-2位點(diǎn)的?；D(zhuǎn)移有嚴(yán)格選擇性的PDAT發(fā)生酰化?？傊@表明YNR008w編碼的PDAT催化PC sn-2位?；D(zhuǎn)移至DAG，從而形成TAG和lyso-PC。
酵母PDAT的底物特異性還根據(jù)酰基供體的先導(dǎo)基團(tuán)、所轉(zhuǎn)移的?；褪荏wDAG分子的?；湹靡苑治觥ａ劸平湍傅膬煞N主要膜脂是PC和PE，如圖4B(柱1和柱2)所示，在PDAT催化的反應(yīng)中，作為?；w的二油基-PE的效率比二油基-PC高近4倍。另外，?；D(zhuǎn)移率明顯依賴于所轉(zhuǎn)移的酰基類型。這樣，PC sn-2位點(diǎn)的蓖麻油基以比同樣位點(diǎn)的油基高2.5倍的效率轉(zhuǎn)移至TAG(圖4B，柱1和3)。相反，酵母PDAT不能在轉(zhuǎn)移油基前優(yōu)先轉(zhuǎn)移斑鳩菊基(圖4B，柱1和4)。受體DAG分子的?；溡灿绊懛磻?yīng)效率。這樣，含蓖麻油基或斑鳩菊基的DAG比起二油基DAG來(lái)是更有效的?；荏w(圖4B，柱1、5和6)?？傊@些結(jié)果清楚說(shuō)明PDAT-催化的?；D(zhuǎn)移效率明顯依賴于脂質(zhì)底物的特性。
PDAT基因。幾種PDAT基因的核苷酸和氨基酸序列見SEQ ID 1至15號(hào)。SEQ ID 16至20和21至31還分別給出了暫定和/或部分序列。擬南芥基因組序列(SEQ ID 4號(hào))的一種是一EST cDNA克隆；T04806。該cDNA克隆的特征已完全搞清，其核苷酸序列如SEQ ID 5號(hào)所示?；赥04806 cDNA和擬南芥基因組DNA序列(SEQ ID 4號(hào))的序列同源性，很明顯cDNA克隆的417位多出一個(gè)A(數(shù)據(jù)未列)。去掉此核苷酸可產(chǎn)生SEQ ID 12號(hào)所示氨基酸序列。
表達(dá)酵母PDAT的擬南芥的種子中TAG含量增加。為在擬南芥中表達(dá)酵母PDAT基因，將pBluescript-PDAT的EcoRI片段與napin啟動(dòng)子(25)一起克隆入pGPTV-kan載體(26)。鑒定含正確方向的酵母PDAT基因的質(zhì)粒(pGNapPDAT)，將其轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌。采用根轉(zhuǎn)化法(27)用這些細(xì)菌轉(zhuǎn)化擬南芥哥倫比亞植株(C-24)。用空載體轉(zhuǎn)化的植物作為對(duì)照。
收集第一代種子(T1)，使之在含卡那霉素的培養(yǎng)基中發(fā)芽。從植物個(gè)體收集第二代種子(T2)，使之與2％硫酸(甲醇中)在85℃作用1、5小時(shí)而發(fā)生甲基化后，通過(guò)利用氣液層析定量其甲基酯來(lái)分析其脂肪酸含量。定量時(shí)以十七烷酸甲基酯作為內(nèi)標(biāo)。自轉(zhuǎn)化pGNapPDAT起，一個(gè)T1植物(26-14)產(chǎn)生七個(gè)T2植物，其中3個(gè)所產(chǎn)生的種子比起空載體轉(zhuǎn)化的T1植物32-4所產(chǎn)生的T2植物的種子來(lái)，含油量在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上(雙側(cè)檢驗(yàn)的均差)較高(表2)。
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圖1.
植物微粒體對(duì)14C-標(biāo)記的PC進(jìn)入中性脂質(zhì)組分的代謝過(guò)程。(A)來(lái)自向日葵、蓖麻和C.palaestina的發(fā)育種子的微粒體與sn-1位含有油酸和sn-2位含有14C-標(biāo)記的油酸、蓖麻油酸或斑鳩菊酸的PC(8nmol)在30℃溫育80分鐘。應(yīng)用薄層層析和隨后的電子放射自顯影，對(duì)TAG(空白柱)、DAG(實(shí)心柱)和未酯化的脂肪酸(斜紋柱)的放射活性進(jìn)行定量，結(jié)果以所加標(biāo)記底物的百分比表示。(B)由蓖麻的微粒體體外合成含有兩個(gè)斑鳩菊基和一個(gè)[14C]蓖麻油基的TAG。所加底物是未標(biāo)記的二斑鳩菊基-DAG(5nmol)，和sn-1-油基-sn-2-[14C]蓖麻油基-DAG(0.4nmol，7700dpm/nmol)或sn-1-油基-sn-2-[14C]蓖麻油基-PC(0.4nmol，7700dpm/nmol)。微粒體與底物在30℃溫育30分鐘，然后如“一般方法”所述取出樣本進(jìn)行脂質(zhì)分析。該數(shù)據(jù)為兩次實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果。
圖2.
根據(jù)TLC上分離的中性脂質(zhì)產(chǎn)物的自顯影圖象觀察的酵母PDAT活性。取自野生型FY1679酵母株(1-3道)、YNR008w受到破壞的同類酵母株(FVKT004-04C(AL))(4道)或轉(zhuǎn)化有pUS1質(zhì)粒、天然啟動(dòng)子后帶有YNR008w的同樣破壞株(5道)的微粒體，進(jìn)行PDAT活性分析。作為底物，我們使用2nmol sn-1-油基-sn-2-[14C]蓖麻油基-PC和5nmol二油基-DAG(2、4和5道)或rac-油基-vernoleoyl-DAG(3道)。按照材料和方法中所述進(jìn)行酶分析和脂質(zhì)分析。細(xì)胞在YPD液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)20h，收集之并重懸于等體積的含16g/l甘油的最低培養(yǎng)基(19)中。然后使細(xì)胞再生長(zhǎng)24h并收集之。通過(guò)使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在無(wú)尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(18)中生長(zhǎng)來(lái)篩選質(zhì)粒并維持之?？s略語(yǔ)1-OH-TAG，單蓖麻油基-TAG；1-OH-1-ep-TAG，單蓖麻油基-單斑鳩菊基-TAG；OH-FA，未酯化蓖麻油酸。
圖3.
PDAT過(guò)表達(dá)酵母細(xì)胞中脂質(zhì)含量(A，B)和PDAT活性(C)。pUS4質(zhì)粒中的PDAT基因在野生W303-1A株中半乳糖誘導(dǎo)的GAL1-TPK2啟動(dòng)子作用下過(guò)量表達(dá)(7)。其表達(dá)在添加2％(w/v)終濃度的半乳糖后(A)2小時(shí)或(B)25小時(shí)得以誘導(dǎo)。然后再培養(yǎng)細(xì)胞22小時(shí)并收集。通過(guò)GLC-分析其脂肪酸含量來(lái)測(cè)定所收集細(xì)胞的脂質(zhì)含量，表示為在TAG(空白柱)、極性脂(斜紋柱)、固醇酯(實(shí)心柱)和其他脂質(zhì)(條紋柱)中μmol脂肪酸每mg干重。數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立的酵母培養(yǎng)物的平均結(jié)果。(C)由取自含有空載體(載體)或PDAT質(zhì)粒(+PDAT)的酵母細(xì)胞的微粒體體外合成TAG，該細(xì)胞按照?qǐng)D3A培養(yǎng)。將二油基-DAG(2.5nmol)和sn-1-油基-sn-2-[14C]油基-PC(2nmol)底物脂添加到一份微粒體中(10nmol PC)，然后在28℃溫育10分鐘。摻入到TAG中的標(biāo)記物的量通過(guò)電子放射自顯影進(jìn)行定量。結(jié)果為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖4.
酵母PDAT的底物特異性。通過(guò)使整份凍干的微粒體(10nmol PC)與脂質(zhì)底物在30℃下溫育10分鐘(A)或90分鐘(B)來(lái)分析PDAT活性。未標(biāo)記的DAG(2.5nmol)和不同的標(biāo)記磷脂用作底物，如圖中所示。(A)酵母PDAT對(duì)?；w底物的sn位點(diǎn)的特異性。二油基-DAG與sn-1-[14C]油基-sn-2-[14C]油基-PC(二-[14C]-PC)、sn-1-[14C]油基-sn-2-油基-PC(sn1-[14C]-PC)或sn-1-油基-sn-2-[14C]油基-PC(sn2-[14C]-PC)。(B)酵母PDAT對(duì)磷脂先導(dǎo)基團(tuán)和磷脂的?；M成以及二酰甘油的特異性。二油基-DAG和sn-1-油基-sn-2-[14C]油基-PC(油基-PC)、sn-1-油基-sn-2-[14C]油基-PE(油基-PE)、sn-1-油基-sn-2-[14C]蓖麻油基-PC(蓖麻油基-PC)或sn-1-油基-sn-2-[14C]斑鳩菊基-PC(斑鳩菊基-PC)。在最右邊2個(gè)柱形圖中的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用單蓖麻油基-DAG(蓖麻油基-DAG)或單斑鳩菊基-DAG(斑鳩菊基-DAG)與sn-1-油基-sn-2-[14C]油基-PC。摻入到TAG(實(shí)心柱)和lyso-PC(LPC，空白柱)的標(biāo)記物通過(guò)電子自顯影來(lái)定量。結(jié)果是兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。應(yīng)用的微粒體來(lái)自在GAL1-TPK2啟動(dòng)子下過(guò)表達(dá)PDAT基因的W303-1A細(xì)胞，如圖3所述。該表達(dá)在早靜止期得以誘導(dǎo)，再培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞。
表1在發(fā)育的蓖麻仁微粒體制品中體外合成三酰甘油。凍干整份微粒體(20nmol PC)，將底物脂質(zhì)加到苯溶液中(A)0.4nmol[14C]-DAG(7760dpm/nmol)及所指的1.6nmol未標(biāo)記DAG；(B)0.4nmol[14C]-DAG(7760dpm/nmol)及5nmol未標(biāo)記的二-蓖麻油基-PC和(C)0.25nmol[14C]-PC(4000dpm/nmol)及5nmol未標(biāo)記的DAG。通過(guò)N2使苯蒸發(fā)，然后加入0.1ml 50mM磷酸鉀，充分混勻并在30℃下溫育(A)20分鐘；(B)和(C)30分鐘。通過(guò)在氯仿中萃取脂質(zhì)來(lái)終止分析。然后在硅膠60板上(Merck；Darmstadt，德國(guó))，己烷/二乙醚/乙酸(35∶70∶1.5)中薄層層析使脂質(zhì)分離。觀察具有放射活性的脂質(zhì)，通過(guò)電子自顯影(Instant Imager，Packard，US)定量板上的放射活性。結(jié)果為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。
不同的三酰甘油(TAG)中均有放射活性。所用縮略語(yǔ)1-OH-，單-蓖麻油基；2-OH-，二-蓖麻油基-；3-OH-，三-蓖麻油基；1-OH-1-ver，單-蓖麻油基-單-斑鳩菊基；1-OH-2-ver，單-蓖麻油基-二-斑鳩菊基。利用酶制備放射性標(biāo)記的DAG和PC。放射標(biāo)記的蓖麻油基位于脂質(zhì)的sn-2位點(diǎn)，非標(biāo)記的油基位于sn-1位點(diǎn)。通過(guò)TAG脂酶(6)Euphorbia lagascae或蓖麻仁油分別制備含斑鳩菊基或蓖麻油基鏈的未標(biāo)記DAG。合成的二-蓖麻油基—PC由Metapontum Agribios(意大利)惠贈(zèng)。
表2每mg收集自擬南芥植物個(gè)體的T2種子的總脂肪酸含量，該植物轉(zhuǎn)化有napin啟動(dòng)子控制下的PDAT基因或轉(zhuǎn)化有空白載體(32-4)。
*＝對(duì)照植物和PDAT轉(zhuǎn)化植物雙側(cè)檢驗(yàn)的均差的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，α＝5。
序列說(shuō)明SEQ ID NO.1釀酒酵母PDAT基因，YNR008w的基因組DNA序列和可能氨基酸序列，GenBank登記號(hào)為Z71623和Y13139，核苷酸ID號(hào)為1302481。
SEQ ID NO.2來(lái)自釀酒酵母可能開放閱讀框架YNR008w的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3粟酒裂殖酵母基因SPBC776.14的基因組DNA序列。
SEQ ID NO.4部分?jǐn)M南芥基因座的基因組DNA序列，GenBank登記號(hào)為AB006704。
SEQ ID NO.5擬南芥cDNA克隆的核苷酸序列，GenBank登記號(hào)為T04806、核苷酸ID號(hào)為315966。
SEQ ID NO.6擬南芥cDNA克隆的預(yù)計(jì)氨基酸序列，GenBank登記號(hào)為T04806。
SEQ ID NO.7玉米EST克隆的核苷酸和氨基酸序列，GenBank登記號(hào)為AI491339和核苷酸ID號(hào)為4388167。
SEQ ID NO.8玉米EST克隆的推知的氨基酸序列，GenBank登記號(hào)為AI491339和核苷酸ID號(hào)為4388167。
SEQ ID NO.9粗糙鏈孢霉EST克隆WO7G1的部分DNA序列，GenBank登記號(hào)為AI398644和核苷酸ID號(hào)為4241729。
SEQ ID NO.10部分?jǐn)M南芥基因座的基因組DNA序列，GenBank登記號(hào)為AC004557。
SEQ ID NO.11部分?jǐn)M南芥基因座的基因組DNA序列，GenBank登記號(hào)為AC003027。
SEQ ID NO.12部分番茄cDNA克隆的DNA序列，GenBank登記號(hào)為AI486635。
SEQ ID NO.13粟酒裂殖酵母基因SPBC776.14的粟酒裂殖酵母推知開放閱讀框架CAA22887的氨基酸序列。
SEQ ID NO.14來(lái)自擬南芥基因座的擬南芥推知的開放閱讀框架AAC80628的氨基酸序列，GenBank登記號(hào)為AC004557。
SEQ ID NO.15來(lái)自擬南芥基因座的擬南芥推知的開放閱讀框架AAD10688的氨基酸序列，GenBank登記號(hào)為AC003027。
通過(guò)下列SEQ ID限定的進(jìn)一步暫定和/或部分序列SEQ ID NO.16來(lái)自釀酒酵母的酵母ORF YNR008w的氨基酸序列。
SEQ ID NO.17擬南芥基因組序列(AC004557)區(qū)的氨基酸序列。
SEQ ID NO.18擬南芥基因組序列(AB006704)區(qū)的氨基酸序列。
SEQ ID NO.19來(lái)自釀酒酵母的酵母ORF YNR008w的相應(yīng)的基因組DNA序列和氨基酸序列。
SEQ ID NO.20來(lái)自釀酒酵母的酵母ORF YNR008w的氨基酸序列，該序列來(lái)自相應(yīng)的基因組DNA序列。
SEQ ID NO.21GenBank核苷酸ID號(hào)為1302481的釀酒酵母PDAT基因YNR008w的基因組DNA序列和可能的YNR008w氨基酸序列。
SEQ ID NO.22來(lái)自釀酒酵母基因的酵母基因YNR008w的可能氨基酸序列。
SEQ ID NO.23粟酒裂殖酵母基因SPBC776.14的基因組DNA序列。
SEQ ID NO.24GenBank登記號(hào)為AB006704的部分?jǐn)M南芥基因座的基因組DNA序列。
SEQ ID NO.25GenBank登記號(hào)為T04806、ID號(hào)為315966的擬南芥EST-克隆的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。
SEQ ID NO.26GenBank ID號(hào)為4388167的玉米cDNA克隆的核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO.27GenBank ID號(hào)為4388167的mays cDNA克隆的氨基酸序列。
SEQ ID NO.28ID號(hào)為4241729的部分粗糙鏈孢霉cDNA克隆WO7G1的DNA序列。
SEQ ID NO.29GenBank登記號(hào)為AC004557的部分?jǐn)M南芥基因座的基因組DNA序列。
SEQ ID NO.30GenBank登記號(hào)為AC003027的部分?jǐn)M南芥基因座的基因組DNA序列。
SEQ ID NO.31GenBank登記號(hào)為AI486635的部分番茄cDNA克隆的DNA序列。
序列表<110>BASF AG<120>產(chǎn)生三酰甘油的生物合成途徑中的新型酶類及編碼該酶類的重組DNA分子<130>BASF-NAE-3377-99-Sept-2000<140>PCT/EP 00/02701<141>2000-03-23<160>31<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1986<212>基因組DNA<213>釀酒酵母<220><221>CDS<222>(1)..(1983)<400>1atg ggc aca ctg ttt cga aga aat gtc cag aac caa aag agt gat tct 48Met Gly Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Gln Asn Gln Lys Ser Asp Ser1 5 10 15gat gaa aac aat aaa ggg ggt tct gtt cat aac aag cga gag agc aga 96Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg20 25 30aac cac att cat cat caa cag gga tta ggc cat aag aga aga agg ggt 144Asn His Ile His His Gln Gln Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly35 40 45att agt ggc agt gca aaa aga aat gag cgt ggc aaa gat ttc gac agg 192Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg50 55 60aaa aga gac ggg aac ggt aga aaa cgt tgg aga gat tcc aga aga ctg 240Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu65 70 75 80att ttc att ctt ggt gca ttc tta ggt gta ctt ttg ccg ttt agc ttt 288Ile Phe Ile Leu 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權(quán)利要求
1.在產(chǎn)生三酰甘油的生物合成途徑中以不依賴于脂酰輔酶A的反應(yīng)催化脂肪酸自磷脂轉(zhuǎn)移至二酰甘油中的酶。
2.權(quán)利要求1的酶，包括SEQ ID 2號(hào)氨基酸序列或其功能片段、衍生物、等位體、同源物或同工酶。
3.權(quán)利要求1或2的酶，稱為磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的。
4.權(quán)利要求1到3的酶，包括SEQ ID 16、20或22號(hào)所示氨基酸序列，或其功能片段、衍生物、等位體、同源物或同工酶。
5.權(quán)利要求1到4的酶，包括選自由SEQ ID 6、8、13、14、15、17、18、25或27號(hào)所示序列組成的組別的氨基酸序列，或其或其功能片段、衍生物、等位體、同源物或同工酶。
6.權(quán)利要求1到5的酶，包括由選自SEQ ID 1、3、4、5、7、9、10、11、12、19、21、23、24、25、26、28、29、30或31號(hào)所示序列組的核苷酸序列、其部分、衍生物、等位體或同源物所編碼之氨基酸序列，或編碼該酶的氨基酸序列的功能片段、衍生物、等位體、同源物或同工酶。
7.在產(chǎn)生三酰甘油的生物合成途徑中以不依賴于脂酰輔酶A的反應(yīng)催化脂肪酸自磷脂轉(zhuǎn)移至二酰甘油中的酶的編碼核苷酸序列。
8.權(quán)利要求7的核苷酸序列，編碼稱為磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的酶。
9.權(quán)利要求7或8的核苷酸序列，選自SEQ ID 1、3、4、10、11、19、21、23、24、29或30號(hào)所示序列，或其部分、衍生物、等位體或同源物。
10.與權(quán)利要求7到9的全長(zhǎng)核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的部分核苷酸序列，選自SEQ ID 5、7、9、12、25、26、28或31，或其部分、衍生物、等位體或同源物。
11.權(quán)利要求7到10的核苷酸序列，包括與選自SEQ ID 1、3、4、5、7、9、10、11、12、19、21、23、24、25、26、28、29、30或31號(hào)所示序列組的核苷酸序列至少有40％同源性的核苷酸序列。
12.包括有操縱性連至異源核酸的、權(quán)利要求7到11的核苷酸序列的基因構(gòu)建體。
13.包括權(quán)利要求7到11的核苷酸序列或權(quán)利要求12的基因構(gòu)建體的載體。
14.權(quán)利要求13的載體，其為表達(dá)載體。
15.權(quán)利要求13或14的載體，還包括可選擇的標(biāo)志基因和/或用來(lái)在宿主細(xì)胞中復(fù)制或整合入宿主細(xì)胞基因組的核苷酸序列。
16.含有權(quán)利要求7到11的核苷酸序列和/或權(quán)利要求12的基因構(gòu)建體和/或權(quán)利要求13到15的載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體。
17.權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體，其為真核細(xì)胞或有機(jī)體。
18.權(quán)利要求16或17的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體，其為酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞或植物。
19.權(quán)利要求16到18的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體，其具有改變的三酰甘油生物合成途徑。
20.權(quán)利要求16到19的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體，其中含油量發(fā)生了改變。
21.權(quán)利要求16到20的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體，其中PDAT活性發(fā)生改變。
22.權(quán)利要求16到21的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體，其中PDAT活性改變的特征為基因表達(dá)、催化活性和/或酶活性調(diào)節(jié)發(fā)生改變。
23.權(quán)利要求16到22的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體，其中發(fā)生改變的三酰甘油生物合成途徑的特征為防止非所需脂肪酸在膜脂中積聚。
24.三酰甘油的生產(chǎn)方法，包括在一定條件下使權(quán)利要求16到23的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或有機(jī)體生長(zhǎng)，籍此權(quán)利要求7到11的核苷酸序列得以表達(dá)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法生產(chǎn)的三酰甘油。
26.權(quán)利要求7到11的核苷酸序列和/或權(quán)利要求1到6的酶用于產(chǎn)生三酰甘油和/或含非普通脂肪酸的三酰甘油的用途。
27.權(quán)利要求7到11的核苷酸序列和/或權(quán)利要求1到6的酶的用途，用于轉(zhuǎn)化任何細(xì)胞或有機(jī)體繼而在該細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)得以表達(dá)并導(dǎo)致該細(xì)胞或有機(jī)體的含油量發(fā)生改變，優(yōu)選升高。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼在產(chǎn)生三酰甘油的生物合成途徑中催化脂肪酸自磷脂轉(zhuǎn)移到二酰甘油的酶的核苷酸序列的分離、鑒別和表征,涉及該酶和三酰甘油的產(chǎn)生方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1362994SQ00805998
公開日2002年8月7日 申請(qǐng)日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月1日
發(fā)明者A·達(dá)爾奎斯特, U·斯塔爾, M·倫曼, A·巴納斯, H·龍納, S·斯蒂姆尼 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)股份有限公司