專利名稱：維持和擴(kuò)增造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的方法和儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景本發(fā)明涉及維持和擴(kuò)增(expansion)造血干細(xì)胞的方法和儀器。更詳細(xì)的說，本發(fā)明涉及用于維持和/或擴(kuò)增造血干細(xì)胞和/或用于產(chǎn)生維持和/或擴(kuò)增造血干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的三維基質(zhì)細(xì)胞活塞流動生物反應(yīng)器。
哺乳動物中的造血系統(tǒng)由細(xì)胞的異質(zhì)群體組成，其功能的范圍從具有有限增殖潛在性的成熟細(xì)胞至具有廣泛增殖、分化和自身更新能力的多能的干細(xì)胞(1-3)。造血干細(xì)胞(HSC)唯一需要移植后的造血重組并用作基因治療的主要目標(biāo)。盡管干細(xì)胞在維持造血系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，它們在造血組織中極低的出現(xiàn)率、以及在來自體內(nèi)條件下，在延長時(shí)間階段維持或擴(kuò)增未分化干細(xì)胞的有限的能力，不僅保留這些細(xì)胞的基本臨床應(yīng)用的主要缺點(diǎn)，而且反映目前的不可用性，和對新的干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑的需求。
人們已廣泛接受這樣的事實(shí)，即干細(xì)胞在體內(nèi)與骨髓內(nèi)的分散生態(tài)位(4-6)緊密相關(guān)，借助細(xì)胞-細(xì)胞接觸或近程相互作用，它提供共同介導(dǎo)它們的分化作用和自身更新的分子信號(7)。這些生態(tài)位是“造血誘導(dǎo)微環(huán)境”(HIM)的一部分，由骨髓基質(zhì)細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成(8)。通過提供細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)和有利于細(xì)胞-細(xì)胞接觸的基底膜成分，骨髓基質(zhì)細(xì)胞維持HIM的功能完整(9-11)。它們也提供用于可控制的造血細(xì)胞分化和增殖需要的多種可溶性或停留細(xì)胞因子(12-14)。
鑒于以上事實(shí)，開發(fā)用于延長維持人HSC的培養(yǎng)系統(tǒng)的努力主要集中在使用預(yù)先建立的原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層上就不感到奇怪了。這些包括長期培養(yǎng)的未照射(Dexter，15)或照射(16-19)的人原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及人或鼠基質(zhì)細(xì)胞系(16，19-24)，含有或不含有外源性加入的細(xì)胞因子。HSC輸出試驗(yàn)最初依賴于這樣的細(xì)胞產(chǎn)生骨髓后代(長期培養(yǎng)起始細(xì)胞；LTC-IC)的能力或依賴于在這樣的基質(zhì)細(xì)胞上延長(5-7周)培養(yǎng)后生成具有圓石塊(cobblestone)形態(tài)學(xué)(形成細(xì)胞的圓石塊；CAFC)集落的能力(16，17)。盡管廣泛使用LTC-IC和CAFC試驗(yàn)，然而，它們檢測高度原始的祖細(xì)胞而非真正種群恢復(fù)的造血干細(xì)胞(25，26)變得越來越明顯。
最近開發(fā)的人干細(xì)胞試驗(yàn)檢測SCID種群恢復(fù)的細(xì)胞(SRC)，其對非肥胖性糖尿病(NOD)/SCID小鼠的骨髓提供居所(home)(27)，在那里它產(chǎn)生人的髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞胞樣的和CD34+祖細(xì)胞群體(28-30)。在表達(dá)CD34+38-表面抗原(31)的造血細(xì)胞部分廣泛發(fā)現(xiàn)SRC且在CB(1/3×105細(xì)胞)中它的出現(xiàn)次數(shù)與BM(1/9×105細(xì)胞)或流動的PB(1/6×106細(xì)胞)相比是豐富的。最近研究顯示SRC殘留在CD34+/38-/CXCR4+細(xì)胞的亞種群中(33)。CXCR4，系因子基質(zhì)趨化細(xì)胞衍化因子1的表面受體(SDF-1，34)，對NOD/SCID骨髓中的人造血干細(xì)胞返回(homing)和移入顯然是必要的(33)。
旨在誘導(dǎo)延長的維持/擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上人HSC的研究主要建立在作為終點(diǎn)試驗(yàn)的CAFC、LTC-IC或CD34+38-表型上(16，19-24)。關(guān)于在基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上維持/擴(kuò)增SRC很少的報(bào)道沒能說明明顯的長期支持。例如，發(fā)現(xiàn)同種異體人骨髓誘導(dǎo)短期(7天)SRC維持，隨后在活性上迅速、明顯下降(6倍)(26)。支持在基質(zhì)細(xì)胞層上的可移植人干細(xì)胞長期維持/擴(kuò)增的不可能性可歸因于與這些細(xì)胞的體外培養(yǎng)有關(guān)的幾個因素。在這些因素當(dāng)中，一種因素可包括基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層的用途，其并不反映在天然的、三維結(jié)構(gòu)的骨髓上的體內(nèi)生長條件。這樣的條件可減少基質(zhì)細(xì)胞提供最佳的、適宜的支持微環(huán)境的能力以及基質(zhì)細(xì)胞定位于特定的生態(tài)位和與基質(zhì)細(xì)胞及它們的產(chǎn)物物理相互作用的能力。的確，通過與它們在這樣細(xì)胞的單細(xì)胞層的增殖相比較的那樣，在3D膠原基質(zhì)上接種的基質(zhì)細(xì)胞的人造血細(xì)胞系的優(yōu)先生長可提供造血祖細(xì)胞生物活性的三維(3D)結(jié)構(gòu)重要性的證據(jù)(35)。更重要的是，最近顯示與單獨(dú)或在骨髓基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層上培養(yǎng)的細(xì)胞相比較，3D鉭包衣的多孔生物材料增強(qiáng)獼猴L(fēng)TCIC或CD34+38-細(xì)胞的短期維持(36)。然而，未研究基質(zhì)細(xì)胞包衣的3D載體的作用。
最近研究已顯示鼠AFT024細(xì)胞系在支持2-3周的人CB SRC幸存活和維持(盡管未擴(kuò)大培養(yǎng))中優(yōu)于人基質(zhì)(37)。已發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系表達(dá)幾種新的編碼膜結(jié)合蛋白質(zhì)的HIM基因(21，38，39)，它在干細(xì)胞生理學(xué)中具有基本作用。在更密切模擬它們的3D骨髓微環(huán)境的條件下，這些和其它的基因經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞可能的表達(dá)(并因此使它們達(dá)到最佳的、生理功能活性)能夠得以測定。
廣泛研究已顯示基質(zhì)非接觸培養(yǎng)基(19，21，22，40，41)或基質(zhì)條件培養(yǎng)基(SCM)(21，42-44)單獨(dú)或與細(xì)胞因子一起能夠支持體內(nèi)維持或擴(kuò)增原生造血祖細(xì)胞。也已顯示SCM改善這樣的細(xì)胞的恢復(fù)和傳導(dǎo)效力(45，46)。當(dāng)這些發(fā)現(xiàn)再次強(qiáng)調(diào)可溶性基質(zhì)細(xì)胞因子的重要性時(shí)，在這樣的試驗(yàn)中LTC-IC、CAFC或CD34+38-的終點(diǎn)的用途不能反映SCM在維持/擴(kuò)增可移植性HSC的作用。此外，人們并不知道從基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞層培養(yǎng)基中得到的這樣的SCM是否確實(shí)包含參與人HSC生理學(xué)的所有與基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的基因產(chǎn)物。
最近針對來自體內(nèi)擴(kuò)增的可移植性造血干細(xì)胞的注意力已集中在建立細(xì)胞因子補(bǔ)充的懸浮培養(yǎng)液(47-53)上面。這些研究已幫助鑒定用于該目的主要相關(guān)細(xì)胞因子，例如，早期作用的細(xì)胞因子如干細(xì)胞因子(SCF)、FLT3配體和血小板生成素(TPO)。然而，已得到變化的結(jié)果，指明在培養(yǎng)2-4周期間(47，53)后短期喪失(48，49)、維持(50-52)、以及一些少有的SRC擴(kuò)增實(shí)例。在3D生長條件下，這些細(xì)胞因子和干細(xì)胞支持SRC的維持/擴(kuò)增的內(nèi)在活性的能力尚未定義。
因此，人們廣泛意識到需要具有可移植性造血干細(xì)胞來自體內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)和維持的方法和儀器，且它是高度有利的，這避免以上的局限性，與先有技術(shù)相比較具有優(yōu)越的結(jié)果。
因此，本發(fā)明的一個方面提供擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，方法包括以下步驟(a)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和步驟(b)將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的另一個特征，該方法還包括分離未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明另一方面提供擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，方法包括以下步驟(a)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)在含有基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基上培養(yǎng)未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供制備用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的方法，方法包括以下步驟(a)在以片的形式存在的底物上于靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中建立基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)當(dāng)已獲得所需的基質(zhì)細(xì)胞密度時(shí)，從靜止相活塞流動生物反應(yīng)器上收集培養(yǎng)基，由此獲得用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一方面提供將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植至受體(recipient)中的方法，方法包括以下步驟(a)通過以下步驟擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，包括(i)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和(ii)將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中，其中在以片的形式存在的底物上，已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)將從步驟(a)生成的未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植至受體中。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的另一個特征，該方法還包括在步驟(b)前分離未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明另一方面提供把未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植至受體中的方法，方法包括以下步驟(a)通過以下步驟擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，包括(i)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和(ii)在包含基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供生物反應(yīng)器活塞，活塞包括具有一個出口和一個入口的容器，且其中含有以片的形式存在的底物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，底物支持至少每立方厘米底物5×106個基質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供包含以上生物反應(yīng)器活塞的活塞流動生物反應(yīng)器。
按照以下描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中另外的特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動的體循環(huán)血和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個體。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個體。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米底物5×106個細(xì)胞的密度。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米底物107個細(xì)胞的密度。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，當(dāng)接種后生物反應(yīng)器中的流動切斷至少10小時(shí)時(shí)，進(jìn)行將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中的步驟。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，纖維形成總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維組成，纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述基質(zhì)由具有2微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成。按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的另外特征，纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)材料選自聚酯類、聚烯烴、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
通過提供更有效擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞的方法，本發(fā)明成功克服目前已知構(gòu)型的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的方法和生物反應(yīng)器的實(shí)施可包括人工、自動或它們的聯(lián)合進(jìn)行或完成選擇的任務(wù)或步驟。此外，按照本發(fā)明的方法和生物反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)際儀器操作和設(shè)備，通過在任何固件的任何操作系統(tǒng)的硬件或軟件或它們的聯(lián)合，能夠?qū)嵤追N選擇的步驟。例如，作為硬件，本發(fā)明選擇的步驟能夠作為芯片或電路實(shí)施。作為軟件，作為經(jīng)使用任何適宜的操作系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)執(zhí)行大量軟件指令，能夠?qū)嵤┍景l(fā)明選擇的步驟。在任何情況下，如由數(shù)據(jù)處理器進(jìn)行的那樣，例如用于執(zhí)行大多數(shù)指令的計(jì)算平臺，能夠描述本發(fā)明的方法和生物反應(yīng)器選擇的步驟。繪圖的簡短描述在此僅借助實(shí)施例，并參照附圖來描述本發(fā)明。目前特別參照詳細(xì)的圖，強(qiáng)調(diào)所顯示的細(xì)節(jié)借助實(shí)施例來說明并僅用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案舉例說明的討論的目的，并在提供的情況下提出確信為最有用的且最易于理解本發(fā)明的原理和概念方面的描述的情況下提出。在這個方面，未作嘗試來更詳細(xì)顯示基本理解本發(fā)明必需的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，采用作圖描述，如何具體實(shí)踐本發(fā)明的幾種形式，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見。
圖中


圖1為舉例說明的活塞流動生物反應(yīng)器20的圖解描述，其當(dāng)減少本發(fā)明實(shí)踐時(shí)被使用；1-培養(yǎng)基庫；2-氣體混合物容器；3-氣體濾膜；4-注射點(diǎn)；5-活塞流動生物反應(yīng)器20的活塞或容器；6-流動監(jiān)視器；6a-流動閥門；7-條件培養(yǎng)基收集/分離容器；8-用于培養(yǎng)基交換的容器；9-蠕動泵；10-采樣點(diǎn)；11-用于培養(yǎng)基交換的容器；12-O2監(jiān)視器；14-轉(zhuǎn)向裝置；PH-PH探頭。
圖2證實(shí)CAFC經(jīng)14F1.1細(xì)胞維持。在有限稀釋下，將臍帶血CD34+細(xì)胞接種到照射14F1.1或原代人骨髓基質(zhì)上。5周后，測定圓石的形成。結(jié)果表示2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖3證實(shí)LTC-IC經(jīng)14F1.1細(xì)胞維持。在有限稀釋下，將臍帶血CD34+細(xì)胞接種到照射14F1.1或原始人骨髓基質(zhì)上。7周后，測定髓細(xì)胞樣的集落的形成。伴隨每周培養(yǎng)基替換，加入FLT-3配體(300ng/ml)、TPO(300ng/ml)和SCF(100ng/ml)。結(jié)果表示2個實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖4證實(shí)CD34+38-細(xì)胞在14F1.1和原始人骨髓基質(zhì)上的擴(kuò)增。在70 CD34+38-細(xì)胞/孔下，將CD34+細(xì)胞接種到14F1.1或原始人骨髓基質(zhì)上。每周加入細(xì)胞因子。7-21天后，胰蛋白酶消化培養(yǎng)基。經(jīng)FACS分析測定CD34+38-。結(jié)果表示2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖5a-b顯示用14F1.1基質(zhì)細(xì)胞系接種載體10天(圖5a)或40天(圖5b)后的掃描電子顯微攝影(SEM)。放大倍數(shù)×150。
圖6a-b證實(shí)3D對比2D的14F1.1條件培養(yǎng)基在CD34+38-擴(kuò)增上的作用。在來自14F1.1和原始人骨髓基質(zhì)的條件培養(yǎng)基的多種濃度存在下，于懸浮液培養(yǎng)基上接種CD34+細(xì)胞。經(jīng)FACS分析測定CD34+38-細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表示2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖7證實(shí)CD34+38-細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞包衣載體上的維持。將基質(zhì)細(xì)胞包衣的載體從3D系統(tǒng)移至硅酮包衣的96孔盤上，隨后加入1.5×104CD34+細(xì)胞。對照組只包含載體和與載體等量的單層(2D)生長的14F1.1細(xì)胞。在設(shè)定的時(shí)間下收獲細(xì)胞并經(jīng)FACS分析。結(jié)果表示2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
參照圖和所附的描述可更好理解本發(fā)明的原理和操作。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個優(yōu)選實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明不局限于它在以下描述中或在圖中闡明概述的對結(jié)構(gòu)和組件布置細(xì)節(jié)上的應(yīng)用。本發(fā)明能夠以多種方式實(shí)踐或進(jìn)行其它的實(shí)施方案。也應(yīng)理解在此使用的用語和術(shù)語用于描述目的而不應(yīng)看作是限制。
目前策略集中在可移植的人造血干細(xì)胞(HSC)的來自體內(nèi)的長期維持或擴(kuò)增，但到目前為止僅獲得有限的成功。在此描述接近模擬骨髓微環(huán)境且能夠支持骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長和延長維持的新的三維(3D)活塞流動生物反應(yīng)器系統(tǒng)。后者接種到以玻璃柱包裝的由聚酯的非編織纖維基質(zhì)組成的多孔載體上，因而在相對小的體積中繁殖大量的細(xì)胞數(shù)。在以下實(shí)施例部分提供的實(shí)施例部分中，用鼠14F1.1基質(zhì)細(xì)胞系或用原始人骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種生物反應(yīng)器。至接種后第40天，載體包含增加100倍的細(xì)胞密度。在多種水平下柱的密度是相同的，說明氧和營養(yǎng)物被均勻轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。在生物反應(yīng)器(3D SCM)內(nèi)，在支持長期維持人臍帶血(CB)的CD34+38-細(xì)胞中，經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基優(yōu)于基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層(2D)SCM。3D SCM也能夠支持CD34+38-CXCR4+細(xì)胞的擴(kuò)增，這表示SCID/NOD的種群恢復(fù)的細(xì)胞(SRC)。在細(xì)胞因子(FLT3配體和TPO)存在下，3D SCM增強(qiáng)干細(xì)胞自身更新且抑制分化，而2D SCM+細(xì)胞因子誘導(dǎo)相反的作用。三維基質(zhì)干細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)也呈現(xiàn)出比單細(xì)胞層基質(zhì)細(xì)胞上協(xié)同培養(yǎng)更優(yōu)良的CD34+38-細(xì)胞的維持。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)借助優(yōu)良的基質(zhì)干細(xì)胞接觸且或許借助基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生已知和/或新的干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑，3D活塞流動生物反應(yīng)器提供用于來自體內(nèi)的維持/擴(kuò)增人HSC的適宜的系統(tǒng)。
人HSC為移植和基因療法的基本目標(biāo)。HSC高的減少出現(xiàn)次數(shù)、以及目前的生長因子能夠在缺乏晚期分化下誘導(dǎo)干細(xì)胞自身更新的無效性，仍對實(shí)施這樣的策略以及對HSC“庫”的大規(guī)模設(shè)置構(gòu)成主要的障礙。
目前策略集中在長期維持/擴(kuò)增未分化的人HSC上，迄今為止僅獲得有限的成功。當(dāng)最近用細(xì)胞因子補(bǔ)充的懸浮液培養(yǎng)基的研究已顯示一些SRC表達(dá)時(shí)，通過大量增加初期的造血祖細(xì)胞(53，62)也實(shí)現(xiàn)該方法，表明干細(xì)胞分化發(fā)生的基本程度。例如，一個理想系統(tǒng)就是其中SRC擴(kuò)增，而LTC-IC在數(shù)量上保留減少的系統(tǒng)。
用于造血細(xì)胞擴(kuò)增的當(dāng)前系統(tǒng)使用單獨(dú)的(參見U.S.專利5,646,043號)或接種在基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層(參見U.S.專利5,605,822號)上的造血細(xì)胞的灌流懸浮液培養(yǎng)基。前者系統(tǒng)證實(shí)定型(committed)祖細(xì)胞大量的產(chǎn)生，后者經(jīng)歷單細(xì)胞層基質(zhì)-干細(xì)胞相互作用的非生理性質(zhì)。用于干細(xì)胞擴(kuò)增的另外的系統(tǒng)描述基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(參見U.S.專利4,536,151號和5,437,994號)的用途。然而，從基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層培養(yǎng)基得到后者，其在此清楚顯示與3D SCM相比較干細(xì)胞激活能力的低下和不同(參見實(shí)施例部分的表3)。盡管最近已描述(參見U.S.專利5,906,940號)靜止相生物反應(yīng)器使用基質(zhì)細(xì)胞包衣的玻璃珠，玻璃珠不提供生理的、3D結(jié)構(gòu)且與減少本發(fā)明實(shí)踐使用的載體相比較，使每ml10倍降低數(shù)量的基質(zhì)細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)。通過在此呈現(xiàn)的結(jié)果，3D衍生的SCM或3D基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物支持維持CD34+38-細(xì)胞的優(yōu)越能力(參見圖6和7)，清楚證實(shí)3D對單細(xì)胞層基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的有利條件。3D SCM的優(yōu)越作用可歸因于已知細(xì)胞因子或新的干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑的增加的水平。
旨在評價(jià)3D SCM和多種細(xì)胞因子(SCF，F(xiàn)LT3配體，TPO)在CD34+38-CXCR4+(或SRC)擴(kuò)增/維持(表3)上的聯(lián)合作用的實(shí)驗(yàn)清楚顯示在FLT3配體和TPO而沒有SCF存在下的3D SCM的有利作用。這些結(jié)果能夠歸因于3D SCM對干細(xì)胞分化的相對抑制作用。這些結(jié)果強(qiáng)烈指明在3D條件下，與新的基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的因子被產(chǎn)生，其或許它們本身沒有多少活性，可與這樣的細(xì)胞因子共同起作用。使用LTC-IC和定型祖細(xì)胞(GM-CFU)的產(chǎn)量讀出試驗(yàn)除CD34+產(chǎn)量以外，可測試干細(xì)胞的分化。
在此描述的生物反應(yīng)器是獨(dú)特的，即它將3D基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物與持續(xù)流動系統(tǒng)合并。最近已描述(U.S.專利5,541,107號)沒有持續(xù)培養(yǎng)基流動的3D基質(zhì)-造血細(xì)胞系統(tǒng)，在此描述的結(jié)果(參見例如圖7)清楚證實(shí)在缺乏持續(xù)流動的情況下，相對單細(xì)胞層的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的有利條件減少。
在此描述的3D活塞流動生物反應(yīng)器能夠支持基質(zhì)細(xì)胞系以及原始骨髓基質(zhì)細(xì)胞的長期生長?；|(zhì)細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的用途不僅對建立優(yōu)良的基質(zhì)-干細(xì)胞接觸(借助獨(dú)特的“生態(tài)位”和細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-ECM相互作用)是必需的，而且對已知的和新的可溶性和膜結(jié)合細(xì)胞因子產(chǎn)生基質(zhì)細(xì)胞也是必需的?；|(zhì)細(xì)胞通過使用基因工程化細(xì)胞因子產(chǎn)生的變體，能夠有利于用適宜的細(xì)胞因子補(bǔ)充這樣的生物反應(yīng)器。
生物反應(yīng)器基質(zhì)細(xì)胞也能夠設(shè)計(jì)用作逆病毒包裝的細(xì)胞系，使基因材料有效傳導(dǎo)至在生物反應(yīng)器本身內(nèi)的干細(xì)胞中。各種基質(zhì)細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的用途也能選擇最適宜的底物用于驅(qū)除Ph陽性干細(xì)胞，已知后者對基質(zhì)細(xì)胞粘附的能力較低(63)。原始基質(zhì)細(xì)胞具有有利條件，它們能建立“自體的”基質(zhì)-干細(xì)胞生物反應(yīng)器，在它上面自體的或甚至臍帶血干細(xì)胞能夠被擴(kuò)增且其在移植前不需要除去基質(zhì)細(xì)胞。
當(dāng)在生物反應(yīng)器中的最初的接種試驗(yàn)指明在載體中的相對低收率的CD34+38-細(xì)胞，接種后培養(yǎng)基流動速率以及最初接種至生物反應(yīng)器中的CD34+細(xì)胞數(shù)量可以容易地最優(yōu)化。在CD34+38-C×CR4+接種后的早期時(shí)間點(diǎn)(1-4天)分析對這樣的優(yōu)化是必要的。
與先有技術(shù)方法存在明顯差別，本發(fā)明的生物反應(yīng)器使用基本增加用于粘合基質(zhì)細(xì)胞的可以利用的附著表面的生長基質(zhì)，以便模擬骨髓的機(jī)械基本結(jié)構(gòu)。例如，對高度0.5mm的生長基質(zhì)，基于生長基質(zhì)計(jì)算，因子增加至少5至30倍。每單位層的因子這樣增加大約5至30倍，且如果使用經(jīng)墊片(spacer)等堆積或分離的大量這樣的層，每一個這樣的結(jié)構(gòu)應(yīng)用5至30倍的因子。當(dāng)基質(zhì)以片形式、優(yōu)選非編織纖維片或開孔泡沫聚合物片使用時(shí)，優(yōu)選片的厚度為大約50至1000μm或更高，提供用于細(xì)胞入口、營養(yǎng)物入口和用于除去來自片的廢物的足夠的孔隙率。按照優(yōu)選方案，孔具有10μm至100μm的有效直徑。從多種厚度的纖維能夠制備這樣的片，優(yōu)選纖維厚度或纖維直徑范圍在大約0.5μm至20μm之間，更優(yōu)選纖維直徑在10μm至15μm范圍內(nèi)。
可通過或甚至更好地結(jié)合于提供用于二維穩(wěn)定性和物理強(qiáng)度的多孔載片或篩子，可支持本發(fā)明的結(jié)構(gòu)。
也可將這樣的基質(zhì)片切割、沖壓或破碎以提供具有相同級的厚度(大約50-1000μm)的、大約0.2mm2至大約10mm2級的投射面積的顆粒。
在U.S.專利5,168,085號且尤其是5,266,476號中，描述用于減少本發(fā)明實(shí)踐的生長基質(zhì)的制備、用途和/或有利條件有關(guān)的其它細(xì)節(jié)，兩者通過引用結(jié)合到本文中。
如由技術(shù)人員易于意識到的那樣，本發(fā)明提供擴(kuò)增的未分化的造血干細(xì)胞群，它們能夠用于多種應(yīng)用，例如(但不局限于)(i)在受體基質(zhì)上擴(kuò)增人干細(xì)胞(自體或臍帶血來源的)，移植前不需要分離基質(zhì)干細(xì)胞；(ii)借助基質(zhì)-干細(xì)胞相互作用，在自體沉淀中排除Ph+CML干細(xì)胞；(iii)在生物反應(yīng)器中將基因轉(zhuǎn)移到自身更新干細(xì)胞中或隨后從生物反應(yīng)器中收獲；(iv)在懸浮培養(yǎng)基中或在干細(xì)胞生物反應(yīng)器中，產(chǎn)生3D基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SCM)，用于體內(nèi)維持/擴(kuò)增未分化的造血干細(xì)胞；(v)在缺乏分化下分離誘導(dǎo)干細(xì)胞自身更新的新的蛋白質(zhì)以及具有另外的生物功能的蛋白質(zhì)；(vi)分離3D基質(zhì)細(xì)胞RNA，用于克隆與新的基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑和其它的功能性基質(zhì)細(xì)胞基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的一個方面是提供擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法。通過實(shí)施以下方法步驟，進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明這個方面的方法。首先，獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。其次，將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中，在與參考文獻(xiàn)編號一致的
圖1中描述它們的一個實(shí)例，其中在以片形式存在的底物上預(yù)先建立基質(zhì)細(xì)胞系或原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此，如在以上另外描述的那樣和在以下實(shí)施例部分中舉例說明的那樣，擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
如在以下說明書和在權(quán)利要求部分中使用的那樣，術(shù)語“未分化的造血干細(xì)胞”指的是未定型的(uncommitted)造血細(xì)胞。
如在以下說明書和在權(quán)利要求部分中使用的那樣，術(shù)語“祖細(xì)胞”指的是定型的、然而未成熟的造血細(xì)胞。
未分化的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞兩者為CD34+細(xì)胞。因此，術(shù)語“獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞”和它的等價(jià)術(shù)語“未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞被獲得”兩者均指獲得分離的未分化的造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，或包含未分化的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的CD34+細(xì)胞群。
如在以下說明書和在權(quán)利要求部分中使用的那樣，術(shù)語“擴(kuò)增的”和“擴(kuò)增”指的是基本未分化的細(xì)胞生長，即伴隨這樣增加未分化的細(xì)胞群增加。
如在以下說明書和在權(quán)利要求部分中使用的那樣，術(shù)語“維持的”和“維持”指的是基本未分化的細(xì)胞更新，即伴隨這樣的靜止期的未見分化的基本靜止的細(xì)胞群。
如在此使用的術(shù)語“分化”指的是發(fā)育期間來自相對歸一化到特殊種類的變化。各種細(xì)胞系的細(xì)胞分化為已得到充分證明的過程，在此不需進(jìn)一步描述。
如在此使用的術(shù)語“來自體內(nèi)”指的是從生命有機(jī)體除去的細(xì)胞且在有機(jī)體外面繁殖(例如，在試管中)。
擴(kuò)增后，例如，通過各種親和力分離/標(biāo)記技術(shù)，例如(但不局限于)熒光活化細(xì)胞分選和借助親和底物的親和分離，能夠分離現(xiàn)在擴(kuò)增的未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。能夠用于實(shí)施這樣分離方法的親和分子包括例如其結(jié)合于CD34+細(xì)胞的抗-CD34抗體。
本發(fā)明另一方面提供擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的另一種方法。通過實(shí)施以下方法步驟，可進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明這個方面的方法。首先，獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。其次，在包含作為單一成分或作為添加劑的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已建立基質(zhì)細(xì)胞系或原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，因此，如在以上另外描述的那樣和在以下實(shí)施例部分中舉例說明的那樣，擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供制備用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的方法。通過實(shí)施以下方法步驟，進(jìn)行本發(fā)明這個方面的方法。首先，在以片的形式存在的底物上(底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì))在靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中建立基質(zhì)細(xì)胞系或原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。其次，當(dāng)已獲得所需的基質(zhì)細(xì)胞密度時(shí)，比如說，例如每立方厘米基質(zhì)大約5×106或107個細(xì)胞以上，如在以上另外描述的那樣和在以下實(shí)施例部分中舉例說明的那樣，從靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中收集培養(yǎng)基，獲得用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一方面提供將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植進(jìn)入到受體中的方法。通過實(shí)施以下方法步驟，進(jìn)行本發(fā)明這個方面的方法。首先，經(jīng)任何以上描述的方法擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。其次，將從第一步驟中生成的未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植到受體中。
如在
圖1中所示，本發(fā)明的另一方面提供包含容器5的生物反應(yīng)器活塞，一般以具有一個出口和一個入口的柱的形式存在，且其中含有以片的形式存在的底物，底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，底物支持每立方厘米底物至少基質(zhì)細(xì)胞系或原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的5×106個基質(zhì)細(xì)胞，優(yōu)選為至少個107個基質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供包含以上生物反應(yīng)器活塞的活塞流動生物反應(yīng)器。
在這方面，應(yīng)該意識到底物在理論上可支持最多每立方厘米5×107個細(xì)胞。一旦足夠的細(xì)胞聚集到底物上，能夠采用諸如照射的方法以停止另外的細(xì)胞生長，以便控制通過底物支持的準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)。
能夠從組織中純化或分離用作實(shí)施本發(fā)明方法的此類細(xì)胞來源的未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如(但不局限于)臍帶血、細(xì)胞因子移動的體循環(huán)血(例如經(jīng)白細(xì)胞提取法(leukapheresis)收集)和骨髓，已知所有它們均包含未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。這樣的分離方法為本領(lǐng)域熟知的，最經(jīng)常使用的是熒光活化細(xì)胞分選，其中首先用熒光團(tuán)親和標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞且然后收集。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。按照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一的個體。因此，在把它們移植到受體中的情況下，不需要分離細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個體。例如，未分化的造血于細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的未來受體用于提供基質(zhì)細(xì)胞，而未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞來自供給這樣的細(xì)胞至受體的根據(jù)HLA適容性選擇的供體。因此，移植前不再需要分離細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。然而，按照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)這樣接種后，生物反應(yīng)器中的流動切斷至少10小時(shí)時(shí)，進(jìn)行將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中的步驟，以致于使細(xì)胞能夠固定到基質(zhì)細(xì)胞覆蓋的基質(zhì)上。
以下描述提供用于實(shí)施本發(fā)明關(guān)于優(yōu)選底物的深入了解。
因此，按照一個實(shí)施方案，底物纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。按照另一個實(shí)施方案，制備底物的基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維組成，纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。按照另一個實(shí)施方案，基質(zhì)由具有2微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成。按照另外的實(shí)施方案，纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。按照另外的實(shí)施方案，制備底物的基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。按照另一個實(shí)施方案，基質(zhì)具有50-1000μm的高度，這是就使用它們的堆積而論的。按照另一個實(shí)施方案，制備底物的基質(zhì)材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。按照另一個實(shí)施方案，基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。按照另一個實(shí)施方案，基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
在以下實(shí)施例的檢驗(yàn)上，本發(fā)明另外的目的、優(yōu)點(diǎn)和新的特征對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，不打算對其限制。因此，發(fā)現(xiàn)如在以上概述的和如在以下權(quán)利要求部分中要求的本發(fā)明另外的各種實(shí)施方案和方面中的每一個得到以下實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)支持。
一般在此使用的術(shù)語和在本發(fā)明中使用的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在文獻(xiàn)中詳盡解釋這樣的技術(shù)。參見例如，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊”，Sambrook等，(1989)；“分子生物學(xué)中的通用流程”(Current Protocols in Molecular Biology)，第I-III卷，Ausubel，R.M.編輯(1994)；Ausubel等“分子生物學(xué)中的通用流程”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“分子克隆實(shí)用指南”John Wiley & Sons，紐約(1988)；Watson等，“重組DNA”，Scientific American Books，紐約；Birren等(編輯)“基因組分析實(shí)驗(yàn)室手冊系列”，第1-4卷，Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(1998)；在U.S.專利4,666,828號，4,683,202號，4,801,531號，5,192,659號和5,272,057號中闡述的方法學(xué)；“細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊”，第I-III卷，Cellis，J.E.編輯(1994)；“免疫學(xué)中的通用流程”，第I-III卷，Coligan J.E.編輯(1994)；Stites等(編輯)“基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(編輯)“細(xì)胞免疫學(xué)中的精選方法”，W.HFreeman公司，紐約(1980)；在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛描述可獲得的免疫試驗(yàn)，參見例如，U.S.專利3,791,932號、3,839,153號、3,850,752號、3,850,578號、3,853,987號、3,867,517號、3,879,262、3,901,654號、3,935,074號、3,984,533號、3,996,345號、4,034,074號、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“寡核苷酸合成”，Gait，M.J.編輯(1984)；“核酸雜化作用”，Hames，B.D.和Higgins S.J.編輯(1985)；“轉(zhuǎn)錄和翻譯”，Hames，B.D.和Higgins S.J.編輯(1984)；“動物細(xì)胞培養(yǎng)”，F(xiàn)reshney，R.I.編輯(1986)；“固定化細(xì)胞和酶”(ImmobilizedCells and Enzymes)，IRL出版社，(1986)；“分子克隆實(shí)用指南”，Perbal，B.，(1984)和“酶學(xué)中的方法”，第1-317卷，Academic出版社；“PCR流程方法和應(yīng)用指南”，Academic出版社，圣迭戈，CA(1990)；等，“蛋白質(zhì)純化和鑒定策略-實(shí)驗(yàn)室方法手冊”，CSHL出版社(1996)；所有文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中，好象在此充分概述的那樣。其它的一般參考文獻(xiàn)也隨該文件一起提供。相信其中的方法是本領(lǐng)域熟知的并為便利讀者而提供。包含在那里的所有信息通過引用結(jié)合到本文中。材料和實(shí)驗(yàn)方法生物反應(yīng)器根據(jù)本發(fā)明技術(shù)使用的生物反應(yīng)器在結(jié)構(gòu)上與在
圖1中描述的設(shè)計(jì)一致。設(shè)計(jì)玻璃器皿并在Technino(以色列)制備，經(jīng)硅膠管(silicone tubing)(Degania，以色列)連接。在不含有Ca+2和Mg+2的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；Beit Ha’Emek工業(yè)，以色列)中，將載體旋轉(zhuǎn)過夜，隨后除去PBS和釋放的碎片。每柱用10ml填充載體填充。用PBS-Ca-Mg填充生物反應(yīng)器，密封所有出口且將系統(tǒng)高壓滅菌(120℃，30分鐘)。借助容器[8]除去PBS并在包含有300ml的含有10％熱滅活的小牛血清(FCS；Beit Ha’Emek工業(yè)，以色列)和Pen-Strep-Nystatin混合物(100U/ml100μg/ml1.25μn/ml；Beit Ha’Emek)的Dulbecco氏高葡萄糖培養(yǎng)基(DMEM；GIBCO BRL)的37℃的孵育器中，將生物反應(yīng)器循環(huán)48小時(shí)。用含有以上物質(zhì)+2ML-谷氨酰胺(BeitHa’Emek)的新鮮DMEM替代循環(huán)培養(yǎng)基。
基質(zhì)細(xì)胞于充分潤濕的空氣5％CO2的孵育器中，在37℃下，在用10％FSC補(bǔ)充的DMEM中維持基質(zhì)細(xì)胞系。在組織培養(yǎng)燒瓶(Corning)中，細(xì)胞生長并在達(dá)到匯合后經(jīng)胰蛋白酶作用裂解。從經(jīng)受開放心臟手術(shù)的血液學(xué)健康供體抽取的胸骨骨髓建立原代人骨髓基質(zhì)細(xì)胞。簡言之，在Hank氏平衡鹽溶液(HBSS；GIBCO BRL)中，將骨髓抽吸液稀釋3倍且經(jīng)歷菲可帕克(Robbins Scientific公司，Sunnyvale，CA)密度梯度離心。收集骨髓單核細(xì)胞(＜1.077gm/cm3)，以HBSS洗滌3次且重懸浮于長期培養(yǎng)基(LTC)中，培養(yǎng)基由用12.5％FCS、12.5％馬血清(Beit Ha’Emek)、10-4M β-巰基乙醇(Merck)和10-6mol/L琥珀酸氫化可的松鈉(Sigma)補(bǔ)充的DMEM組成。在37℃(5％CO2)下，將細(xì)胞在25ml組織培養(yǎng)燒瓶(Corning)中孵育3天且然后在33℃(同上)下孵育，每周重新加入培養(yǎng)基。來自各自供體的基質(zhì)細(xì)胞用于每一個生物反應(yīng)器。為3D和單細(xì)胞層研究，每10天經(jīng)胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶和EDTA在Puck氏鹽水A中；Beit Ha’Emek)分裂原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，以使足夠的基質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增。對LTC-IC和CAFC(參見如下)，使用137Cs源照射(1500cGy)基質(zhì)細(xì)胞，在33℃下于LTC培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)物。
基質(zhì)細(xì)胞的接種基質(zhì)細(xì)胞系或5周原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物經(jīng)胰蛋白酶消化且以HBSS將細(xì)胞洗滌3次，重懸浮于生物反應(yīng)器培養(yǎng)基(參見以上)中，計(jì)數(shù)并在10ml體積中借助注射點(diǎn)以106細(xì)胞/ml接種([4]，
圖1)到在生物反應(yīng)器的玻璃柱中的10ml載體上。接種后立即停止循環(huán)16小時(shí)以使細(xì)胞固定于載體上。通過除去載體且經(jīng)MTT方法對細(xì)胞計(jì)數(shù)(56)，監(jiān)測基質(zhì)細(xì)胞生長。當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞匯合時(shí)，用LTC培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基，用于繼續(xù)研究(制備SCM，干細(xì)胞接種)。
基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SCM)的制備在等價(jià)細(xì)胞密度下，用新鮮LTC培養(yǎng)基重新載荷單細(xì)胞層和生物反應(yīng)器的基質(zhì)細(xì)胞。孵育細(xì)胞過夜后，收集SCM。為此目的，將3D培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基流動停止16小時(shí)并在重新開始循環(huán)前直接從柱上移去。為分析CD34+細(xì)胞對SRC的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的作用，在把CD34+細(xì)胞接種到3D系統(tǒng)中后在各個間隔(2-7天)停止循環(huán)且如上描述的那樣從柱收集培養(yǎng)基。將SCM離心(1000xg，10分鐘)，過濾且貯存在-20℃下。在生物反應(yīng)器中，基質(zhì)細(xì)胞也可在不含有血漿的培養(yǎng)基中生長，為收集SCM，排除不確定的變化。
CD34+細(xì)胞的分離在菲可帕克上，將在傳遞期間于滅菌條件下采集的臍帶血樣分級培養(yǎng)(fractionated)并收集上浮的(buoyant)(＜1.077gr/cm3)單核細(xì)胞。將來自各CB樣品的細(xì)胞混合，用抗CD34抗體孵育并經(jīng)midi MACS(Miltenyl Biotech)分離。
CD34+細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)基在0.5ml減去或加上單獨(dú)或聯(lián)合的300ng/ml每一個FLT3配體、SCF或TPO的0-100％SCM中，于24孔盤(TPP，瑞典)上孵育CB CD34+細(xì)胞(5×105/孔)。對照組包含加上或減去細(xì)胞因子的LTC培養(yǎng)基。在37℃下，于5％CO2的空氣中，孵育細(xì)胞。每周交換培養(yǎng)基。接種前及在各個時(shí)間(1-3周)，收獲細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)計(jì)數(shù)用于CD34+/38-/CXCR4+試驗(yàn)。輸出量試驗(yàn)也可包括SRC、CAFC和LTC-IC。
基質(zhì)-干細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)在含有等密度的匯合基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞層或生物反應(yīng)器上，在同等數(shù)目(大約5×105)下接種分離的、混合的CB CD34+細(xì)胞。當(dāng)加入到生物反應(yīng)器上時(shí)，停止培養(yǎng)基流動16小時(shí)以使與基質(zhì)細(xì)胞接觸且在每分鐘0.1-1.0ml的速度下重新開始。在缺乏培養(yǎng)基交換下，除去CD34+細(xì)胞接種的基質(zhì)細(xì)胞載體以進(jìn)行對照研究。在含有或不含有細(xì)胞因子的LTC培養(yǎng)基中，維持協(xié)同培養(yǎng)。在多個時(shí)間(最多可達(dá)4周)，從單細(xì)胞層上清液或從循環(huán)培養(yǎng)基中，借助容器([8]，
圖1)收集非粘附細(xì)胞。借助順序胰蛋白酶作用并接觸基于EDTA的解離緩沖液(GIBCO BRL)，隨后溫和吸取細(xì)胞，收集粘附細(xì)胞。為避免在生成的懸浮液中存在基質(zhì)細(xì)胞，將細(xì)胞重懸浮于HBSS+10％FCS中并在37℃下于塑料組織培養(yǎng)皿(Corning)上經(jīng)歷60分鐘的粘附過程。將循環(huán)的且分離載體的造血細(xì)胞洗滌，經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)計(jì)數(shù)并分開用于CD34+/38-/CXCR4+試驗(yàn)。輸出量試驗(yàn)也可包括SRC、CAFC和LTC-IC。
流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)在4℃下，用飽和濃度的單克隆抗-CD34+PerCP(Beckton-Dickinson)、抗-CXCR4-熒光異氰酸酯(FITC，R&D系統(tǒng))和-藻紅蛋白(PE，Beckton-Dickinson)抗體孵育細(xì)胞30分鐘。在含有5％熱滅活的FCS的冰冷卻的PBS中，洗滌細(xì)胞2次并重懸浮以用于在FACS掃描(Beckton-Dickinson)上的三色流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測定。
LTC-IC和CAFC試驗(yàn)如先前描述的那樣(16，17)，新鮮分離的CD34+細(xì)胞，即從基質(zhì)-干細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)或從懸浮培養(yǎng)基分離的細(xì)胞，用于LTC-IC和CAFC測定。將匯合的原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，照射(1500cGy)且以0.1ml鋪在96孔板(Corning)上(1.5×104/孔)。建立24平行測定孔/組。用0.1ml含有連續(xù)稀釋的CD34+細(xì)胞(500-5細(xì)胞/孔)的LTC培養(yǎng)基或用從各試驗(yàn)中收獲的系列稀釋的細(xì)胞，覆蓋基質(zhì)細(xì)胞。在33℃下，直接將培養(yǎng)基孵育5周，伴隨每周交換半數(shù)的培養(yǎng)基。如先前描述的那樣(57)，在1000rpm下，將這些板離心10分鐘，移去培養(yǎng)基上清液，用甲基纖維素培養(yǎng)基和用于骨髓祖細(xì)胞試驗(yàn)的細(xì)胞因子覆蓋剩余的細(xì)胞。14天后對計(jì)數(shù)細(xì)胞且按照給出37％陰性培養(yǎng)物(16)的受試細(xì)胞濃度的倒數(shù)測定LTC-IC出現(xiàn)的次數(shù)。除缺乏甲基纖維素和細(xì)胞因子以外，基本上如以上描述的那樣進(jìn)行CAFC試驗(yàn)。在接種系列稀釋的受試細(xì)胞懸浮液后6周，測定具有在基質(zhì)層下的至少5個細(xì)胞(圓石區(qū))中的至少一個暗相(phase-dark)造血克隆的孔百分比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果減少本發(fā)明實(shí)踐所使用的生物反應(yīng)器系統(tǒng)在
圖1中描述。它包含四個平行的活塞流動生物反應(yīng)器單位[5]。每個生物反應(yīng)器單位包含1克由聚酯的非編織纖維基質(zhì)制成的多孔載體(直徑4mm)(58)。這些載體使得在相對小的體積中繁殖大量的細(xì)胞數(shù)目。載體的結(jié)構(gòu)和填充物對氧和營養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移以及在局部濃度和釋放的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)物(例如，ECM蛋白質(zhì)，細(xì)胞因子，59)有很大的影響。生物反應(yīng)器在37℃的孵育器中維持。
監(jiān)測每個生物反應(yīng)器中的流動[6]且通過閥門調(diào)節(jié)[6a]。每個生物反應(yīng)器包含一個進(jìn)樣和注射點(diǎn)[4]，使順序接種基質(zhì)和造血細(xì)胞。在pH7.0下，從貯庫[1]中[13]供應(yīng)培養(yǎng)基。在不同的比例下依生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度而定，以維持5-40％溶解氧在從柱的出口，經(jīng)含有空氣/CO2/O2[2]的過濾[3]氣體混合物供應(yīng)貯庫。如由監(jiān)控器測定的那樣[12]，O2的比例適宜于溶解氧在生物反應(yīng)器出口的水平。借助硅酮試管，將氣體混合物供應(yīng)于貯庫。使培養(yǎng)基通過分開的容器[7]，該容器能收集循環(huán)的、未粘附的細(xì)胞。在0.1-3ml/分鐘的速率下，借助蠕動泵[9]獲得培養(yǎng)基循環(huán)。生物反應(yīng)器單位配備另外的進(jìn)樣點(diǎn)[10]和兩個用于以10-50ml/天的速率連續(xù)交換培養(yǎng)基的容器[8，11]。使用四個平行的生物反應(yīng)器單位以便于定期拆除，例如細(xì)胞除去、掃描電子顯微鏡、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、RNA提取等。
在一個實(shí)驗(yàn)中，建立包含其先前顯示支持定型的人髓樣祖細(xì)胞(24)生長的鼠14F1.1基質(zhì)細(xì)胞系(24、60、61)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該細(xì)胞系也同樣能夠支持人CB CAFC(圖2)、LTC-IC(圖3)和CD34+38-細(xì)胞(圖4)以及原代人骨髓基質(zhì)細(xì)胞。在這些圖中呈現(xiàn)的結(jié)果也顯示，將FLT3配體+TPO加入到這些培養(yǎng)基中對LTC-IC無作用，而這些細(xì)胞因子顯著增強(qiáng)CAFC和CD34+38-細(xì)胞產(chǎn)量。反之，SCF誘導(dǎo)LTC-IC和CAFC兩者下降。當(dāng)以1.5×106個細(xì)胞/10ml培養(yǎng)物體積接種到生物反應(yīng)器中時(shí)，14F1.1細(xì)胞生長且鋪展在載體(圖5)上。接種后第40天，載體包含100倍增加的細(xì)胞密度，即大約1.5×106個細(xì)胞/載體，1.5×107個細(xì)胞/ml(表1)。表114F1.1和原代人骨髓基質(zhì)在載體上生長的動力學(xué)
MTT分析包括5個載體/測定。2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值在柱的各種水平載體上的細(xì)胞密度是相同的，指明氧和營養(yǎng)物均勻轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上。對這些細(xì)胞優(yōu)化培養(yǎng)條件培養(yǎng)基(Dulbecco氏高葡萄糖培養(yǎng)基+10％小牛血清)、流動速率(1ml/min)、培養(yǎng)基交換次數(shù)(每周一次)、最初接種密度(如上)。未發(fā)現(xiàn)膠原或聚L-賴氨酸載體包衣對14F1.1細(xì)胞的生長速率和最終密度上的有益作用。用原代人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(表1)初步結(jié)果表明14F1.1細(xì)胞和原代基質(zhì)細(xì)胞在分別接種后在第10天和第14天具有相似的密度。
為測定基質(zhì)細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的功能活性，測定從生物反應(yīng)器柱(3D SCM)中獲得的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SCM)對用人CB CD34+細(xì)胞接種的懸浮培養(yǎng)液中的CD34+38-細(xì)胞擴(kuò)增的作用。該活性可與從包含相同濃度的基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞層培養(yǎng)物(2D SCM)獲得的SCM相比較。如在圖6中顯示的那樣，發(fā)現(xiàn)來自14F1.1細(xì)胞的SCM比來自原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞的SCM相等地或更能夠支持人CB CD34+38-細(xì)胞的維持。在較低的濃度下，始終觀察到14F1.1細(xì)胞SCM比原代骨髓SCM強(qiáng)的最大作用。此外，在支持人CBCD34+38-細(xì)胞的擴(kuò)增中，發(fā)現(xiàn)3D SCM優(yōu)于兩種細(xì)胞類型的2D SCM。在培養(yǎng)期間(14天對21天)，2D和3D SCM之間的活性差異更加明顯。如與只含有培養(yǎng)基的對照培養(yǎng)液相比較，將14F1.1 3D SCM加入到人CB CD34+細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)液中也導(dǎo)致CD34+38-CXCR4+細(xì)胞的維持(表2)。表23D 4F1.1 SCM對CD34+38-/CD34+38-CXCR4+的產(chǎn)量的作用
將人CB CD34+細(xì)胞(8×104/點(diǎn))接種在含有LTC培養(yǎng)基或50％3D 14F1.1 SCM的懸浮培養(yǎng)液中。7天后收獲培養(yǎng)物且經(jīng)FACS分析細(xì)胞。CD34+38-和CD34+38-CXCR4+的產(chǎn)量分別為2800和112。
表3證實(shí)包含在2D與包含在3D SCM中的CD34+的懸浮培養(yǎng)液細(xì)胞因子的作用的比較。結(jié)果清楚證實(shí)在支持維持CD34+38-且更重要的是在維持CD34+38-CXCR4+(SRC)亞群兩者中3D SCM優(yōu)于2DSCM。表3細(xì)胞因子對擴(kuò)增3 D14F1.1 SCM中的CD34+38-/CD34+38-CXCR4+細(xì)胞的作用
人CB CD34+細(xì)胞(2.6×105/點(diǎn))50％2D對3D 14F1.1 SCM，在FLT3配體(300ng/ml)TPO(300ng/ml)或SCF(50ng/ml)缺乏或存在下的比較。7天后收獲培養(yǎng)物且經(jīng)FACS分析細(xì)胞。CD34+38-和CD34+38-CXCR4+的產(chǎn)量分別為7900和360。
這可涉及到2D SCM對細(xì)胞分化的更強(qiáng)作用，如由CD34+細(xì)胞的產(chǎn)率檢測的那樣。在2D SCM存在下TPO+FLT3配體減少CD34+38-/CD34+38-CXCR4+的產(chǎn)率，但增強(qiáng)它們在用3D SCM補(bǔ)充的培養(yǎng)物中的產(chǎn)率。如經(jīng)CD34+表面標(biāo)記測定的那樣，這再次歸因于3D系統(tǒng)中更小程度的分化。在2D和3D SCM兩種培養(yǎng)基中，SCF誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的明顯增加和在CD34+38-/CD34+38-CXCR4+細(xì)胞的產(chǎn)率上明顯的減少。
為測定在我們的生物反應(yīng)器中基質(zhì)-干細(xì)胞的相互作用，首先評價(jià)CD34+38-細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞(14F1.1)包衣的載體上的維持/擴(kuò)增。從生物反應(yīng)器中移出后者并進(jìn)入到硅酮包衣的96孔盤上，隨后加入CD34+細(xì)胞。對照品僅含有載體和載體-相等數(shù)量的單層14F1.1細(xì)胞。如在圖7中顯示的那樣，通過只存在載體的情況下，增強(qiáng)CD34+38-細(xì)胞的生存，證實(shí)3D結(jié)構(gòu)對原生祖細(xì)胞的生存和維持的有益作用(36)。在促進(jìn)7-天的CD34+38-細(xì)胞的生存/維持中，基質(zhì)-細(xì)胞包衣的載體優(yōu)于單獨(dú)的載體或優(yōu)于單細(xì)胞層的14F1.1細(xì)胞。在14F1.1單細(xì)胞層和14F1.1包衣的載體培養(yǎng)基中，延長的培養(yǎng)基(第14天)導(dǎo)致CD34+38-的數(shù)目增加。
在隨后的實(shí)驗(yàn)中，將6×106混合的CB CD34+(3×105CD34+38-)細(xì)胞接種到含有未照射的4柱、14F1.1包衣的載體在350ml循環(huán)培養(yǎng)基中的生物反應(yīng)器中。流動停止培養(yǎng)基16小時(shí)，之后在正常速率(1ml/min)下繼續(xù)進(jìn)行。協(xié)同培養(yǎng)4天后，經(jīng)對收獲的活細(xì)胞的FACS分析測定，循環(huán)培養(yǎng)基含有10％初步接種的CD34+38-細(xì)胞。培養(yǎng)18天后，循環(huán)培養(yǎng)基包含0.4％CD34+38-細(xì)胞，而載體粘附的細(xì)胞包含3％最初接種的CD34+38-群體。
盡管結(jié)合它們的具體實(shí)施方案已描述本發(fā)明，事實(shí)上許多選擇、修飾和變化、對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，打算包括所有這樣的選擇、修飾和變化，其均在所附的權(quán)利要求書的精神和廣義范圍內(nèi)。在此引用的所有出版物通過引用全文結(jié)合到本文中。在本申請書中任何參考文獻(xiàn)的引用或認(rèn)證別將不構(gòu)成為一種認(rèn)可，即不應(yīng)認(rèn)為這樣的參考文獻(xiàn)如同本發(fā)明的先有技術(shù)一樣是可以利用的。
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權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)將所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中，其中三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物已被預(yù)先建立在以片的形式存在的底物上，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動的體循環(huán)血液和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個細(xì)胞的密度。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個細(xì)胞的密度。
10.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)所述接種后所述生物反應(yīng)器中的流動切斷至少10小時(shí)時(shí)，進(jìn)行所述將所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到所述靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中的步驟。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
15.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
16.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
17.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
18.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
19.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
20.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括分離所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的步驟。
21.一種擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)在包含基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，所述基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動的體循環(huán)血液和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個體。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個體。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個細(xì)胞的密度。
29.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個細(xì)胞的密度。
30.權(quán)利要求21的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
31.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
32.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
33.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
34.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
35.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
36.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
37.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
38.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
39.一種制備用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的方法，該方法包括以下步驟(a)在以片的形式存在的底物上于靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中建立基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)當(dāng)已獲得所需的基質(zhì)細(xì)胞密度時(shí)，從所述靜止相活塞流動生物反應(yīng)器上收集培養(yǎng)基，由此獲得用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個細(xì)胞的密度。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個細(xì)胞的密度。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
44.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
45.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
46.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
47.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
48.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
49.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
50.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
51.一種將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植至受體的方法，該方法包括以下步驟(a)通過以下步驟擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞(i)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(ii)將所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中，其中在以片的形式存在的底物上，已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)將從步驟(a)生成的所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植到受體中。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動的體循環(huán)血液和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個體。
55.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個體。
56.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
57.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
58.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個細(xì)胞的密度。
59.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個細(xì)胞的密度。
60.權(quán)利要求51的方法，其中當(dāng)所述接種后所述生物反應(yīng)器中的流動切斷至少10小時(shí)時(shí)，進(jìn)行所述將所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到所述靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中的步驟。
61.權(quán)利要求51的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
62.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
63.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
64.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
65.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
66.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
67.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
68.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
69.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
70.權(quán)利要求51的方法，該方法還包括在步驟(b)前分離所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的步驟。
71.一種把未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植到受體的方法，該方法包括以下步驟(a)通過以下步驟擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞(i)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(ii)在包含基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，所述基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動的體循環(huán)血液和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
73.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
74.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個體。
75.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個體。
76.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
77.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
78.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個細(xì)胞的密度。
79.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個細(xì)胞的密度。
80.權(quán)利要求71的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
81.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
82.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
83.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
84.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
85.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
86.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
87.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
88.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
89.一種生物反應(yīng)器活塞，其包括具有一個出口和一個入口的容器且其中包含以片的形式存在的底物，所述底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，所述底物支持至少每立方厘米所述底物5×106個基質(zhì)細(xì)胞。
90.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
91.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維組成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
92.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1
93.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
94.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
95.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
96.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
97.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
98.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
99.一種活塞流動生物反應(yīng)器，其包含權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器活塞。
全文摘要
通過獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞;和把未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動生物反應(yīng)器中,或者在從這樣的反應(yīng)器得到的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞,擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法,其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物,底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì),由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
文檔編號C12N5/08GK1346403SQ00806007
公開日2002年4月24日 申請日期2000年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月4日
發(fā)明者S·梅查夫, S·梅雷特斯基 申請人:技術(shù)研究及發(fā)展基金有限公司