專利名稱：人子宮頸癌抑制蛋白,編碼該蛋白的多核苷酸,用該多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和用表達(dá)載體抑 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人子宮頸癌抑制蛋白，編碼所述蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸的表達(dá)載體，用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，使用所述表達(dá)載體抑制癌細(xì)胞增殖的方法和包含所述多核苷酸的預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物。
已報(bào)道了超過20個(gè)腫瘤抑制基因和由它們突變引起的癌癥傾向綜合征(Haber DA等.，Lancet，351，1-8(1998))。其中，已發(fā)現(xiàn)p53腫瘤抑制基因編碼序列的變更是大多數(shù)人類癌癥的遺傳起源(Weinberg RA，見上；Klein G.，見上；和Bishop JM，細(xì)胞，64，235-248(1991))。然而，僅一小部分，即2-11％的子宮頸癌組織顯示出p53突變(Crook T等.，Lancet，339，1070-1073(1992)；并且Busby-Earle RMC等(Br.J.癌癥，69，732-737(1994))已推測(cè)對(duì)于子宮頸癌，存在其它的腫瘤抑制基因。因此，存在鑒定抑制子宮頸癌的基因的需要。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用這種表達(dá)載體抑制癌細(xì)胞增殖的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包含這種多核苷酸的、預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離自人的腫瘤抑制蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO2。


圖10A和10B是用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色的HCCS-1轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞和親本野生型細(xì)胞的各自的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(flow cytometric)的分析結(jié)果；和
圖11A和11B是不用阿霉素或UVC處理的轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞和親本野生型細(xì)胞各自的細(xì)胞周期分布圖；
圖11C和11D，0.1μg/ml阿霉素處理后的細(xì)胞周期分布圖；
圖11E和11F，2μg/ml阿霉素處理后的細(xì)胞周期分布圖；和
圖11G和11H，UVC處理后的細(xì)胞周期分布圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明的腫瘤抑制蛋白，即人子宮頸癌抑制蛋白1(下文為“HCCS-1蛋白”)，具有氨基酸序列SEQ ID NO2，和約9kDa的分子量。然而，可進(jìn)行該蛋白氨基酸殘基的各種取代，加成和/或缺失，而對(duì)蛋白的功能無(wú)不利的影響。而且，當(dāng)實(shí)現(xiàn)特殊的用途時(shí)，可使用該蛋白的一部分。此處使用的術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的腫瘤抑制蛋白”包括這些修飾的氨基酸和它們的片段。因此，在它的范圍方面，本發(fā)明包括具有與具有SEQ ID NO2氨基酸序列的HCCS-1蛋白基本相同氨基酸序列的多肽和它的片段。作為在此處使用，“基本相同的多肽”表示一種多肽，其氨基酸序列顯示與氨基酸序列SEQ ID NO2優(yōu)選80％或更多，更優(yōu)選90％或更多，最優(yōu)選95％或更多的同源性。
本發(fā)明的HCCS-1蛋白可由包含按照遺傳密碼，從HCCS-1蛋白的氨基酸序列推導(dǎo)出的核苷酸序列的多核苷酸編碼(下文為“HCCS-1基因”)。已知由于密碼簡(jiǎn)并性，可存在幾個(gè)不同的密碼子編碼同一個(gè)氨基酸，因此，本發(fā)明的HCCS-1基因可包括從HCCS-1蛋白的氨基酸序列推導(dǎo)出的各種核苷酸序列。優(yōu)選的HCCS-1基因具有核苷酸序列SEQ ID NO1，其長(zhǎng)555-bp，并包含79個(gè)氨基酸殘基的開放閱讀框架。核苷酸序列SEQ ID NO1于2000年3月24日于GenBank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為AF249277。
本發(fā)明的HCCS-1基因或蛋白可獲自人組織或使用常規(guī)的DNA或肽合成法合成。而且，可將如此制得的基因插入到常規(guī)載體中，以獲得表達(dá)載體，其又可被引入合適的宿主例如微生物如大腸桿菌或酵母，或動(dòng)物細(xì)胞如鼠或人細(xì)胞中。
然后轉(zhuǎn)化的宿主可用于大規(guī)模生產(chǎn)本發(fā)明的DNA或蛋白。例如，用含本發(fā)明HCCS-1基因的表達(dá)載體pCEV-LAC(表示為HCCS-1/pCEV-LAC)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Miki，T.等.，基因，83，137-146(1989))，以獲得表示為JM109/HCCS1的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，按照國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約，其于2000年4月10日保藏于韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，大田305-333，韓國(guó))，保藏號(hào)為KCTC 0768BP。
在制備載體過程中，依據(jù)使用的宿主細(xì)胞，適當(dāng)?shù)剡x擇表達(dá)控制序列，例如啟動(dòng)子，終止子，自復(fù)制序列和分泌信號(hào)。
本發(fā)明的HCCS-1基因在正常人組織如正常子宮頸，胎盤，腎，肝，骨骼肌，心臟組織中表達(dá)，但在癌組織如初期子宮頸癌和轉(zhuǎn)移的骼總淋巴結(jié)組織，和癌細(xì)胞系如早幼粒細(xì)胞性白血病(promyelocytic leukemia)HL-60細(xì)胞，HeLa子宮頸癌細(xì)胞，慢性骨髓性白血病K-562細(xì)胞，淋巴性白血病MOLT-4細(xì)胞，伯基特淋巴瘤Raji細(xì)胞，SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，A549肺癌細(xì)胞和G361黑素瘤細(xì)胞中不表達(dá)。在正常組織中，大多數(shù)它的轉(zhuǎn)錄物具有0.6kb的長(zhǎng)度，盡管已觀察到1.6kb或1.0kb的轉(zhuǎn)錄物。
如此表達(dá)的本發(fā)明的HCCS-1蛋白具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序化細(xì)胞死亡的活性。具體地，本發(fā)明的HCCS-1蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞色素c從線粒體至細(xì)胞質(zhì)的釋放，以獲得DNA斷裂。此外，本發(fā)明的HCCS-1基因引起質(zhì)膜脂質(zhì)改變，如內(nèi)小葉的磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移入胞外側(cè)，從而不可逆地導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而且，本發(fā)明的HCCS-1基因誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)由化療劑如阿霉素或放射線如UVC引發(fā)的程序化細(xì)胞死亡(apoptic)途徑更加敏感。本發(fā)明的HCCS-1基因誘導(dǎo)腫瘤誘發(fā)蛋白如p53腫瘤抑制蛋白突變型，Bc1-2或c-Myc的負(fù)調(diào)節(jié)。
本發(fā)明HCCS-1蛋白的這種誘導(dǎo)程序化細(xì)胞死亡的活性可在抑制癌細(xì)胞增殖的過程中有利地使用。因此，本發(fā)明提供了一種抑制癌細(xì)胞增殖的方法，其包含將包含本發(fā)明HCCS-1基因的表達(dá)載體引入癌細(xì)胞以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的程序化細(xì)胞死亡。本發(fā)明的方法可用于任何類型的癌細(xì)胞。優(yōu)選子宮頸，胎盤，腎，肝，骨骼肌和心臟癌細(xì)胞，更優(yōu)選子宮頸癌細(xì)胞。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的本發(fā)明的腫瘤抑制基因和藥用載體，如果需要，也可包括賦形劑或其它添加劑。優(yōu)選按適于通過注射給藥的形式配制本發(fā)明的藥物組合物。
以常規(guī)方式將本發(fā)明的藥物組合物給藥到受試者的癌組織內(nèi)，以誘導(dǎo)該組織的程序化細(xì)胞死亡。例如，按照Kim，J.S.等公開的方法(J.ControlledRelease，53，175-182(1998))，使用疏水的聚-L-賴氨酸衍生物包被本發(fā)明的腫瘤抑制基因，并將得到的被包被基因注入受試者的癌組織。
可按照各種相關(guān)的因素，包括處理的條件，選擇的給藥途徑，患者個(gè)體的年齡和體重，患者癥狀的嚴(yán)重程度確定實(shí)際給藥的腫瘤抑制基因的量。
下列實(shí)施例是意圖進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是限制它的范圍。實(shí)施例1mRNA的差異顯示(步驟1)總RNA的分離正常外子宮頸組織樣本在子宮切除期間獲自子宮肌瘤患者，未處理的初期子宮頸癌和轉(zhuǎn)移的骼總淋巴結(jié)組織樣本在徹底的(radical)子宮切除期間獲得。在Waymouth MB 751/1培養(yǎng)基上培養(yǎng)人子宮頸癌細(xì)胞系CUMC-6(Kim JW等.，Gynecol Oncol，62，230-240(1996))。
使用市售系統(tǒng)(RNeasy總RNA試劑盒，Qiagen Inc.，德國(guó))從組織樣本和細(xì)胞中提取總RNA，使用信息清除試劑盒(Message clean kit)(GenHunter Corp.，Brookline，MA)去除DNA污染物。(步驟2)差異顯示按照Liang等的方法(科學(xué)，257，967-971(1992)；和癌癥研究(CancerRes).，52，6966-6968(1992))，如下少許改動(dòng)進(jìn)行差異顯示。
用引物H-T11A(SEQ ID NO3)作為錨定寡-dT引物(RNAimage試劑盒，GenHunter)，將0.2μg在步驟1中獲得的每種總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，接著使用相同的錨定引物和任意5′13mer(RNAimage引物對(duì)1，H-AP 1-40)，在0.5mM[α-35S]-標(biāo)記的dATP(1200Ci/mmol)存在下，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。重復(fù)40次PCR熱循環(huán)，每個(gè)循環(huán)組成如下95℃40秒，40℃2分鐘，和72℃40秒，最后將反應(yīng)在72℃下進(jìn)行5分鐘。將如此獲得的PCR產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺測(cè)序凝膠上進(jìn)行電泳，接著放射自顯影。
圖1表示使用錨定寡-dT引物和任意5′13mer H-AP 37(SEQ ID NO4)，正常外子宮頸組織，子宮頸癌組織，轉(zhuǎn)移的組織和子宮頸癌細(xì)胞系CUMC-6的差異顯示結(jié)果，其中箭頭指出僅在正常外子宮頸組織中表達(dá)的193bp片段，表示為CG373。這個(gè)結(jié)果推測(cè)片段CG373是腫瘤抑制基因候選基因。
從干燥的序列凝膠上將片段CG373條帶切除，并在水中煮沸15分鐘以洗脫片段CG373。除了省去[α-35S]-標(biāo)記的dATP和20μM dNTPs，使用相同的條件將片段CG373進(jìn)行PCR。使用TA克隆系統(tǒng)(普洛麥格，美國(guó))，將擴(kuò)增的片段CG373克隆到pGEM-T Easy載體中，并使用測(cè)序酶2.0版DNA測(cè)序系統(tǒng)(美國(guó)生物化學(xué)公司(United States Biochemical Co.)，美國(guó))確定它的核苷酸序列，以獲得核苷酸序列SEQ ID NO5。使用BLAST和FASTA程序?qū)ζ蜟G373的核苷酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的核苷酸序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明這個(gè)片段與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的任何一種核苷酸序列具有很少的相似性。實(shí)施例2cDNA文庫(kù)篩選使用32P-標(biāo)記的隨機(jī)引物CG373 cDNA探針，通過噬菌斑雜交(Sambrook，J.等.，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(A laboratory manual)，紐約ColdSpring Harbor Laboratory(1989))篩選噬菌體λgt11人肺胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫(kù)(通常由Prof. IY Chung at Hanyang University，漢城，韓國(guó)提供)，以獲得全長(zhǎng)cDNA克隆(表示為HCCS-1)。確定了全長(zhǎng)HCCS-1cDNA克隆的核苷酸序列。
全長(zhǎng)HCCS-1cDNA克隆含555bp具有核苷酸序列SEQ ID NO1的插入片段，和編碼一個(gè)多肽的完整的開放閱讀框架，該多肽由79個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO2)組成，具有大約9kDa的分子量。全長(zhǎng)HCCS-1cDNA克隆的核苷酸序列于2000年3月24日在GenBank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為AF249277。
將全長(zhǎng)HCCS-1cDNA插入到載體pCEV-LAC(Miki，T.等.，基因，83，137-146(1989))中，以獲得重組載體HCCS-1/pCEV-LAC，并用這個(gè)重組載體HCCS-1/pCEV-LAC轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以獲得轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，表示為JM109/HCCS1，其于2000年4月10日保藏于韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，大田305-333，韓國(guó))，保藏號(hào)為KCTC 0768BP。
為確認(rèn)HCCS-1蛋白，將全長(zhǎng)HCCS-1cDNA插入到原核表達(dá)載體pGEX4T-1(Amersham Pharmacia，美國(guó))的BamHI和SalI位點(diǎn)。將得到的重組載體HCCS-1/pGEX4T-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化子，通過向其中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)HCCS-1基因的表達(dá)，并在37℃下反應(yīng)混合物3小時(shí)。從在誘導(dǎo)前后收集的培養(yǎng)樣品中獲得蛋白樣品，并按照Sambrook等的方法(見上)進(jìn)行SDS-PAGE。
圖2表示誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)化了HCCS-1基因的大腸桿菌蛋白樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果。從圖2可以看出，誘導(dǎo)后表達(dá)了一個(gè)35kDa的蛋白，該蛋白由融合了衍生自pGEX4T-1的26kDa蛋白的HCCS-1蛋白組成。這個(gè)結(jié)果推測(cè)HCCS-1蛋白具有約9kDa的分子量。
通過重復(fù)實(shí)施例1步驟1的程序，從正常外子宮頸組織，初期子宮頸癌和轉(zhuǎn)移的骼總淋巴結(jié)組織；和人子宮頸癌細(xì)胞系CUMC-6和HeLa(ATCCCCL-2)制備總RNA。將20μg每種總RNA變性，然后通過1％甲醛瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Boehringer-Mannheim，德國(guó))。用32P-標(biāo)記的隨機(jī)引物HCCS-1cDNA探針42℃下過夜雜交印跡，探針用rediprime II隨機(jī)引物標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham，英國(guó))制備。同樣重復(fù)RNA印跡分析結(jié)果兩次，通過光密度測(cè)定法定量，用β-肌動(dòng)蛋白探針雜交相同的印跡以確定mRNA的完整性。
使用正常人12多組織(multiple-tissues)(Clontech)和人癌細(xì)胞系(Clontech)，按照供應(yīng)商的推薦進(jìn)行RNA印跡分析。
圖3A表示使用HCCS-1cDNA探針，正常子宮頸組織，初期子宮頸癌組織和子宮頸癌組織細(xì)胞系HeLa和CUMC-6的RNA印跡分析結(jié)果；和圖3B，用β-肌動(dòng)蛋白探針雜交相同的印跡。從圖3A和3B可以看出，在所有的正常子宮頸組織中HCCS-1基因的表達(dá)水平提高，但在子宮頸癌組織和子宮頸癌細(xì)胞系中卻幾乎不表達(dá)。
圖4A表示使用HCCS-1cDNA探針，正常人組織即腦，心臟，骨骼肌，結(jié)腸，胸腺，脾，腎，肝，小腸，胎盤，肺和外周血白細(xì)胞的RNA印跡分析結(jié)果；和圖4B，用β-肌動(dòng)蛋白探針雜交相同的印跡。從圖4A和4B可以看出，約1.6kb的優(yōu)勢(shì)HCCS-1 mRNA轉(zhuǎn)錄物在正常胎盤，腎，肝，骨骼肌和心臟同樣超表達(dá)，證實(shí)低水平表達(dá)的其它組織包括，按遞減次序排列，肺，脾，外周血白細(xì)胞和結(jié)腸組織。另外，在胎盤，腎，肝，骨骼肌和心臟組織中鑒定了約1.0和0.6kb的轉(zhuǎn)錄物。
圖5A表示使用HCCS-1cDNA探針，人白血病和淋巴瘤細(xì)胞系，即早幼粒細(xì)胞性白血病(promyelocytic leukemia)HL-60細(xì)胞，HeLa子宮頸癌細(xì)胞，慢性骨髓性白血病K-562細(xì)胞，淋巴性白血病MOLT-4細(xì)胞，伯基特淋巴瘤Raji細(xì)胞，SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，A549肺癌細(xì)胞和G361黑素瘤細(xì)胞的RNA印跡分析結(jié)果；和圖5B，用β-肌動(dòng)蛋白探針雜交相同的印跡。從圖5A和5B可以看出，在人白血病和淋巴瘤細(xì)胞系中未檢測(cè)到0.6，1.0和1.6kb HCCS-1轉(zhuǎn)錄物。實(shí)施例4制備用人HCCS-1基因轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞(步驟1)表達(dá)載體的構(gòu)建將在實(shí)施例2中制備的重組載體HCCS-1/pCEV-LAC用SalI酶切，以獲得含555bp全長(zhǎng)HCCS-1cDNA的片段。然后，將SalI酶切片段插入到真核表達(dá)載體pCEV-27(Miki，T.等.，基因，83，137-146(1989))的SalI位點(diǎn)，以獲得表達(dá)載體HCCS-1/pCEV-27。(步驟2)用脂轉(zhuǎn)染胺(Gibco BRL)將在步驟1中獲得的表達(dá)載體HCCS-1/pCEV-27引入HeLa子宮頸癌細(xì)胞(ATCC CCL-2)，然后，在補(bǔ)加以0.6mg/ml G418(Gibco)的培養(yǎng)基中選擇得到的轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體HCCS-1/pCEV-27的HeLa細(xì)胞。制備僅含pcDNA3的HeLa細(xì)胞另一個(gè)種群作為對(duì)照。
為鑒定HCCS-1基因的超表達(dá)，克隆并篩選轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。通過重復(fù)實(shí)施例1步驟1的程序，從轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞獲得總RNA，進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)到尼龍膜上。用32P-標(biāo)記的隨機(jī)引物HCCS-1cDNA探針雜交印跡。
圖6表示轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞(HCCS-1)，僅轉(zhuǎn)染了載體pcDNA3的HeLa細(xì)胞(pcDNA3)和親本野生型HeLa細(xì)胞(1×105的細(xì)胞數(shù))各自的RNA印跡分析結(jié)果。從圖6可以看出，一個(gè)單個(gè)的0.6kb mRNA轉(zhuǎn)錄物，其與實(shí)施例3中顯示的正常子宮頸組織的轉(zhuǎn)錄物一致，在轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞中表達(dá)，但在僅轉(zhuǎn)染了載體pcDNA3的HeLa細(xì)胞和親本野生型HeLa細(xì)胞中卻不表達(dá)。實(shí)施例5HCCS-1基因?qū)Π┘?xì)胞的生長(zhǎng)抑制為檢驗(yàn)HCCS-1基因?qū)ψ訉m頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，將每種在實(shí)施例4步驟2中獲得的轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞，僅轉(zhuǎn)染了pcDNA3的HeLa細(xì)胞和野生型HeLa細(xì)胞(1×105的細(xì)胞數(shù))培養(yǎng)9天。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，分別使用胰蛋白酶消化(detach)三角瓶中的細(xì)胞，利用臺(tái)盼藍(lán)染料排阻，在第0，1，3，5，7和9天記數(shù)存活的細(xì)胞(Freshney，I.R.，動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，2nd Ed.A.R.Liss，紐約(1987))。通過三次測(cè)定，數(shù)據(jù)表示為±S.D.。
圖7表示轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞(HCCS-1)，僅轉(zhuǎn)染了pcDNA3的HeLa細(xì)胞(pcDNA3)和親本野生型細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。從圖7可以看出，與僅轉(zhuǎn)染了pcDNA3的HeLa細(xì)胞或野生型HeLa細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞的死亡率增加。當(dāng)與野生型HeLa細(xì)胞相比時(shí)，9天大約50％轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞保持存活。這個(gè)結(jié)果推測(cè)HCCS-1基因抑制HeLa子宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)施例6HCCS-1基因誘導(dǎo)程序化細(xì)胞死亡的活性為檢驗(yàn)HCCS-1基因是否具有誘導(dǎo)程序化細(xì)胞死亡的活性，如下檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞的DNA斷裂，細(xì)胞色素c的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，膜PS改變和化療劑引發(fā)的程序化細(xì)胞死亡。(1)DNA斷裂分析在Waymouth MB 751/1培養(yǎng)基上將在實(shí)施例4步驟2中獲得的轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞，僅轉(zhuǎn)染了pcDNA3的HeLa細(xì)胞和親本野生型細(xì)胞培養(yǎng)3，5或7天，然后，進(jìn)一步在無(wú)血清培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天。收集細(xì)胞并在含100μg/ml蛋白酶K的裂解緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.4，10mM EDTA，10mM NaCl，和0.5％SDS)中48℃過夜裂解。向其中加入1/5體積的5M NaCl和等體積的異戊醇以沉淀DNA。將DNA沉淀溶解在TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.8，1mM EDTA)中，并用0.1mg/ml的RNA酶A(RNase A)37℃消化4小時(shí)。將5μg的DNA在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用溴化乙錠染色，紫外光下顯示。
圖8表示轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞在3，5和7天(分別是第3，第5和第7天)，轉(zhuǎn)染了pcDNA3的HeLa細(xì)胞(pcDNA3)在第7天，和親本野生型HeLa細(xì)胞在第7天的DNA斷裂分析結(jié)果。從圖8可以看出，在無(wú)血清培養(yǎng)基中，在細(xì)胞死亡期間，以依靠時(shí)間的方式，與親本野生型細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞中DNA斷裂成oligonucleosomal梯是明顯的，這推測(cè)HCCS-1基因誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞中的程序化細(xì)胞死亡。(2)細(xì)胞色素c的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移為檢驗(yàn)在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中細(xì)胞色素c的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，按照Akao Y等(癌癥研究(Cancer Res)，54，2468-71(1994))如下確定亞細(xì)胞部分的細(xì)胞色素c含量。(步驟1)亞細(xì)胞分級(jí)用PBS洗滌在實(shí)施例4步驟2中獲得的轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞，并懸浮在低滲溶液(10mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸，10mMMgCl2和42mM KCl)中，置于冰上5分鐘。使細(xì)胞流過30計(jì)量針(30-gauge needle)，并在600g下離心10分鐘，以收集粗胞核。將上清液10,000g下離心10分鐘，以獲得一個(gè)上清液，其在100,000g下被進(jìn)一步離心90分鐘。得到的沉淀和上清液分別用作未標(biāo)記膜(light membrane)(線粒體部分)和細(xì)胞質(zhì)部分。(步驟2)蛋白質(zhì)印跡為測(cè)定胞質(zhì)和線粒體部分的細(xì)胞色素c含量，如下進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。
將在步驟1中獲得的胞質(zhì)和線粒體部分在10％SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，然后電印跡到硝酸纖維素膜上。在三羥甲基氨基甲烷緩沖的鹽水(TBS；10mM Tris-HCI，pH 7.5和150mM NaCl)中用5％無(wú)脂奶粉孵育該膜1小時(shí)，并用一級(jí)抗體即鼠抗細(xì)胞色素c單克隆抗體(PharMingen，美國(guó))4℃下孵育16小時(shí)。洗滌得到的膜，然后室溫下用封閉液孵育，封閉液含1∶1,000稀釋的二級(jí)抗體即結(jié)合辣根過氧化物酶的二級(jí)羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白(Jackson免疫研究(ImmunoResearch))。用ECL-蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑盒(Amersham，Buckinghamshire，UK)顯現(xiàn)蛋白。
圖9表示轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞(HCCS-1)和親本野生型HeLa細(xì)胞(野生)的線粒體和細(xì)胞質(zhì)部分的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。從圖9可以看出，在轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞中，線粒體部分的細(xì)胞色素c被減少，而胞質(zhì)部分的細(xì)胞色素c以伴隨方式增加。這些結(jié)果推測(cè)HCCS-1基因誘導(dǎo)細(xì)胞色素c從線粒體到胞質(zhì)的釋放。(3)膜PS改變?yōu)闄z驗(yàn)質(zhì)膜PS轉(zhuǎn)移，如下進(jìn)行結(jié)合了膜聯(lián)蛋白V/PI分析系統(tǒng)(VermesI等.，免疫方法雜志(J Immunol Methods).，184，39-51(1995))的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。
用冷的PBS洗滌在實(shí)施例4步驟2中獲得的轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的1×107HeLa細(xì)胞，并在10μl的10×結(jié)合緩沖液(100mM HEPES pH 7.4，1.5M NaCl，50mM KCI，10mM MgCl2和18mM CaCl2)中稀釋。如同程序化細(xì)胞死亡試劑盒的生產(chǎn)者(TACSTM膜聯(lián)蛋白V-FITC，Trevigen，Inc.，Gaithersburg，MD，美國(guó))所指示的，向其中加入1μl的膜聯(lián)蛋白V偶聯(lián)物和10μl的碘化丙錠(PI)。將得到的細(xì)胞懸液在黑暗中室溫孵育15分鐘，并向其中加入400μl1×結(jié)合緩沖液，然后在Coulter XL Epics流式細(xì)胞儀(Coulter Corp.，Miami，F(xiàn)L)上進(jìn)行分析。
圖10A和10B表示使用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI，轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞和親本野生型細(xì)胞各自的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果。在
圖10A和10B中，log綠色熒光(膜聯(lián)蛋白V-FITC)對(duì)log紅色熒光(PI)顯示四種種群對(duì)兩種熒光均顯陰性的細(xì)胞(R1；下面的左象限)，其代表活的靶細(xì)胞；膜聯(lián)蛋白V-FITC陽(yáng)性和PI陰性細(xì)胞(R2；下面的右象限)，其代表早期的程序化細(xì)胞死亡的細(xì)胞；對(duì)兩種熒光均顯陽(yáng)性的細(xì)胞(R3；上部的右象限)，其代表晚期程序化細(xì)胞死亡的或壞死的細(xì)胞，和膜聯(lián)蛋白V-FITC陰性和PI陽(yáng)性細(xì)胞(R4；上部的左象限)，其代表僅具有透化的(permeabilized)膜的細(xì)胞(Aubry J-P等.，細(xì)胞計(jì)量術(shù)，37，197-204(1999))。從
圖10A和10B可以看出，有生存的(R1)，早期程序化細(xì)胞死亡的(R2)，和晚期程序化細(xì)胞死亡的或壞死的(R3)細(xì)胞，并且在早期程序化細(xì)胞死亡過程中有22％的轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的總HeLa細(xì)胞，而有2.2％的野生型HeLa細(xì)胞。從這個(gè)結(jié)果推測(cè)HCCS-1基因誘導(dǎo)與質(zhì)膜脂質(zhì)改變相關(guān)的程序化細(xì)胞死亡。
由于在HeLa子宮頸癌細(xì)胞中HCCS-1誘導(dǎo)的程序化細(xì)胞死亡，這些膜聯(lián)蛋白V/PI流式細(xì)胞計(jì)結(jié)果是與(2)的細(xì)胞色素c釋放結(jié)果充分相關(guān)的。(4)阿霉素或UVC引發(fā)的程序化細(xì)胞死亡為檢測(cè)是否藥物或紫外光引發(fā)轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的細(xì)胞的程序化細(xì)胞死亡，如同Hedley，D.W.所描述(在流式細(xì)胞計(jì)中，來(lái)自石蠟內(nèi)嵌塊的DNA分析(eds Darzynkiewicz，Z.& Crissman，H.A.)139(Academic Press，San Diego，1990))，進(jìn)行細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)分析。
將在實(shí)施例4步驟2中獲得的轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞和親本野生型細(xì)胞培養(yǎng)直至對(duì)數(shù)中期，并在含0.5％牛的小牛血清的WaymouthMB752/1培養(yǎng)基中孵育36小時(shí)以使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G0/G1期。用阿霉素(分別為0.1和2μg/ml)或UVC(J/m2)處理細(xì)胞，然后，在含0.5％牛的小牛血清的Waymouth MB752/1培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞以恢復(fù)細(xì)胞生長(zhǎng)。24小時(shí)后，收獲HeLa細(xì)胞，用胰蛋白酶處理，并在70％乙醇中固定。
將50μg/ml的PI染色溶液(Sigma)和100單位/ml RNA酶A(BoerhingerMannheim)加入到2×106固定的細(xì)胞中。孵育1小時(shí)后，使用FACS Caliber(Becton Dickinson)，通過在488nm的熒光分析確定細(xì)胞DNA含量。用Modfit 5.2軟件分析1×104個(gè)細(xì)胞每個(gè)樣本的最小值。
圖11A和
圖11B是未經(jīng)阿霉素或UVC處理的，轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞和親本野生型細(xì)胞各自的細(xì)胞周期圖；
圖11C和11D，用0.1μg/ml阿霉素處理后；
圖11E和11F，2μg/ml阿霉素處理后；和
圖11G和11H，UVC處理后，其中M1表示G0/G1期；M2，S-期；M3，G2/M期；和M4，程序化細(xì)胞死亡的亞G0/G1期。從
圖11A-11H可以看出，在親本野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的HeLa細(xì)胞之間，在細(xì)胞種群中關(guān)于細(xì)胞周期進(jìn)展阿霉素未引起明顯的差異。在野生型HeLa細(xì)胞中，用阿霉素或UVC處理后，幾乎沒有細(xì)胞保持在程序化細(xì)胞死亡的亞G0/G1期。相反，相當(dāng)大量的轉(zhuǎn)染了HCCS-1基因的細(xì)胞仍處于程序化細(xì)胞死亡的亞G0/G1期。這些結(jié)果推測(cè)HCCS-1基因誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)于藥物或紫外光引發(fā)的程序化細(xì)胞死亡更敏感。
僅參照優(yōu)選的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述和說明，對(duì)于那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員是明顯的，即如果未脫離在后附的權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的精神和范圍，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修改。
涉及微生物或其它生物材料的保藏的說明保藏人金振宇Hyundae Apt.118-804，Apgujung-dong，Kangnam-gu，漢城135-110，韓國(guó)
序列表<110>金振字<120>人子宮頸癌抑制蛋白，編碼該蛋白的多核苷酸，用該核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和用表達(dá)載體抑制癌細(xì)胞增殖的方法<130>PCA01147/KJW<150>KR 2000-21897<151>2000-04-25<160>5<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>555<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(283)..(522)<400>1ggccattacc aatcgcgaaa cccgaatccc ggacctgcgc tgaggaggcg gttcatctgt 60ggccagcggt gcttcgggac ccgcgctggg ggaaccctgg cgacggggcc tggccctgct120atatgcgggg gcctcggctg gagtgagcgg cgtggacgcc tctttcctcc ggctcttccc180ttgttgctgc gagagcgaga gggccgcggg cggcggaggc agcggggccg ggatggagga240cgttaactct aacgtgaacg cggaccagga ggctggagtg ca atg gcg cga 291Met Ala Arg1tct cgg ctc act gca acc tct gtc tcc cag gtt cag gaa aat ggc ttt 339Ser Arg Leu Thr Ala Thr Ser Val Ser Gln Val Gln Glu Asn Gly Phe5 10 15gta aag aag ctt gag cct aaa tct ggc tgg atg act ttt cta gaa gtt 387Val Lys Lys Leu Glu Pro Lys Ser Gly Trp Met Thr Phe Leu Glu Val20 25 30 35aca gga aag atc tgt gaa atg ctc ttc tgt cct gaa gca ata ctg ttg 435Thr Gly Lys Ile Cys Glu Met Leu Phe Cys Pro Glu Ala Ile Leu Leu40 45 50acc aga aag gac act cta tat tgt gaa acc ggc cta att ttt ctg act483Thr Arg Lys Asp Thr Leu Tyr Cys Glu Thr Gly Leu Ile Phe Leu Thr55 60 65ctt acg aaa acg att gcc aac aca tac ttc tac ttt taaataaacaa530Leu Thr Lys Thr Ile Ala Asn Thr Tyr Phe Tyr Phe ***70 75 80ctttgatgat gtaacttgaa aaaaa555<210>2<211>79<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Arg Ser Arg Leu Thr Ala Thr Ser Val Ser Gln Val Gln Glu1 5 10 15Asn Gly Phe Val Lys Lys Leu Glu Pro Lys Ser Gly Trp Met Thr Phe20 25 30Leu Glu Val Thr Gly Lys Ile Cys Glu Met Leu Phe Cys Pro Glu Ala35 40 45Ile Leu Leu Thr Arg Lys Asp Thr Leu Tyr Cys Glu Thr Gly Leu Ile50 55 60Phe Leu Thr Leu Thr Lys Thr Ile Ala Asn Thr Tyr Phe Tyr Phe ***65 70 75 80<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>H-T11G錨定的寡-dT引物<400>3aagctttttt tttttg 16<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>任意5′13 mer H-AP 37<400>4aagcttgggc cta 13<210>5<211>193<212>DNA<213>人<400>5taactctaac gtgaacgcgg accaggaggc tggagtgcaa tggcgcgatc tcggctcact 60gcaacctctg tctcccaggt tcaggaaaat ggctttgtaa agaagcttga gcctaaatct120ggctggatga cttttctaga agttacagga aagatctgtg aaatgctctt ctgtcctgaa180gcaatactgt tga 193權(quán)利要求
1.一種分離自人的腫瘤抑制蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
2.一種編碼權(quán)利要求1的腫瘤抑制蛋白的多核苷酸。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其具有核苷酸序列SEQ ID NO1。
4.一種包含權(quán)利要求2或3的多核苷酸的表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其是載體HCCS-1/pCEV-LAC。
6.一種用權(quán)利要求4的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，該細(xì)胞是微生物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的細(xì)胞，其是大腸桿菌JM109/HCCS1(KCTC 0768BP)。
8.一種抑制癌細(xì)胞增殖的方法，其包含將權(quán)利要求4的表達(dá)載體引入癌細(xì)胞，以誘導(dǎo)它的程序化細(xì)胞死亡。
9.一種預(yù)防或治療癌癥的組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求2或3的多核苷酸和藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有氨基酸序列SEQ ID NO2的人腫瘤抑制蛋白；編碼該腫瘤抑制蛋白的多核苷酸；含該多核苷酸的表達(dá)載體；用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物或動(dòng)物細(xì)胞；一種抑制癌細(xì)胞增殖的方法，其包含將該表達(dá)載體引入癌細(xì)胞以誘導(dǎo)它的程序化細(xì)胞死亡；和一種預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其包含治療有效量的多核苷酸和藥用載體。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1451016SQ00819384
公開日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2000年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月25日
發(fā)明者金振宇 申請(qǐng)人:金振宇