專利名稱：高酶活家蠶基因工程植酸酶的提取方法
技術領域：
本發(fā)明屬于轉基因物質，尤其是畜禽用轉基因酶制劑制造領域。
中國專利CN99103564公開了一種應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統(tǒng)生產植酸酶的基因工程方法，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，并使其處于多角體蛋白基因啟動子的控制下，再將此重組質粒與野生型BmNPV-DNA共轉染于家蠶細胞，通過體內同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動子啟動植酸酶基因，并將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白。但如何將家蠶基因工程植酸酶生產在較大的工業(yè)化程度上實現(xiàn)，或者更具體地說在畜禽用轉基因酶制劑工業(yè)中高產量、低成本的生產出具有商業(yè)競爭力的產品仍是需要解決的問題。
現(xiàn)有技術采用收蠶后直接勻漿處理的方式，使得部分植酸酶仍存在于蠶體細胞中，一定程度上抑制了酶體的整體活性。
本發(fā)明的目的是，研究一種高酶活家蠶基因工程植酸酶的提取方法，使之能改善現(xiàn)有技術的不足，使存于蠶體細胞中的植酸酶充分釋放，提高酶體的檢測活性值，低成本、批量化生產畜禽飼料用基因工程植酸酶商品化制劑。
本發(fā)明的目的使通過如下的方法實現(xiàn)的。
高酶活家蠶基因工程植酸酶的提取方法，應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統(tǒng)生產植酸酶，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，將特定的重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白；將目標病蠶經(jīng)勻漿后與一定細度的麩皮吸附，再經(jīng)烘干——粉碎——過篩后標定酶活的工藝得到商業(yè)化產品，在目標病蠶勻漿處理前將病蠶作凍存處理。
采用本發(fā)明的方法可使家蠶細胞在凍存過程中遭到破裂，蠶體細胞內的植酸酶充分釋放，較常規(guī)方法獲得平均較高的酶活量，從而降低基因工程飼用植酸酶制劑的生產成本。
蠶幼蟲五齡起餉食第二天，蛹在接種后第二天，擴增的重組BmNPV滴度標定達106PFU，鏡檢無多角體，預試驗表達量需≥200U/克，注射接種深度約皮下2mm，以注射后不出血或少量出血為好，注射量3～5μl消毒蠶幼蟲用70％酒精棉球體表消毒。按種后，蠶體噴灑氯霉素(氯霉素先用適量無水乙醇溶解后，加無菌水定容至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用)，每隔兩天噴一次。接種后，嚴格控制溫度在25±1℃，濕度(常規(guī))，通風良好。對蠶幼蟲，需加強飼養(yǎng)管理，仔細觀察蠶食量的變化及發(fā)病情況，對提早發(fā)病的先將其放于4℃冰箱保存，若發(fā)病過早，應注意觀察是否為野生BmNPV感染所致，一旦確定，應立即對病源進行追查，對可疑物品及蠶室進行必要的消毒處理。觀察中應隨時注意淘汰細菌蠶。收發(fā)病蠶幼蟲標準一般收蠶時間為接種后4～5天，病蠶有狂躁亂爬、體軀腫脹，往往伴隨有高節(jié)蠶的出現(xiàn)，血液變?yōu)槿榘咨珳啙岬劝Y狀出現(xiàn)時收蠶。對于蛹，一般收蛹時間為接種后5～6天，病蛹出現(xiàn)體壁暗淡、易破裂，血液變?yōu)槿榘谆蛉辄S色渾濁等癥狀時收蠶將病蠶稱重并于70％乙醇中浸泡后，于20℃、5℃、-5℃、-20℃、-80℃、-196℃保存24小時；對蛹，則將病蛹稱重后直接于20℃、5℃、-5℃、-20℃、-80℃、-196℃保存24小時。之后，勻漿、測酶活。不同溫度處理后多種家蠶幼蟲中植酸酶的活性比較，均得到基本相同的變化趨勢，下面的圖以華5A×華5B，及華5A·B×神6·B兩個品種為代表。


圖1為家蠶幼蟲中植酸酶活性隨處理溫度的變化表。
圖2為家蠶蛹中植酸酶活性隨處理溫度的變化表。
由此可見，經(jīng)低溫處理后，幼蟲和蛹中植酸酶活性都有較大的提高。其中，-20℃處理后活性顯著增加，而-196℃處理時活性最大。然而，-80℃、-196℃處理需要低溫冰箱或液氮，而其活性相對于-20℃處理增加并不大，而-20℃處理使用普通冰箱就可以實現(xiàn)，因而采用-20℃處理是最為經(jīng)濟實用，并且植酸酶活性提高也較大。
經(jīng)-20℃處理后家蠶幼蟲中植酸酶的活性比較
經(jīng)-20℃凍存20小時處理后蛹體中植酸酶的活性比較
-20℃凍存24小時處理前后酶活變化情況比較
由以上結果可看出經(jīng)-20℃處理后，酶活最高可提高95.3％，最低可提高15.9％，平均提高55.1％。
本發(fā)明創(chuàng)造了一種經(jīng)濟而高效的處理方法，能在家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化生產中，顯著的提高植酸酶的檢測活性，且操作簡便，無需投入昂貴的設備。
權利要求
1.高酶活家蠶基因工程植酸酶的提取方法，應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統(tǒng)生產植酸酶，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，并使其處于多角體蛋白基因啟動子的控制下，再將此重組質粒與野生型BmNPV-DNA共轉染于家蠶細胞，通過體內同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動子啟動植酸酶基因，并將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白降目標病蠶經(jīng)勻漿后與一定細度的麩皮吸附，再經(jīng)烘干——粉碎——過篩后標定酶活的工藝得到商業(yè)化產品，其特征在于，在目標病蠶勻漿處理前將病蠶作凍存處理。
2.根據(jù)權利要求1所述之高酶活家蠶基因工程植酸酶的提取方法，其特征在于，所述凍存溫度控制在-18℃至-30℃。
3.根據(jù)權利要求1所述之高酶活家蠶基因工程植酸酶的提取方法，其特征在于，所述凍存條件控制在-20℃下凍存≥20小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高酶活家蠶基因工程植酸酶的提取方法,應用重組BmNPV載體－家蠶宿主表達系統(tǒng)生產植酸酶,用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因,將特定的重組家蠶核型多角體感染家蠶,在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白;將目標病蠶經(jīng)勻漿后與一定細度的麩皮吸附,再經(jīng)烘干——粉碎——過篩后標定酶活的工藝得到商業(yè)化產品,在目標病蠶勻漿處理前將病蠶作凍存處理。采用本發(fā)明的方法可使蠶體細胞內的植酸酶充分釋放,較常規(guī)方法的平均檢測酶活值提高55.9%以上。
文檔編號C12N9/16GK1384193SQ0110739
公開日2002年12月11日 申請日期2001年4月30日 優(yōu)先權日2001年4月30日
發(fā)明者張志芳, 何家祿, 秦儉 申請人:四川華神集團股份有限公司