專(zhuān)利名稱(chēng)：一種直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植酸酶活性測(cè)定，具體的說(shuō)是一種直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法。
背景技術(shù)：
植酸酶屬于磷酸單酯水解酶，是一類(lèi)特殊的酸性磷酸酶，可催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸鹽。1968年,Shien等確定第一個(gè)被分離純化的植酸酶來(lái)源于土曲霉,并且從68個(gè)土樣中對(duì)2000個(gè)菌株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在所得的22株黑曲霉中有21株能產(chǎn)生植酸酶。從此以后，陸續(xù)從十幾種微生物中分離得到植酸酶。植酸酶主要來(lái)源于微生物。微生物來(lái)源的植酸酶分解植酸鹽的最終產(chǎn)物主要是單磷酸肌醇和無(wú)機(jī)正磷酸鹽。植酸及其鹽類(lèi)廣泛存在于植物組織和相應(yīng)的糧食產(chǎn)品中，占其總量的1_3%，其中磷含量占植物總磷的60-90%，是磷和肌醇的主要儲(chǔ)存形式。植酸酶是催化植酸水解成肌醇與磷酸的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，因此，植酸酶已在飼料和食品工業(yè)中廣泛地得到應(yīng)用。而對(duì)植酸酶活性的檢測(cè)成為衡量 飼料、食品、土壤等中的磷素可利用性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前在植酸酶活性的檢測(cè)工作中，常使用紫外分光光度法對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)物正磷酸鹽進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)植酸酶活性單位的定義，由磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待檢植酸酶的活性。世界公認(rèn)的測(cè)定方法中，被廣泛認(rèn)可和使用較多的方法是Gostbrocades和BASF公司1991年提出的植酸酶活性的測(cè)定方法，但此方法在操作上仍存在不簡(jiǎn)便，方法穩(wěn)定性不夠，測(cè)定結(jié)果誤差相對(duì)較大等缺點(diǎn)。而目前對(duì)于土壤中的植酸酶活性的測(cè)定方法仍沒(méi)有形成一套完整且效果較好的體系，更多的是將土壤制成懸濁液后取定量懸液進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)定，而此方法操作不簡(jiǎn)便，誤差較大，不能夠完全真實(shí)的反應(yīng)土壤植酸酶活性特征。因此，建立一種對(duì)土壤植酸酶活性的直接測(cè)定方法，提高土壤植酸酶活性測(cè)定的效率和準(zhǔn)確性，對(duì)于評(píng)價(jià)土壤磷素利用狀況具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法，將甲苯加入到待測(cè)定土壤中，而后進(jìn)行底物培養(yǎng)在待測(cè)土壤中加入PH5. 5的乙酸緩沖液、植酸鈉；待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，顯色后在415nm下測(cè)定顯色液吸光度，即可獲得土壤植酸酶。所述待測(cè)定土壤過(guò)篩后稱(chēng)取I. OOg加入O. 2mL甲苯抑制土壤微生物活性。所述底物培養(yǎng)是向經(jīng)甲苯處理過(guò)的測(cè)定土壤中加入O. 25mol Ι^ρΗδ. 5的乙酸緩沖液后，再加入2mL濃度O. 00761mol Γ1的植酸鈉溶液，輕搖混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在30-40°C恒溫條件下密閉培養(yǎng)O. 5-1. 5小時(shí)。所述待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，是將底物培養(yǎng)后待測(cè)定土壤中加入2mL的顯色液，搖勻顯色20 - 30min后過(guò)濾，取上清液在415nm下測(cè)定吸光度。所述顯色液為鑰酸銨溶液(100g L—1)、釩酸銨溶液(2. 35g L—1)和稀硝酸(濃硝酸水=1:2的混合液，所述鑰酸銨溶液、釩酸銨溶液和稀硝酸按體積比為1:1:2的混合。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明采用甲苯抑制土壤中的微生物活性，控制了土壤微生物在對(duì)植酸酶活性測(cè)定過(guò)程中的影響。2.本發(fā)明直接將土壤進(jìn)行培養(yǎng)，調(diào)節(jié)植酸酶最適pH以及最適溫度，使土壤中的植酸酶活性得到最真實(shí)的表達(dá)。3.本發(fā)明采用終止/顯色液，既是酶促反應(yīng)終止液，又是產(chǎn)物反應(yīng)液，同時(shí)顏色反應(yīng)不受溫度和時(shí)間限制，操作穩(wěn)定可靠。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同土壤植酸酶活性特征圖。 具體實(shí)施方式
本發(fā)明采用甲苯抑制土壤中的微生物活性，從而控制微生物活動(dòng)對(duì)酶活測(cè)定的影響；然后，在土壤中加入pH5. 5的乙酸緩沖液，再加入底物植酸鈉進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)后加入終止/顯色液，終止反應(yīng)并顯色，在415nm下測(cè)定吸光度即可獲得土壤植酸酶活性。具體方法詳述如下I)甲苯殺死微生物以及底物培養(yǎng)稱(chēng)取I. OOg鮮待測(cè)土倒入50mL三角瓶中，用移液槍小心加入O. 2mL甲苯，迅速塞上瓶塞(注意試驗(yàn)防護(hù)，甲苯有毒)。向處理過(guò)的土壤樣品中加入4mL0. 25mol Γ1 ρΗ5. 5的乙酸緩沖液，搖勻后，再加入2mL濃度O. 00761mol Γ1的植酸鈉溶液，輕搖混勻后塞上瓶塞放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在30-40°C條件下培養(yǎng)O. 5-1. 5小時(shí)。其中，O. 25mol Γ'ρΗδ. 5的乙酸緩沖液是將34. 02g三水乙酸鈉和I. 24mL濃鹽酸加去離子水，用冰醋酸和氫氧化鈉調(diào)PH值至5. 50定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用);植酸鈉溶液是稱(chēng)取7. 81g質(zhì)量純度為90%植酸鈉加入乙酸緩沖液用冰乙酸或氫氧化鈉調(diào)pH至5. 5后定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需設(shè)置對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，用以消除土壤的本底值對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響，即在操作過(guò)程中用2mL乙酸緩沖液代替植酸鈉溶液，其他操作同實(shí)驗(yàn)組。2)終止/顯色測(cè)定將經(jīng)過(guò)步驟I)培養(yǎng)后的樣品取出，迅速加入2mL的終止/顯色液，搖勻顯色20-30min后用定性濾紙過(guò)濾,取濾液在415nm下測(cè)定吸光度。其中，終止/顯色液是體積比為鑰酸銨溶液(鑰酸銨溶液濃度為IOOg Γ1):釩酸銨溶液(釩酸銨溶液
2.358^):稀硝酸(稀硝酸由濃硝酸和水體積比，濃硝酸水=1:2) =1:1:2的混合液。3)植酸酶活性計(jì)算公式酶活(FTU/g)={(P-P0) XV}/ (mXh)式中P----測(cè)定實(shí)驗(yàn)組總憐量/ U mo I P0――測(cè)定對(duì)照組總磷量/ μ molV——所加溶液總體積/mLm——干土重量/gh----培養(yǎng)時(shí)間/小時(shí)酶活單位μmol Pireleased g_1 dry soil tf1。實(shí)施例I采集不同土壤(黑土、褐土和棕壤)鮮土,過(guò)2mm篩后各稱(chēng)取I. OOg于50mL三角瓶中，加入O. 2mL甲苯，4mL緩沖溶液，2mL植酸鈉溶液，輕搖混勻塞上瓶塞在37° C下培養(yǎng)I小時(shí)，取出，加入2mL終止/顯色液，搖勻，顯色20min，過(guò)濾，取濾液在415nm下測(cè)定吸光度，即可計(jì)算得到土壤植酸酶活性。其中，O. 25moir1 pH5. 5的乙酸緩沖液是將34. 02g三水乙酸鈉和I. 24mL濃鹽酸加去離子水，用冰醋酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至5. 50定容至IOOOmL (現(xiàn)配現(xiàn)用)；植酸鈉溶液是稱(chēng)取7. 81g90%植酸鈉加入乙酸緩沖液用冰乙酸或氫氧化鈉調(diào)pH至5. 5后定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用)利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定實(shí)施例I不同土壤(黑土、褐土和棕壤)植酸酶活性并進(jìn)行運(yùn)算結(jié)果(見(jiàn)圖I)。由圖I可知，植酸酶活性在黑土中為5. 2 μ mol Pireleased g_1drysoil h \ 揭土為 6· I μ mol Pi released g 1 dry soil h \ 掠壤為 I. 3 μ mol Pi releasedg_1dry soil IT1。各土壤植酸酶活性之間存在一定的差異,表明該方法能夠用來(lái)直接測(cè)定且準(zhǔn)確表達(dá)不同土壤的植酸酶活性特征。
實(shí)施例2采集白衆(zhòng)土表層0-20cm鮮土,過(guò)2mm篩后稱(chēng)取I. OOg于50mL三角瓶中，加入0. 2mL甲苯，4mL緩沖溶液，2mL植酸鈉溶液，輕搖混勻塞上瓶塞在35° C下培養(yǎng)I. 5小時(shí)，取出，力口入2mL終止/顯色液，搖勻，顯色30min，過(guò)濾，取濾液在415nm下測(cè)定吸光度，即可計(jì)算得到
土壤植酸酶活性。其中，0. 25mol L—1 pH 5. 5的乙酸緩沖液是將34. 02g三水乙酸鈉和I. 24mL濃鹽酸加去離子水，用冰醋酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至5. 50定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用);植酸鈉溶液是稱(chēng)取7. 81g 90%植酸鈉加入乙酸緩沖液用冰乙酸或氫氧化鈉調(diào)pH至5. 5后定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用)
權(quán)利要求
1.一種直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于將甲苯加入到待測(cè)定土壤中，而后進(jìn)行底物培養(yǎng)在待測(cè)土壤中加入PH5. 5的乙酸緩沖液、植酸鈉；待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，顯色后在415nm下測(cè)定顯色液吸光度，即可獲得土壤植酸酶。
2.按權(quán)利要求I所述的直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于所述待測(cè)定土壤過(guò)篩后稱(chēng)取I. OOg加入O. 2mL甲苯抑制土壤微生物活性。
3.按權(quán)利要求I所述的直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于所述底物培養(yǎng)是向經(jīng)甲苯處理過(guò)的測(cè)定土壤中加入O. 25mol L_1pH5. 5的乙酸緩沖液后,再加入2mL濃度O. 00761mol Γ1的植酸鈉溶液，輕搖混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在30 - 40°C恒溫條件下密閉培養(yǎng)O. 5 - I. 5小時(shí)。
4.按權(quán)利要求I所述的直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于所述待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，是將底物培養(yǎng)后待測(cè)定土壤中加入2mL的顯色液，搖勻顯色20 - 30min后過(guò)濾，取上清液在415nm下測(cè)定吸光度。
5.按權(quán)利要求I或4所述的直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于所述顯色液為鑰酸銨溶液、釩酸銨溶液和稀硝酸的混合液，所述鑰酸銨溶液、釩酸銨溶液和稀硝酸按體積比為1:1:2的混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及植酸酶活性測(cè)定，具體的說(shuō)是一種直接測(cè)定土壤植酸酶活性的方法。將甲苯加入到待測(cè)定土壤中，而后進(jìn)行底物培養(yǎng)在待測(cè)土壤中加入pH5.5的乙酸緩沖液、植酸鈉；待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，顯色后在415nm下測(cè)定顯色液吸光度，即可獲得土壤植酸酶。本發(fā)明對(duì)土壤中的植酸酶采用直接培養(yǎng)的方法進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)便又穩(wěn)定可靠，基本上達(dá)到了對(duì)土壤植酸酶活性測(cè)定有效、快速的目的。適于對(duì)土壤植酸酶活性的直接測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102866150SQ20121027558
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者張艾明, 陳振華, 陳利軍, 梁文舉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所