專利名稱：一種家畜口蹄疫病毒基因工程苗及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家畜口蹄疫病毒基因工程苗及其制造方法，更具體地說(shuō)，涉及一種利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器來(lái)制造口蹄疫病毒基因工程苗的方法及其產(chǎn)品。
在現(xiàn)有技術(shù)中，用植物作表達(dá)載體來(lái)表達(dá)外源蛋白已有不少報(bào)道，病毒蛋白、細(xì)菌毒素和抗體分子己在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)，且絕大部分表達(dá)蛋白具有完全的抗原功能或標(biāo)識(shí)功能。重要的是，它們同免疫基因一樣可激發(fā)特異性的免疫應(yīng)答，在開(kāi)發(fā)疫苗過(guò)程中，用植物表達(dá)免疫基因，必將是常規(guī)疫苗的經(jīng)濟(jì)替代品?？谔阋卟《?FMDV)極大影響肉和奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。用滅活苗廣泛免疫易感動(dòng)物已非常成功，是防制此病的有效工具，但疫苗廠家具有散毒的危險(xiǎn)，而且免疫效果較好的弱毒苗具有“返祖”現(xiàn)象，給口蹄疫的根除帶來(lái)極大的困難。因此，要徹底地控制和消滅此病，必須開(kāi)發(fā)一種安全、高效的替代品。研究表明FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1攜有典型的抗原決定簇，可誘發(fā)中和抗體的產(chǎn)生。用VPI蛋白或其部分氨基酸合成肽免疫動(dòng)物，均可保護(hù)試驗(yàn)或本體動(dòng)物抵抗強(qiáng)毒攻擊。
本發(fā)明的目的在于提供一種用VP1的完整基因或部分片段在不同的表達(dá)載體中制造一種能有效預(yù)防家畜口蹄疫病毒的、安全高效的疫苗，同時(shí)提供其相應(yīng)的制造方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案用口蹄疫病毒接種小白鼠，從發(fā)病死亡的小白鼠組織中提取口蹄疫病毒RNA，擴(kuò)增出VP1的完整基因ACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCTGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGACCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCACCCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGGCGAGAGCCCCGTGACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTATTGGCTCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGCGCCATCAAAGCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCAAGCGAAGCTAGACACAAACAAAAGATTGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTG該序列是在包括植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子在內(nèi)的植物反應(yīng)器中形成的立體結(jié)構(gòu)之總和，其分子量為30-150KDa。
本發(fā)明是一種家畜口蹄疫病毒重組基因工程苗，包括編碼口蹄疫病毒毒株VP1蛋白的完整基因，將轉(zhuǎn)基因植物種子作種用，播種待植物成熟后用作家畜飼料即可獲得口蹄疫病毒的免疫功能。
本發(fā)明的家畜口蹄疫病毒基因工程苗的制造方法，包括基因重組、重組蛋白的制備，其具體的制造過(guò)程為(1)將VP1全基因插入質(zhì)粒載體采用分子生物學(xué)的方法提抽病毒的核酸RNA，用含啟動(dòng)子和終止子，其上游引物為5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反轉(zhuǎn)錄引物為5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’的特定引物擴(kuò)增出VP1的完整基因，片段兩端為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，用BamHⅠ酶切表達(dá)載體pROK1和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒pROK1.VP1，然后(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒pROK1.VP1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌C58C1菌株細(xì)胞系，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子，再(3)取種子種入土壤，獲得可作為疫苗的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。
在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，工程苗的制造包括用特異的引物獲得目的基因、基因重組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物和利用重組蛋白免疫家畜。構(gòu)建的載體為二元質(zhì)粒pROK1，病毒的RNA從接種FMDV的小鼠組織中抽提，用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增VP1基因，在引物中導(dǎo)入了BamHⅠ酶切位點(diǎn)和起始子及終止子(上游引物5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反轉(zhuǎn)錄引物5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’)，整個(gè)VP1的完整基因克隆至pROK1的BalnHⅠ位點(diǎn)(pROK1.VP1)，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中進(jìn)行表達(dá)，待轉(zhuǎn)基因植物種子成熟后作種用，再將此種子播種，成熟后作家畜飼料即可。將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中表達(dá)，用作轉(zhuǎn)基因的植物可以是玉米、會(huì)薹屬植物(如擬南介)、大豆、高梁、油菜或水稻等。轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)過(guò)培育后，其根、莖、葉、果實(shí)或種子中含外源VP1蛋白，并可經(jīng)ELISA法和Western blot法檢測(cè)確證。
實(shí)施過(guò)程中，將植物種子種于小杯中，在4℃暗室中放置48小時(shí)使其同步發(fā)芽。后轉(zhuǎn)至生長(zhǎng)室20℃曝光16小時(shí)，用雙蒸水，偶而用礦物質(zhì)水澆灌。重組質(zhì)粒pROK1.VP1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞系(Agrobacterium tumefaciens cell line)(C58C1株)，在LB(Luri-Bertani)培養(yǎng)液中(含卡那霉素50mg/ml)培養(yǎng)離心收集細(xì)胞，于200ml MS(murashige和Skoog)培養(yǎng)液(2.35g/l)(含5％蔗糖和10g/L的6-BA(6-芐氨基嘌吟6-benzilaminopurine中重懸。待植物6-7周齡時(shí)，倒置培養(yǎng)杯將植物浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞(Agrobacterium)的重懸液中，真空5×106mpa浸潤(rùn)滲透15分鐘，用水沖洗后放于生長(zhǎng)室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/LMES(嗎啉乙烷磺酸morpholine ethane sulfonicacid)和50mg/ml卡那霉素的瓊脂凝膠(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因種子。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培養(yǎng)成熟即可。轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中含有外源基因VP1，經(jīng)PCR檢測(cè)(上游引物5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反轉(zhuǎn)錄引物5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’)，所含外源蛋白VP1可經(jīng)ELISA和Western blot檢測(cè)確證具有免疫原性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)按本發(fā)明方法制造的疫苗，由于其融合蛋白含有免疫原性蛋白，可有效抵抗口蹄疫病毒的感染，因而具有極高的免疫能力，對(duì)家畜的保護(hù)力強(qiáng)。在0、21、35天免疫小鼠，用104ID50O型口蹄疫病毒攻毒，免疫小鼠的保護(hù)率為100％，而對(duì)照鼠則全部死亡。
以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述實(shí)施例用小鼠繁殖口蹄疫病毒，采用分子生物學(xué)方法抽提病毒的核酸RNA，用含啟動(dòng)子和終止子的特定引物(上游引物5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反轉(zhuǎn)錄引物5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’)，擴(kuò)增出VP1的完整基因，片段兩端為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，用BamHⅠ酶切表達(dá)載體pROK1和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)成重組質(zhì)粒pROK1.VP1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞系(C58C1株)，于LB培養(yǎng)液(含卡那霉素50mg/m)培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于200mlMS培養(yǎng)液(2.35g/l濃度)(含5％蔗糖和10g/l6-BA)中重懸。
將植物的種子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小時(shí)使其同步發(fā)芽，其后轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室20℃曝光16小時(shí)，用雙蒸水，偶爾用礦物質(zhì)水澆灌。待植物6-7周齡時(shí)，倒置培養(yǎng)杯將植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中，真空度5×106mpa浸潤(rùn)滲透15分鐘，用水沖洗后放入生長(zhǎng)室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml濃度卡那霉素的瓊脂膠凝(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因種子，兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培養(yǎng)成熟即可。
轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含外源蛋白VP1，經(jīng)PCR檢測(cè)存在，用特異性引物(上游引物5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反轉(zhuǎn)錄引物5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’)對(duì)抽提物進(jìn)行擴(kuò)增，可特異性地?cái)U(kuò)增出145bp的目的片段。
轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含外源蛋白VP1，經(jīng)ELISA和Western blot檢測(cè)其存在，陽(yáng)性對(duì)照為pROK轉(zhuǎn)化的植物抽提物中混有人工合成VP1的P135-160多肽(10ug/ml)，陰性對(duì)照為pROK轉(zhuǎn)化的植物抽提物。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中含有外源蛋白VP1，能夠與抗P135-160多肽血清發(fā)生明顯的反應(yīng)。在Western blot檢測(cè)中，用抗VP1的血清可檢測(cè)到特異性的條帶，分子量為30-150KDa得出與ELISA相同的檢測(cè)結(jié)果。
用ELISA和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物免疫小鼠后血清中抗FMDV抗體的存在，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠血清中含有抗FNDV抗體，具有特異性的抗P135-160多肽和FMDV的特性；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示用PROK.VP1轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因植物的抽提物免疫小鼠獲得的混合血清，同抗P135-160多肽血清一樣具有特異性的反應(yīng)帶。在0、21、35天用轉(zhuǎn)基因植物的抽提物免疫小鼠，第45天用含104ID50O型口蹄疫病毒攻毒，免疫小鼠的保護(hù)率為100％，而對(duì)照鼠則全部死亡。
權(quán)利要求
1.一種家畜口蹄疫病毒基因工程苗，其特征在于由病毒RNA反轉(zhuǎn)錄獲得并可編碼VP1蛋白的全DNA序列ACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCTGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGACCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCACCCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGGCGAGAGCCCCGTGACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTATTGGCTCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGCGCCATCAAAGCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCAAGCGAAGCTAGACACAAACAAAAGATTGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTG該序列是在包括植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子在內(nèi)的植物反應(yīng)器中形成的立體結(jié)構(gòu)之總和，其分子量為30-150KDa。
2.權(quán)利要求1所述的家畜口蹄疫病毒基因工程苗的制造方法，包括基因重組、重組蛋白的制備，其特征在于制造過(guò)程為(1)將VP1全基因插入質(zhì)粒載體采用分子生物學(xué)的方法提抽病毒的核酸RNA，用含啟動(dòng)子和終止子，其上游引物為5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反轉(zhuǎn)錄引物為5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’的特定引物擴(kuò)增出VP1的完整基因，片段兩端為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，用BamHⅠ酶切表達(dá)載體pROK1和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒pROK1.VP1，然后(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒pROK1.VP1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌C58C1菌株細(xì)胞系，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子，再(3)取種子種入土壤，獲得可作為疫苗的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種家畜口蹄疫病毒基因工程苗及其制造方法,工程苗是由病毒RNA反轉(zhuǎn)錄獲得并可編碼VP1蛋白的全DNA序列,是在包括植物的根莖葉和種子在內(nèi)的植物反應(yīng)器中形成的立體結(jié)構(gòu)的總和,分子量為30－150KD
文檔編號(hào)C12N15/83GK1319670SQ0111112
公開(kāi)日2001年10月31日 申請(qǐng)日期2001年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月17日
發(fā)明者鐘安清, 秦智鋒 申請(qǐng)人:深圳市三方圓信息技術(shù)有限公司