專利名稱：一種煙草蝕刻病毒蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因工程實(shí)踐中經(jīng)常使用融合表達(dá)進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)、生產(chǎn)。借助于融合蛋白或短肽的生化特征和性質(zhì)，融合表達(dá)能大大簡(jiǎn)化、方便產(chǎn)物的檢測(cè)，性質(zhì)研究和分離純化。因此目前在基因工程中，從原核表達(dá)體系(如大腸桿菌)到真核表達(dá)體系(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)都經(jīng)常采用融合表達(dá)方法進(jìn)行重組目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。但這同時(shí)也帶來了新的問題，即融合蛋白的特異性去除問題。當(dāng)重組蛋白質(zhì)作為基因工程藥品及其它一些用途時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物必須是像天然蛋白質(zhì)一樣的完整產(chǎn)物，而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表達(dá)產(chǎn)物必須進(jìn)行產(chǎn)物后加工即融合蛋白在體外實(shí)施特定氨基酸序列的切割或斷裂，才能獲得完整的目標(biāo)產(chǎn)物。目前最為常用的裂解方法為1.化學(xué)法用溴化氫斷裂；2.蛋白酶法用凝血酶，活化的X因子或腸激酶特異性裂解。由于溴化氰為劇毒化合物，而且其切割識(shí)別位點(diǎn)為Met，因此實(shí)用性不強(qiáng)。目前國(guó)際上最常用的工具蛋白酶為凝血酶(識(shí)別位點(diǎn)Leu-Val-Pro-Arg↓Gly--Ser)，因子Xa(識(shí)別位點(diǎn)Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓)和腸激酶(識(shí)別位點(diǎn)Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓)，其中腸激酶和Xa切割后的產(chǎn)物和天然產(chǎn)物完全一致，而凝血酶切割后的產(chǎn)物比天然產(chǎn)物分別多二個(gè)氨基酸。煙草蝕刻病毒蛋白酶(TEV蛋白酶)是煙草蝕刻病毒編碼的Nuclear Inclusion a(NIa)蛋白的分子量為27kD的催化亞基(Daros，et al.，1999)。TEV蛋白酶是一種新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)專一性的蛋白酶，它可以識(shí)別一個(gè)七個(gè)氨基酸的序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly，其中的幾個(gè)氨基酸Glu，Tyr，Gln和Gly是完成高效切割所必需的。切割發(fā)生在Gln和Gly之間，這樣會(huì)使得目標(biāo)蛋白的氨基端多一個(gè)Gly。TEV蛋白酶切割的最適溫度是34℃；但實(shí)際上，該酶在低至4℃的溫度都有較好的活性，而且使用條件廣泛、在很多蛋白酶抑制劑存在的都有活性(Daros et al.，1999；Phan et al.，2002；Mohanty et al.，2003)。因此，TEV蛋白酶是生產(chǎn)和研究重組蛋白時(shí)去除融合蛋白標(biāo)簽的理想選擇。
用基因工程方法生產(chǎn)以上這些工具蛋白酶已成為生物工程制藥業(yè)及基因工程研究人員的急需。這一點(diǎn)對(duì)國(guó)內(nèi)的生物工程制藥業(yè)及基因工程研究人員尤為重要，因?yàn)閲?guó)內(nèi)使用的這些工具蛋白酶全部來源于進(jìn)口。

發(fā)明內(nèi)容
TEV蛋白酶由于對(duì)于其識(shí)別序列的高度特異性、在多種蛋白酶抑制劑存在情況下仍然具有酶切活性和廣泛的使用條件，使其成為一種從重組蛋白中去除融合標(biāo)簽的理想的工具酶。很多研究者嘗試用重組DNA的方法從大腸桿菌中生產(chǎn)TEV蛋白酶(Kapust et al.，1999；Lucast，et al.，2001；Kapust et al.，2001)。已有的報(bào)道表明，TEV蛋白酶在大腸桿菌中過量表達(dá)的可溶性是非常低的。Lucast等在大腸桿菌中過量表達(dá)帶有His-tag的野生型和突變型的TEV蛋白酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超過95％的該蛋白存在于細(xì)胞裂解后的包涵體組分中。獲得高產(chǎn)量和有活性的蛋白酶必須經(jīng)過復(fù)雜的蛋白變復(fù)性過程(Lucast et al.，2001)。Kapust等的研究也表明幾乎所有的大腸桿菌表達(dá)的TEV蛋白酶都是以無活性的非可溶形式存在，可溶性的表達(dá)只有在TEV蛋白酶的N端加一個(gè)MBP蛋白的標(biāo)簽才能實(shí)現(xiàn)(Kapust et al.，1999)。
本發(fā)明專利需要解決的問題是在大腸桿菌中表達(dá)有生物活性的TEV蛋白酶，并通過其分離純化方法，獲得具有很好的切割融合蛋白的生物活性的TEV蛋白酶，達(dá)到和滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，為基因工程下游過程中重組融合蛋白質(zhì)的切割提供一個(gè)有效、價(jià)廉的工具酶。本發(fā)明具有重要的實(shí)用意義，尤其是對(duì)國(guó)內(nèi)的生物工程制藥業(yè)及基因工程研究人員具有重要的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到將TEV蛋白酶基因克隆在大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組TEV蛋白酶以可溶性形式表達(dá)?？扇苄缘闹亟MHis6-TEV蛋白酶經(jīng)過Ni2+親和層析柱的一步純化可以得到純度大于95％的His6-TEV，產(chǎn)量達(dá)到每升培養(yǎng)液35mg。重組His6-TEV具有很好的、位點(diǎn)特異性的蛋白酶活性。
本發(fā)明提供了一種方便可行地生產(chǎn)可溶性、具有生物活性的重組TEV蛋白酶的方法，建立了與之相應(yīng)的簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的純化工藝。本發(fā)明工藝生產(chǎn)的重組TEV蛋白酶為基因工程下游過程中重組融合蛋白質(zhì)的切割提供一個(gè)有效、價(jià)廉的工具酶。本發(fā)明具有重要的實(shí)用意義，尤其是對(duì)國(guó)內(nèi)的生物工程制藥業(yè)及基因工程研究人員具有重要的實(shí)用價(jià)值。。
同已有的重組TEV蛋白酶生產(chǎn)工藝相比，本發(fā)明的特色和創(chuàng)新之處在于(1)本發(fā)明在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了His6-TEV蛋白酶可溶性的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有很好的序列特異性的蛋白酶活性。
(2)本發(fā)明建立了利用Ni2+金屬親和層析一步純化His6-TEV蛋白酶的分離純化工藝，純化獲得的His6-TEV蛋白酶純度大于95％，產(chǎn)量達(dá)到每升培養(yǎng)液35mg。整個(gè)生產(chǎn)工藝方法簡(jiǎn)便、價(jià)廉，具有很好的適用性，推廣方便，適于生產(chǎn)。避免了以前在大腸桿菌中生產(chǎn)TEV蛋白酶時(shí)，由于表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，必須經(jīng)變復(fù)性處理才能獲得生物活性的煩瑣步驟。
本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌中表達(dá)和純化具有生物活性的TEV蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法簡(jiǎn)便、高產(chǎn)、低成本，不需要體外變復(fù)性過程即具有生物活性。生產(chǎn)的TEV蛋白酶具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拿盖刑禺愋?。這些優(yōu)點(diǎn)使得His6-TEV成為基因工程蛋白生產(chǎn)中一種高效而廉價(jià)的工具酶。
四

圖1重組His6-TEV的表達(dá)和純化SDS-PAGE1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，分子量分別為94、66、43、31、14kDa(自上而下)；2.非誘導(dǎo)的pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)菌株總蛋白；3.IPTG誘導(dǎo)的pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)菌株總蛋白；4.IPTG誘導(dǎo)的pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)菌株裂解上清；5.IPTG誘導(dǎo)的pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)菌株裂解沉淀；6.Ni2+親和層析柱純化的穿過峰；8.50mM PBS，pH8.0，50mM咪唑的洗脫峰；9.50mM PBS，pH8.0，250mM咪唑的洗脫峰。
圖2不同劑量重組His6-TEV酶切GST-EGFP蛋白的定量分析。
不同劑量的重組His6-TEV加入到14μg GST-EGEP中，30℃反應(yīng)12小時(shí)。所有的樣品經(jīng)12％SDS-PAGE分析，再根據(jù)軟件定量分析得到數(shù)據(jù)，作出His6-TEV酶切反應(yīng)的酶和底物濃度關(guān)系曲線。
圖3.重組His6-TEV酶切GST-EGFP蛋白的時(shí)間曲線動(dòng)力學(xué)分析。
1μg的重組His6-TEV加入到14μg GST-EGEP中，30℃反應(yīng)不同時(shí)間，所有的樣品經(jīng)12％SDS-PAGE分析，再根據(jù)軟件定量分析，作出His6-TEV酶切反應(yīng)的時(shí)間曲線。
圖4.重組His6-TEV酶切的酶動(dòng)力學(xué)分析。
0.6μg的重組His6-TEV加入到不同劑量的GST-EGEP中，30℃反應(yīng)12小時(shí)，所有的樣品經(jīng)12％SDS-PAGE分析，再根據(jù)軟件定量分析，作出重組His6-TEV酶切底物濃度與酶切效率關(guān)系曲線。同樣，采取雙倒數(shù)作圖法，計(jì)算Km和kcat。
圖5.重組His6-TEV和腸激酶對(duì)His6-L-TNF酶切的比較。
(A)重組His6-TEV的酶切效率的SDS-PAGE分析。
1.2μgHis6-TEV加入到14μg GST-EGEP中，30℃反應(yīng)不同時(shí)間(泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，自上而下分子量分別為94、66、43、31、14kDa；泳道2-7分別是0，0.5，1，2，4，6小時(shí))。所有的樣品通過濃度為12％的SDS-PAGE進(jìn)行分析。23kDa的His6-L-TNF融合蛋白經(jīng)過酶切以后產(chǎn)生分子量為18kDa的蛋白TNF(用實(shí)線箭頭指示)。
(B)重組腸激酶的酶切效率的SDS-PAGE分析。
重組EKL酶/底物＝1/10000(W/W))酶切20μg His6-EK-TNF不同時(shí)間(泳道1-7分別為0，0.5，1，2，3，4 and 6小時(shí))。實(shí)線箭頭指示完整的TNF蛋白質(zhì)條帶，虛線箭頭指示非特異性酶切產(chǎn)生的TNF條帶。
五具體實(shí)施例方式1.表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Hi s6-TEV和pALEX-GST-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建以含有TEV蛋白酶基因的質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增得到TEV的cDNA。PCR的引物如下primer 15’-tgtacatatgggagaaagcttgtttaagg-3’和primer 25’gatagtcgacttaattcatgagttgag-3’。引物中加框或下劃線的部分分別是酶切位點(diǎn)Nde I和Sal I。PCR的程序?yàn)?4℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共28個(gè)循環(huán)。由此得到的DNA片段經(jīng)過Nde I和Sal I的雙酶切插入到E.coli表達(dá)載體中pET28a(Novagen公司)中。
pET28a-His6-TEV質(zhì)粒的正確構(gòu)建通過雙酶切和測(cè)序得到確認(rèn)。
2.His6-TEV的表達(dá)和純化挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm振搖過夜。第二天按1∶100轉(zhuǎn)接到加有卡那霉素(50μg/ml)的新鮮LB培養(yǎng)基中，30℃250rpm振搖3-4小時(shí)，直到OD600約0.6，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，總誘導(dǎo)時(shí)間6小時(shí)后，6000rpm 5分鐘收獲菌體。來自1升培養(yǎng)基的總菌體重懸于50ml 50mM PBS，pH8.0，超聲30分鐘破碎細(xì)胞。12000g 20分鐘離心分離超聲上清。
His6-TEV的純化使用美國(guó)Sigma公司的Select TM HC Ni2+柱親和介質(zhì)進(jìn)行。首先將介質(zhì)用平衡緩沖液(50mM PBS，pH8.0，10mM咪唑)進(jìn)行平衡，然后將超聲上清上樣。上樣后再用平衡緩沖液(50mM PBS，pH8.0，10mM咪唑)洗至基線，最后用洗脫緩沖液(50mM PBS，pH8.0，250mM咪唑)進(jìn)行洗脫。洗脫峰組分中的咪唑通過超濾得以去除。最后純化得到的蛋白重溶于100mM Tris-HCl，pH 8.0，10％蔗糖(W/V)中，凍存于-70℃。
純化過程中所有組分的蛋白濃度采用BSA為標(biāo)準(zhǔn)品作為參照、用BCA試劑盒進(jìn)行定量，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE進(jìn)行分析。
3.His6-TEV的蛋白酶活力分析使用含有TEV酶切位點(diǎn)的GST-EGFP蛋白作為底物，對(duì)His6-TEV的酶切活力進(jìn)行了分析。
酶切效率分析為了定量分析His6-TEV的酶切效率，不同劑量(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，和0.8μg)的His6-TEV加入到含有14μg的30μl反應(yīng)體系中，30℃酶切12小時(shí)。
His6-TEV酶切的時(shí)間曲線1μg的His6-TEV加入到含有14μg融合蛋白的30μl酶切體系中，30℃分別反應(yīng)不同時(shí)間(分別為0，0.5，1，2，4，6，8，12和24小時(shí))。
His6-TEV的動(dòng)力學(xué)分析為了計(jì)算His6-TEV對(duì)于GST-EGFP的Km和kcat值，0.6μg His6-TEV加入到不同濃度的GST-EGFP(分別為1.4，5.6，11.2，16.8，22.4，28和33.6μg)中，30℃反應(yīng)1小時(shí)后，計(jì)算反應(yīng)掉的底物蛋白量。通過雙倒數(shù)作圖法計(jì)算His6-TEV對(duì)于GST-EGFP的Km和kcat值。
所有反應(yīng)的緩沖液都是50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5mM EDTA，1mM DTT，反應(yīng)體系30μl。所有的反應(yīng)產(chǎn)物通過12％的SDS-PAGE進(jìn)行分離和考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。染色后的膠應(yīng)用軟件Grab-it 2.5和Gelwork(UVP)進(jìn)行掃描和定量分析，再根據(jù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行之后的作圖。
pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)的表達(dá)菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，在SDS-PAGE約30kDa的位置出現(xiàn)一條明顯的誘導(dǎo)條帶，這個(gè)分子量與理論上His6-TEV的分子量一致。His6-TEV的表達(dá)量占整個(gè)菌體總蛋白的40％，而40％的His6-TEV表達(dá)產(chǎn)物存在于表達(dá)上清中。通過Ni2+柱親和層析的一步純化可以得到純度大于95％的His6-TEV，產(chǎn)量達(dá)到每升培養(yǎng)液35mg。
純化得到的His6-TEV對(duì)于底物蛋白GST-EGFP表現(xiàn)出了良好的切割活性和特異性。經(jīng)過30℃12小時(shí)的共同溫浴，His6-TEV可以切割大約20倍自身量的GST-EGFP蛋白，而且不會(huì)產(chǎn)生任何的非特異切割。His6-TEV的酶動(dòng)力學(xué)分析顯示在30℃下His6-TEV對(duì)于GST-EGFP的Km值為0.074mM，而kcat是0.02S-1。
His6-TEV對(duì)于含有TEV酶切位點(diǎn)的蛋白表現(xiàn)出通用的酶切活性，His6-TEV對(duì)于含有TEV酶切位點(diǎn)的GST-EGFP和His6-L-TNF都具有較好的酶切活性。
與現(xiàn)在生產(chǎn)上使用廣泛的商業(yè)化工具酶腸激酶相比，His6-TEV對(duì)于一些目標(biāo)蛋白的切割表現(xiàn)出更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奶禺愋?。我們將His6-TEV與腸激酶的酶切專一性進(jìn)行了比較。分別使用含有TEV識(shí)別位點(diǎn)和EK識(shí)別位點(diǎn)的His6-L-TNF作為底物，我們分析了兩種不同工具酶的酶切特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)。TEV的酶切只產(chǎn)生一條特異的TNF條帶；而EK的酶切時(shí)卻產(chǎn)生了一條除了完整TNF以外的非特異條帶。
權(quán)利要求
1.一種煙草蝕刻病毒蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法，其特征是在大腸桿菌中表達(dá)和純化一種可溶性、帶有組氨酸標(biāo)簽的煙草蝕刻病毒蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種煙草蝕刻病毒蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法，其特征是通過PCR方法構(gòu)建末端添加了組氨酸標(biāo)簽的煙草蝕刻病毒蛋白酶基因，將獲得的基因克隆在大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒中、表達(dá)有生物活性的、帶有組氨酸標(biāo)簽的煙草蝕刻病毒蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種煙草蝕刻病毒蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法，其特征是經(jīng)過Ni2+親和層析純化、制備獲得有生物活性的、帶有組氨酸標(biāo)簽的煙草蝕刻病毒蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種煙草蝕刻病毒蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法制備的煙草蝕刻病毒蛋白酶，其特征是能夠特異性地識(shí)別并切割含煙草蝕刻病毒蛋白酶切割位點(diǎn)的底物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種煙草蝕刻病毒蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法的應(yīng)用，其特征是生產(chǎn)和制備煙草蝕刻病毒蛋白酶作為工具蛋白酶用于蛋白質(zhì)多肽及重組融合蛋白質(zhì)的特異性斷裂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種煙草蝕刻病毒蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法生物工程制藥及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草蝕刻病毒蛋白酶的基因工程生產(chǎn)方法及其應(yīng)用在大腸桿菌中表達(dá)可溶性、帶有組氨酸標(biāo)簽的煙草蝕刻病毒蛋白酶，經(jīng)過Ni
文檔編號(hào)C12N15/09GK1844367SQ200610040178
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日
發(fā)明者華子春, 方雷 申請(qǐng)人:南京大學(xué)