專利名稱：采用重組大腸桿菌生產手性β－(R)－羥基丁酸的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物，發(fā)酵工程技術領域，特別涉及一種采用生物發(fā)酵法直接生產β-(R)-羥基丁酸的方法。
β-(R)-羥基丁酸可用化學合成并拆分或降解聚-β-(R)-羥基丁酸(PHB)得到。這兩種方法工藝復雜，生產成本較高。
本發(fā)明的目的在于為克服已有技術的不足之處提出采用重組大腸桿菌生產手性β-(R)-羥基丁酸的方法，通過構建帶有phbA和phbB基因的質粒并用此質粒轉化得到重組大腸桿菌，用該大腸桿菌進行發(fā)酵得到β-(R)-羥基丁酸。具有生產工藝簡化，生產污染低，產品成本低的優(yōu)點。
本發(fā)明提出一種生產β-(R)-羥基丁酸的方法，由構建的帶有phbA和phbB基因的質粒并用此質粒轉化得到重組大腸桿菌和發(fā)酵該重組大腸桿菌生產β-(R)-羥基丁酸組成，其特征在于所說的發(fā)酵過程包括(1)將基因phbA和phbB克隆到質粒中構建出新質粒。(2)將構建質粒轉到大腸桿菌中。(3)發(fā)酵該重組大腸桿菌獲取β-(R)-羥基丁酸。
本發(fā)明方法所說的質粒構建與傳統(tǒng)的質粒構建方法相同，包括將含基因phbA和phbB的DNA片段和所用的質粒進行相關酶切；利用連接酶進行連接；利用常規(guī)轉化手段進行質粒轉化及篩選。篩選出的含連接好的質粒的菌株即為所需發(fā)酵用的菌株。
本發(fā)明所用的發(fā)酵方法為常規(guī)的工業(yè)發(fā)酵方法，均可采用傳統(tǒng)微生物發(fā)酵的工藝設備。
本發(fā)明利用的是基因重組大腸桿菌直接發(fā)酵生產β-(R)-羥基丁酸，簡化了傳統(tǒng)化學合成對設備的復雜要求和工藝流程的繁瑣。省去了手性分離的復雜過程，并降低了由于化學合成和手性分離帶來的環(huán)境損害。并可能實現(xiàn)生產成本降低。
實施例用重組大腸桿菌發(fā)酵生產β-(R)-羥基丁酸菌種大腸桿菌E.coli HB101基因來源phbA和phbB來自菌種Ralstonia eutropha的基因組，基因片段連接在質粒pBHR68上。
(1)質粒構建用限制性內切酶Pst I酶切質粒pBHR68得到基因phbB和phbA。并將其插入到質粒pUC18的Pst I酶切位點。所得到的質粒pUCAB含有位于啟動子lac下游的基因phbB和phbA。
(2)質粒轉化用電轉化將質粒轉到菌株E.coli HB101中。篩選出的含連接好的質粒的菌株即為所需發(fā)酵用的重組大腸桿菌菌株。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)利用所得的基因重組菌發(fā)酵培養(yǎng)36-48小時后離心(4000g)得上清液，濃縮干燥后以氣相色譜檢測β-(R)-羥基丁酸，產量為1.2g/l。
培養(yǎng)基為0.5g/L硫酸銨，0.2g/L硫酸鎂，9.65g/L十二水磷酸氫二鈉，2.65g/L磷酸二氫鉀，60mg/L氨卞青霉素，50g/L葡萄糖和1ml/L微量元素?？傮w積約3L。
微量元素的配制1升1mol/L鹽酸中(g)20六水氯化鐵，10氯化鈣，0.03五水硫酸銅，0.05四水氯化錳，0.1七水硫酸鋅，pH 6.8。
權利要求
1.一種采用重組大腸桿菌生產手性β-(R)-羥基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將合成聚-β-(R)-羥基丁酸(PHB)的前體基因phbA和phbB克隆到質粒載體中構建出重組質粒；(2)將將含phbA和phbB基因的重組質粒轉到大腸桿菌中獲得重組大腸桿菌；(3)對該重組大腸桿菌發(fā)酵獲取β-(R)-羥基丁酸。
全文摘要
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物,發(fā)酵工程技術領域。包括以下步驟:(1)將合成聚－β－(R)－羥基丁酸(PHB)的前體基因phbA和phbB克隆到質粒載體中構建出重組質粒;(2)將將含phbA和phbB基因的重組質粒轉到大腸桿菌中獲得重組大腸桿菌;(3)對該重組大腸桿菌發(fā)酵獲取β－(R)－羥基丁酸。本發(fā)明生產工藝簡單,容易操作,開創(chuàng)了一種新型生物法生產β－(R)－羥基丁酸的道路。
文檔編號C12P7/42GK1357629SQ01118668
公開日2002年7月10日 申請日期2001年6月8日 優(yōu)先權日2001年6月8日
發(fā)明者陳國強, 席建忠, 吳瓊, 張廣 申請人:清華大學