專(zhuān)利名稱(chēng)：：出血性大腸桿菌o157重組疫苗的制作方法出血性大腸桿菌0157重組疫苗所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株，特別是涉及失去了致病能力但保留其特異免疫原性的出血性大腸桿菌0157基因工程重組疫苗菌株。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于所說(shuō)的出血性大腸桿菌0157疫苗、其生產(chǎn)方法及其在預(yù)防人出血性大腸桿菌0157感染和預(yù)防出血性大腸桿菌0157在反芻動(dòng)物消化道定居與繁殖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：出血性大腸桿菌(EHEC;是一種重要的新發(fā)食物源性人獸共患病病原菌。EHEC主要是通過(guò)被污染的食物進(jìn)入體內(nèi)，感染腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致被感染者的出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿路綜合癥(RileyLW,Wfl/,TheNewEnglandJournalofMedicine,308(12):681-685,1983;LevineMM,JournalofInfectiousDiseases,155:377-389,1987)。迄今，臨床上還沒(méi)有可甩的預(yù)防EHEC0157感染的疫苗。為了治療EHEC0157感染，目前主要是使用抗生素。然而，由于抗生素治療可導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道菌群失調(diào)和耐藥菌株的發(fā)生，而且某些抗生素會(huì)裂解細(xì)菌菌體而引起毒素釋放，以致引發(fā)更為嚴(yán)重的病理反應(yīng)，所以臨床上大多不主張使用抗生素治療，希望盡早找到一種能夠有效預(yù)防EHgC0157感染的疫苗。美國(guó)專(zhuān)利5，354，661號(hào)描述了抗出血性大腸桿菌0157:H7和大腸桿菌026:H11的單克隆抗體。美國(guó)專(zhuān)利6,410,024號(hào)描述了EHEC0157:H7毒素的抗原決定基，以及抗這種毒素的抗體及其作為治療和診斷制劑的應(yīng)用。美國(guó)專(zhuān)利6,365,723號(hào)公開(kāi)了基于EHEC0157:H7脂多糖O-側(cè)鏈抗原決定基的抗體及口服疫苗。美國(guó)專(zhuān)利6,291,435號(hào)公開(kāi)了含有單糖或多糖序列的組合物及其在降低EHEC毒力和治療EHEC感染中的應(yīng)用。美國(guó)專(zhuān)利6,485，卯2號(hào)公開(kāi)了使用噬菌體(例如V5)降低腸道內(nèi)EHEC0157水平的方法。美國(guó)專(zhuān)利6,383,496號(hào)描述了具有RpoS+表型和多基因突變的減毒傷寒沙門(mén)氏桿菌、其生產(chǎn)方法及其在疫苗制備中作為基因遞送載體的應(yīng)用。迄今，只有本發(fā)明人曾構(gòu)建了腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗(中國(guó)專(zhuān)利ZL03157537.4)。本發(fā)明人在腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗專(zhuān)利的基礎(chǔ)上，將突變后的無(wú)毒性的志賀毒素1(Stxl)和志賀毒素2(Stx2)突變體基因?qū)肷鲜鲆呙缇?，?gòu)建得到本發(fā)明的新的EHEC0157重組疫苗菌株，并實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該疫苗菌株具有良好的安全性和免疫保護(hù)作用，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提挺活的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株，其特征在于在腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登記號(hào)CGMCCNo.1015)的基礎(chǔ)上，導(dǎo)入了突變后的無(wú)毒性的志賀毒素突變體基因，從而進(jìn)一步提高了疫苗菌株的免疫原性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗是如中國(guó)專(zhuān)利號(hào)ZL03157537.4中所限定的疫苗菌株。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的志賀毒素基因是EHEC0157:H7基因組中的stxl和stx2基因。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的志賀毒素突變體基因是stxl和stx2基因的A亞基突變后的基因。，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)如上限定的疫苗菌株的方法，該方法包括-(1)擴(kuò)增得到EHEC0157:H7的stxl和stx2全基因及兩側(cè)的部分側(cè)翼序列，并將擴(kuò)增得到的基因片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；(2)分別對(duì)擴(kuò)增得到的stxl和stx2A亞基的毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)的堿基進(jìn)行點(diǎn)突變，使之喪失細(xì)胞毒性，并將突變后的突變體序列分別克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；(3)用步驟(2)得到的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(4)對(duì)步驟(3)得到的重組細(xì)胞培養(yǎng)物上清進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，篩選出喪失了細(xì)胞毒性的stxl和stx2突變體序列；(5)用步驟(4)得到的攜帶有無(wú)毒性的stxl和stx2突變體序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)5化到腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗，得到本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中步驟(2)中所說(shuō)的喪失了細(xì)胞毒性的Stxl突變體序列是第167位的谷氨酸突變成天冬氨酸(E167D)，第170位的精氨酸突變成亮氨酸(R170U，第231位的丙氨酸突變成天冬氨酸(A231D)和第234位的甘氨酸突變成谷氨酸(G234E)。并且其中所說(shuō)的喪失了細(xì)胞毒性的Stx2突變體序列是第166位的谷氨酸突變成天冬氨酸(E166D)，第219位的丙氨酸突變成天冬氨酸(A219D)和第232位的甘氨酸突變成谷氨酸(G232E)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于免疫接種人以預(yù)防EHEC0157感染或免疫接種反芻動(dòng)物以阻止EHEC0157在消化道定居與繁殖的疫苗組合物，所說(shuō)的疫苗組合物含有如上限定的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的疫苗組合物還可含有一種或多種包括但不限于弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑在內(nèi)的免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明提供出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株，特別是提供失去了致病能力但保留有特異免疫原性的出血性大腸桿菌0157基因工程重組致弱疫苗菌株。本發(fā)明進(jìn)一步提供基于所說(shuō)的出血性大腸桿菌0157重組疫苗、其生產(chǎn)方法及其在預(yù)防人出血性大腸桿菌0157感染或免疫接種反芻動(dòng)物以阻止EHEC0157在消化道定居與繁殖中的應(yīng)用。作為一種活的重組疫苗株，應(yīng)該在弱毒性和免疫原性這兩者間保持平衡。也就是說(shuō)，這樣的疫苗株不應(yīng)在正常宿主體內(nèi)引發(fā)任何疾病或損傷，同時(shí)被接種后又能夠在機(jī)體內(nèi)定居并發(fā)揮免疫原活性。'本發(fā)明人在腸出血性大腸桿菌O157基因缺失疫苗(中國(guó)專(zhuān)利ZL03157537.4)菌株(保藏登記號(hào)CGMCCNo.1015)的基礎(chǔ)上，成功地構(gòu)建了保有這種平衡的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株。本發(fā)明的疫苗菌株是在腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株的基礎(chǔ)上，導(dǎo)入喪失了細(xì)胞毒性的stxl和stx2突變體基因。我們的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，本發(fā)明的0157重組疫苗菌株確實(shí)失去了對(duì)正常功能性細(xì)胞和活體動(dòng)物模型的致病性，并且具有預(yù)防野生型EHEC0157感染的免疫原性，并對(duì)模型小鼠具有良好的免疫保護(hù)作用。在制備本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗的實(shí)踐中，本發(fā)明人在以前成功地構(gòu)建了腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登記號(hào)CGMCCNo.1015)的基礎(chǔ)上，確定以忐賀毒素stx基因?yàn)閷?duì)象，對(duì)stxl和stx2的基因進(jìn)行點(diǎn)突變，然后篩選出喪失了細(xì)胞毒性的Stxl和Stx2突變體，并將無(wú)毒性的stxl和stx2突變體基因?qū)肽c出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株，從而得到喪失了致病性但保留有足夠免疫原性的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株。簡(jiǎn)單地說(shuō)，為本發(fā)明的目的，本發(fā)明人f先以腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登記號(hào)CGMCCNo.1015)(參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利ZL03157537.4)為基礎(chǔ)，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法從EHEC0157:H7野生強(qiáng)毒菌株EDL933中分別擴(kuò)增出stxl和stx2的全基因及其旁側(cè)序列，并對(duì)編碼stxl和stx2的基因進(jìn)行點(diǎn)突變，然后將突變后得到的stxl和stx2突變體基因克隆到質(zhì)粒pUC18中，并將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌(大腸桿菌DH5a)內(nèi)。然后利用vero細(xì)胞對(duì)攜帶stxl和stx2突變體基因的重組菌株進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，以篩選到喪失了細(xì)胞毒性的stxl和stx2突變體基因。將攜帶喪失了細(xì)胞毒性作用的stxl和stx2突變體基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株內(nèi)，使帶有該重組質(zhì)粒的0157重組菌株能表達(dá)喪失了細(xì)胞毒性的志賀毒素，以增強(qiáng)0157疫苗菌株的免疫原性，從而構(gòu)建出本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株。然后，再利用vero細(xì)胞和小鼠模型對(duì)本發(fā)明疫苗菌株的安全性、免疫原性和免疫保護(hù)作用進(jìn)行了深入研究。結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗具有良好的安全性和免疫原性，并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(小鼠)具有良好的免疫保護(hù)作用(參見(jiàn)實(shí)施例4-8)。'因此，本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)從EHEC0157:H7基因組中擴(kuò)增得到stxl和stx2全基因及旁側(cè)序列，并將其克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；(2)對(duì)stxl和stx2中的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變；(3)將步驟(2)得到的stxl和stx2突變體基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；(4)用步驟(3)得到的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并利用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)篩7選喪失了細(xì)胞毒性的Stxl和Stx2突變體；(5)將攜帶有stxl和stx2無(wú)毒性突變體序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株；(6)利用vero細(xì)胞檢測(cè)步驟(5)的重組菌株的細(xì)胞毒性；(7)利用小鼠模型檢測(cè)步驟(5)的重組菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的安全性和免疫保護(hù)作用。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中stxl全序列包括A亞基上游S13bp至B亞基下游665bp，共2705bp。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的stx2全序列包括A亞基上游925bp至B亞基下游232bp，共2402bp。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中stxl和stx2中突變的堿基是編碼毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株是如中國(guó)專(zhuān)利ZL03157537.4中所限定的、具有保藏登記號(hào)CGMCCNo.1015的菌株。具體地說(shuō)，通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，在Stx的A亞基中有兩個(gè)高度保守的區(qū)域。一個(gè)位于毒素的毒性活性區(qū)，另一個(gè)位于毒素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)保守區(qū)域的突變，可能消除毒素的毒性，但保留完全的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)即在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)Stxl和Stx2的A亞基上這兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的堿基進(jìn)行點(diǎn)突變，并針對(duì)Stx及其突變體的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究。首先進(jìn)行stxl及其突變體基因的克隆。根據(jù)EHEC0157:H7基因組上stxl序列及側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物。其中引物FSZ34cggaattctgtatactgcatggtgcc(SEQIDNO:5)和FSZ35gaattccatatgcagtgctgtgacgatgatg(SEQIDNO:6)用于擴(kuò)增stxl全序列。引物FSZ36actgtgacagctcaagctttactttttcggca(SEQIDNO:7)和FSZ37tgccgaaaaagtaaagcttgagctgtcacagt(SEQIDNO:8)位于stxlA亞基的毒性活性區(qū)，這一對(duì)引物能夠互補(bǔ)配對(duì)，并在其中引入了兩個(gè)突變堿基。引物FSZ38taatgccacgctctcgaggatatcattaatgcttc(SEQIDNO:9)和FSZ39gaagcattaatgatatcctcgagagcgtggcatta(SEQIDNO:10)位于stxlA亞基的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)，這一對(duì)引物能互補(bǔ)配對(duì)，并在其中引入了兩個(gè)突變堿基。用引物FSZ34(SEQIDNO:5)禾[JFSZ35(SEQIDNO:6)從EDL933菌株的基因組中PCR擴(kuò)增出stxl全基因及側(cè)翼片段的DNA序列，將其克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel/Xbal位點(diǎn)之間，以構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pSTXl;用引物FSZ36(SEQIDNO:7)禾卩FSZ37(SEQIDNO:8)對(duì)stxl基因毒性活性區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，并將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel/Xbal位點(diǎn)之間，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSTXl.l;用引物FSZ38(SEQIDNO:9)禾nFSZ39(SEQIDNO:10)對(duì)stxl基因跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，并將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel/Xbal位點(diǎn)之間，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSTX1.2。然后，再用上述引物對(duì)stxl基因的毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)同時(shí)進(jìn)行點(diǎn)突變，將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUCl8的Ndel/Xbal位點(diǎn)之間，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSTXl.3。然后進(jìn)行stx2及其突變體基因的克隆。根據(jù)EHEC0157:H7基因組上stx2全序列及側(cè)翼DNA序列設(shè)計(jì)引物。引物FSZ31cgggatccttcacaaagcggagggga(SEQIDNO:3)和FSZ32cggaattctgtatactgcatggtgcc(SEQIDNO:4)用于擴(kuò)增stx2全序列。引物FSZ26gcgtaaggcgtctgctgtg(SEQIDNO:1)和FSZ27cacagcagacgccttacgc(DEQIDNO:2)位于stx2A亞基的毒性活性區(qū)，這一對(duì)引物能夠互補(bǔ)配對(duì)，并在其中引入了:兩個(gè)突變堿基。引物FSZ40taatatatcagacatactggagactgtggc(SEQIDNO:11)禾QFSZ41gccacagtctccagtatgtctgatatatta(SEQIDNO:12)位于stx2A亞基的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)，這一對(duì)引物能夠互補(bǔ)配對(duì)，并在其中引入了兩個(gè)突變堿基。使用引物FSZ31(SEQIDNO:3)和FSZ32(SEQIDNO:4)從EDL933菌株基因組中擴(kuò)增出stx2全基因及側(cè)翼片段的DNA序列，并將其克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSTX2;用引物FSZ26(SEQIDNO:1)和FSZ27(SEQIDNO:2)對(duì)stx2基因的毒性活性區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，并將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSTX2.1;用引物FSZ40(SEQIDNO:11)禾卩FSZ41(SEQIDNO:12)對(duì)stx2基因的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，并將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSTX2.2;再使用上述引物對(duì)stx2基因的毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)同時(shí)進(jìn)行點(diǎn)突變，將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSTX2.3。9然后，將上述擴(kuò)增到的Stxl毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)突變片段以及Stx2毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)突變片段分別克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel/Xbal和BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建出同時(shí)含有stxl和stx2突變基因片段的重組質(zhì)粒pSTX1.3-STX2.3。在最終構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSTX1.3-STX2.3中，Stxl毒性活性區(qū)第167位的谷氨酸突變成天冬氨酸(E167D)，第170位的精氨酸突變成亮氨酸(R170L);跨膜區(qū)第231位的丙氨酸突變成天冬氨酸(A231D)，第234位的甘氨酸突變成谷氨酸(G234E)。Stx2毒性活性區(qū)第166位的谷氨酸突變成天冬氨酸(E166D);跨膜區(qū)第219位的丙氨酸突變成天冬氨酸(A219D)，第232位的甘氨酸突變成谷氨酸(G232E)。然后將帶有志賀毒素突變體基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中。由于我們克隆的Stxl和Stx2序列上游包含志賀毒素表達(dá)所需的調(diào)控序列，所以在將毒素基因及其突變體基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，毒素及其突變體基因能夠利用自身的表達(dá)調(diào)控元件來(lái)啟動(dòng)毒素基因或突變體基因的表達(dá)，以盡可能表達(dá)出具有天然結(jié)構(gòu)的志賀毒素及其突變體，使之具有天然的構(gòu)象和免疫原性。由于利用了志賀毒素自身的表達(dá)調(diào)控元件，并以大腸桿菌作為宿主，因此可與在出血性大腸桿菌中一樣將所表達(dá)的毒素分泌到細(xì)菌培養(yǎng)液中。然后，利用vero細(xì)胞作為靶細(xì)胞，檢測(cè)野生型志賀毒素及其突變體對(duì)vero細(xì)胞的毒性作用。將帶有志賀毒素或其突變體序列的重組菌株培養(yǎng)以后，過(guò)濾分離細(xì)菌培養(yǎng)物上清，并使用經(jīng)過(guò)相同處理的大腸桿菌DH5a培養(yǎng)物上清作為對(duì)照，檢測(cè)志賀毒素及其突變體的細(xì)胞毒性作用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將過(guò)濾后的細(xì)菌培養(yǎng)物上清按IO倍梯度稀釋后，加入到培養(yǎng)好的vero細(xì)胞中，檢測(cè)并按下面公式計(jì)算野生型志賀毒素或其突變體對(duì)vero細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。抑制率=(對(duì)照組OD值一實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值\100%重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次后，繪制出野生型Stxl、Stx2及其突變體對(duì)vero細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制曲線，并比較志賀毒素不同突變體對(duì)vero細(xì)胞的毒性，觀察志賀毒素突變后的毒性變化。結(jié)果表明相對(duì)于未突變的Stxl，突變體Stxl.l和Stxl.3的毒性下降明顯，約下降了1000倍，可以認(rèn)為己基本消除了細(xì)胞毒性；而相對(duì)于未突變的Stx2，突變體Stx2.1、Stx2.2和Stx2.3的毒性也都明顯下降，其中Stx2.3毒性下降最大，故可以認(rèn)為已完全消除了細(xì)胞毒性。將帶有已消除了毒性作用的stxl和stx2突變體基因的重組質(zhì)粒pSTX1.3-STX2.3轉(zhuǎn)入我們以前構(gòu)建的腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登記號(hào):CGMCCNo.1015;中國(guó)專(zhuān)利號(hào)ZL03157537.4)中，構(gòu)建出本發(fā)明的目的菌株出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株。按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，本發(fā)明人已于2008年6月16日，將本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株(命名為0157-AM934,分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌￡^/'^/^^^//)保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登記號(hào)為CGMCCNo.2539。為了評(píng)價(jià)本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的安全性和免疫原性，分別對(duì)其生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性進(jìn)行了下述實(shí)驗(yàn)研究。1、Vero細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)將EHEC0157:H7EDL933和出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的培養(yǎng)物上清過(guò)濾后，按前述細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)這兩個(gè)菌株培養(yǎng)物上清對(duì)vero細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并對(duì)這兩個(gè)菌株對(duì)vero細(xì)胞的毒性作用進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，EHEC0157:H7野生型強(qiáng)毒菌株EDL933對(duì)vero細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性作用，本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株基本喪失了對(duì)vero細(xì)胞的毒性作用。2、出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在LB中連續(xù)傳代培養(yǎng)本發(fā)明的疫苗菌株，傳代的過(guò)程中不使用抗生素，以檢驗(yàn)在沒(méi)有抗生素壓力的情況下，重組質(zhì)粒在疫苗菌株中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在無(wú)抗生素壓力的情況下，本發(fā)明的疫苗菌株傳10代以內(nèi)，具有良好的穩(wěn)定性。3、出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的安全性實(shí)驗(yàn)將離乳小鼠隨機(jī)分為2組，分別灌胃接種EHEC0157:H7EDL933(作為對(duì)照組)和本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株，接種劑量均為4xl(^CFU/只。同時(shí)對(duì)小鼠腹腔注射絲裂霉素(2.5mg/kg體重)。觀察并記錄小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果表明，接種本發(fā)明疫苗菌株的實(shí)驗(yàn)組小鼠生長(zhǎng)正常，無(wú)可見(jiàn)的臨床癥狀;接種野生型強(qiáng)毒株0157:H7EDL933的對(duì)照組小鼠體重迅速減輕，4天內(nèi)8只小鼠全部死亡。此結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株喪失了對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的致病性，具有良好的安全性。4、出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株免疫后的小鼠排菌實(shí)驗(yàn)將20只昆明鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和本發(fā)明出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株免疫組。免疫14天后用強(qiáng)毒株EHEC0157:H7EDL933進(jìn)行灌胃攻毒，然后每天檢測(cè)小鼠糞便中的排菌情況。結(jié)果可見(jiàn)，用生理鹽水的空白對(duì)照組小鼠，直到攻毒后13天還可檢測(cè)到糞便中仍然有EHEC0157:H7EDL933。而免疫組小鼠攻毒后第6天，從免疫組小鼠糞便中則檢測(cè)不到EHEC0157:H7EDL933排出。說(shuō)明本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株免疫后，可有效縮短強(qiáng)毒菌株在動(dòng)物腸道內(nèi)的定居時(shí)間。5、出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的被動(dòng)免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)(母源抗體對(duì)乳鼠的保護(hù)性)將體重約28g的母鼠40只隨機(jī)分為未免疫空白對(duì)照組和本發(fā)明疫苗菌株免疫組。首次免疫7天后，將公鼠與母鼠混養(yǎng)交配。再過(guò)7天，對(duì)母鼠加強(qiáng)免疫l次。第2次免疫后大約2周，將懷孕即將分娩的母鼠分籠喂養(yǎng)。母鼠分娩后，對(duì)所生的7日齡乳鼠以強(qiáng)毒菌株EHEC0157:H7EDL933進(jìn)行灌胃攻毒。記錄小鼠死亡情況，以評(píng)價(jià)疫苗菌株免疫保護(hù)效果。結(jié)果可見(jiàn)，接受強(qiáng)毒菌株攻擊的乳鼠從第3天開(kāi)始死亡。未免疫對(duì)照組母鼠所生乳鼠的存活率只有16.8%，而免疫組母鼠所生乳鼠的存活率為83.0%。表明本發(fā)明疫苗菌株免疫母鼠后，戶萬(wàn)生的乳鼠能夠從吸晚母乳時(shí)獲得母源抗體，從而使乳鼠獲得較好的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。以上對(duì)本發(fā)明出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的穩(wěn)定性、安全性、細(xì)胞毒性和對(duì)強(qiáng)毒菌株在小鼠腸道定居時(shí)間的影響，以及用乳鼠進(jìn)行的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以充分證實(shí)本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株具有良好的穩(wěn)定性、安全性和免疫原性，并具有良好的兔疫保護(hù)作用。本發(fā)明的重組菌株完全可以作為一種疫苗菌株，用于生產(chǎn)針對(duì)出血性大腸桿菌0157感染的免疫預(yù)防制劑。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了免疫接種人以預(yù)防EHEC0157感染或免疫接種反芻動(dòng)物以阻止EHEC0157在消化道定居與繁殖的疫苗組合物。所說(shuō)的疫苗組合物含有如上限定的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。12根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株是在我們以前發(fā)明的腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登記號(hào):CGMCCNo.1015)(中國(guó)專(zhuān)利號(hào)ZL03157537.4)的基礎(chǔ)上，導(dǎo)入喪失了細(xì)胞毒性的stxl和stx2突變體基因后得到的重組菌株。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的疫苗組合物還可含有一種或多種免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。其中所說(shuō)的免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑包括但不只限于弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供預(yù)防人EHEC0157感染或免疫接種反芻動(dòng)物以阻止EHEC0157在消化道定居與繁殖的方法，該方法包括給所說(shuō)的反芻動(dòng)物投用預(yù)防有效量如上限定的疫苗組合物?？梢允褂靡呙缟a(chǎn)領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，將本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株原液或其稀釋液與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑混合，并根據(jù)需要制成適于口服或非口服途徑給藥的單位計(jì)量形式的疫苗組合物。適于胃腸道外給藥的制劑可含有無(wú)菌水或鹽水、聚乙二醇、油等常用的賦形劑。特別是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作為賦形劑，制備本發(fā)明疫苗組合物的緩釋制劑。具體地說(shuō)，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素等賦形劑，淀粉、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈣和結(jié)晶纖維素等崩解劑，硬脂酸鎂和滑石等潤(rùn)滑劑，明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素和羥丙基纖維素等黏結(jié)劑，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性劑，以及著色劑、矯味劑、香料、分散劑等輔助成分，以常規(guī)方法制備片劑或膠囊形式的疫苗組合物?；蛘?，可以使用水、生理鹽水、植物油'(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶劑，氯化鈉和葡萄糖等等滲劑，苯酚、甲酚、對(duì)位羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐劑，抗壞血酸和焦磷酸鈉等抗氧化劑，以常規(guī)方法制備可注射形式的疫苗組合物。為了改善本發(fā)明疫苗組合物的熱穩(wěn)定性和有效儲(chǔ)存期限，可以將細(xì)菌原液或其稀釋液按適當(dāng)比例與疫苗保護(hù)劑或穩(wěn)定劑混合，然后凍干，制成本發(fā)明疫苗組合物的凍干制劑。其中所說(shuō)的保護(hù)劑或穩(wěn)定劑可以由人血清白蛋白或明膠、海藻糖、谷氨酸鈉、尿素以及山梨醇和/或甘露醇等成分組成。為了提高本發(fā)明疫苗組合物的免疫接種效果，可以在組合物中加入一種或多種免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。所說(shuō)的免疫增強(qiáng)或免疫調(diào)節(jié)劑包括但不只限于弗氏完全或不完全佐劑。下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:志賀毒素(StX)全基因及其突變體基因的擴(kuò)增與克隆首先進(jìn)行stxl全基因及其突變基因的克隆。根據(jù)已報(bào)道的EHEC0157:H7EDL933基因組上stxl的全序列及其兩側(cè)翼DNA序列設(shè)計(jì)引物。弓l物FSZ34(SEQNO:5)和FSZ35(SEQNO:6)分別位于擴(kuò)增目的序列的5'端和3，端，用于擴(kuò)增stxl全序列。引物FSZ36(SEQNO:7)和FSZ37(SEQNO:8)位于stxlA亞基的毒性活性區(qū)，這兩條引物能夠互補(bǔ)配對(duì)，并在其中引入了兩個(gè)突變堿基。引物FSZ38(SEQNO:9)禾口FSZ39(SEQNO:10)位于stxlA亞基的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)，這兩條引物也能夠互補(bǔ)配對(duì)，并在其中引入了兩個(gè)突變堿基。用引物FSZ34(SEQNO:5)禾QFSZ35(SEQNO:6)從EDL933菌株基因組中以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增出包含stxl全基因及側(cè)翼序列的DNA片段，將之克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel和Xbal位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTXl;用引物FSZ36(SEQNO:7)和FSZ37(SEQNO:8)對(duì)stxl基因毒性活性區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel/Xbal位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTXl.l;用引物FSZ38(SEQNO:9)禾口FSZ39(SEQNO:10)對(duì)stxl基因跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel/Xbal位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTX1.2;再用上述引物對(duì)stxl基因的毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)同時(shí)進(jìn)行突變，將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel/Xbal位點(diǎn)之間構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTX1.3。然后進(jìn)行stx2全基因及其突變基因的克隆。根據(jù)已報(bào)道的EHEC0157:H7EDL933基因組上stx2的全序列及其兩側(cè)翼DNA序列設(shè)計(jì)引物。弓l物FSZ3114(SEQNO:3)和FSZ32(SEQNO:4)分別位于擴(kuò)增目的序列的5'端和3，端，用于擴(kuò)增stx2全序列。弓I物FSZ26(SEQNO:1)禾卩FSZ27(SEQNO:2)位于stx2A亞基的毒性活性區(qū)，這兩條引物能夠互補(bǔ)配對(duì)，并在其中引入了兩個(gè)突變堿基。弓I物FSZ40(SEQNO:11)和FSZ41(SEQNO:12)位于stx2A亞基的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)，這兩條引物能夠互補(bǔ)配對(duì)，并在其中引入了兩個(gè)突變堿基。用引物FSZ31(SEQNO:3)和FSZ32(SEQNO:4)從EDL933菌株基因組中以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增出包含stx2全基因及側(cè)翼序列的DNA片段，將之克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTX2;用引物FSZ26(SEQNO:1)禾PFSZ27(SEQNO:2)對(duì)stx2基因毒性活性區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTX2.1;用引物FSZ40(SEQNO:11)禾QFSZ41(SEQNO:12)對(duì)stx2基因跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTX2.2;再用上述引物對(duì)stx2基因的毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)同時(shí)進(jìn)行突變，將突變后的片段克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTX2.3。然后，將上述擴(kuò)增到的stxl毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)突變片段以及stx2毒性活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)突變片段分別克隆到質(zhì)粒pUC18的Ndel/Xbal和BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建出同時(shí)含有stxl和stx2突變基因片段的重組質(zhì)粒pSTX1.3-STX2.3。在構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSTX1.3-STX2.3中，Stxl毒性活性區(qū)第167位的谷氨酸突變成天冬氨酸(E167D)，第170位的精氨酸突變成亮氨酸(R170L);跨膜區(qū)第231位的丙氨酸突變成天冬氨酸(A231D)，第234位的甘氨酸突變成谷氨酸(G234E)。Stx2毒性活性區(qū)第166位的谷氨酸突變成天冬氨酸(E166D);跨膜區(qū)第219位的丙氨酸突變成天冬氨酸(A219D)，第232位的甘氨酸突變成谷氨酸(G232E)。實(shí)施例2:志賀毒素(Stx)無(wú)毒性突變體的制備、篩選與鑒定將帶有stxl和stx2不同突變體序列的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ot感受態(tài)細(xì)胞中。由于我們克隆的Stxl和Stx2序列上游包含志賀毒素表達(dá)所需的調(diào)控序列，目的是在將毒素基因及其突變體基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，能利用其自身的表達(dá)調(diào)控元件來(lái)啟動(dòng)毒素基因或突變體基因的表達(dá)，以盡可能表達(dá)出具有天然結(jié)構(gòu)的志賀毒素及其突變體，使其具有天然的構(gòu)象和免疫原性。由于利用了志賀毒素自身的表達(dá)調(diào)控元件，并以大腸桿菌作為宿主，因此可與在出血性大腸桿菌中一樣將所表達(dá)的毒素分泌到細(xì)菌培養(yǎng)液中。然后利用vero細(xì)胞作為靶細(xì)胞，檢測(cè)分別攜帶stxl和stx2不同突變體重組菌株的細(xì)胞毒性作用。將重組菌株接種到5mLLB培養(yǎng)基中于37'C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后用0.22pm濾膜過(guò)濾細(xì)菌培養(yǎng)物上清。以經(jīng)過(guò)相同處理的DH5a培養(yǎng)上清濾液作為對(duì)照。將細(xì)菌培養(yǎng)物上清過(guò)濾后按10倍梯度稀釋加入到培養(yǎng)好的vero細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。首先在顯微鏡下觀察細(xì)胞。然后倒掉培養(yǎng)液，用PBS輕輕沖洗3次，在各孔中分別加入100^1結(jié)晶紫染色液常規(guī)染色并脫色(33%醋酸溶液)后，于570nm波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，按下面公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率=(對(duì)照組OD值一實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值><100%重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次后繪制出野生型Stxl、Stx2及其突變體對(duì)vero細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制曲線，比較不同毒素突變體對(duì)vero細(xì)胞的毒性，觀察志賀毒素突變后的毒性變化。結(jié)果表明，相對(duì)于未突變的Stxl，突變體Stxl.l和Stxl.3毒性下降明顯，約降低了1000倍，可以認(rèn)為基本消除了細(xì)胞毒性。而相對(duì)于未突變的Stx2，突變體Stx2.1、Stx2.2和Stx2.3的毒性均有明顯下降，其中Stx2.3毒性下降最大，可以認(rèn)為已完全消除了細(xì)胞毒性。實(shí)施例3:出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的構(gòu)建將帶有己消除了毒性作用的stxl和stx2突變體序列的重組質(zhì)粒pSTX1.3-8丁乂2.3轉(zhuǎn)入本實(shí)驗(yàn)室以前構(gòu)建的腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登記號(hào)CGMCCNo.1015;中國(guó)專(zhuān)利號(hào)ZL03157537.4)，構(gòu)建得到本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株。申請(qǐng)人已按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于2008年6月16日將本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登記號(hào)為CGMCCNo.2539。實(shí)施例4:出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)將EHEC0157:H7EDL933和本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的細(xì)菌培養(yǎng)物上清過(guò)濾后，以大腸桿菌DH5a培養(yǎng)上清濾液為對(duì)照，按前述細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法繪制這兩個(gè)菌株培養(yǎng)上清對(duì)vero細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制曲線，對(duì)這兩株菌對(duì)vero細(xì)胞的毒性作用進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，EHEC0157:H7野生型強(qiáng)毒菌株EDL933對(duì)vero細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性作用，本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株基本喪失了對(duì)vero細(xì)胞的毒性作用。實(shí)施例5:出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將本發(fā)明的疫苗菌株在LB中連續(xù)傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的過(guò)程中不使用抗生素，以檢驗(yàn)在沒(méi)有抗生素壓力的情況下，重組質(zhì)粒在疫苗菌株中的穩(wěn)定性。每傳IO代后，將傳代培養(yǎng)物倍比稀釋后鋪于無(wú)抗性的LB瓊脂平板上。然后從平板中挑取單個(gè)菌落，接種于加了氨芐青毒素的LB瓊脂平板中，同時(shí)對(duì)每個(gè)菌落點(diǎn)樣位置進(jìn)行標(biāo)記。由于丟失了重組質(zhì)粒的菌株沒(méi)有氨芐青毒素抗性，所以在含氨芐青毒素的LB瓊脂平板上不能生長(zhǎng)；而沒(méi)丟失重組質(zhì)粒的菌株則能夠生長(zhǎng)，從而得以分析重組質(zhì)粒在出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株中的穩(wěn)定性。每次挑取100個(gè)菌落進(jìn)行接種，記錄在含氨芐青毒素的LB瓊脂平板上能生長(zhǎng)的菌落數(shù)，并計(jì)算攜帶重組質(zhì)粒的菌落的百分比。結(jié)果表明，在無(wú)抗生素壓力的情況下，本發(fā)明的疫苗菌株傳10代以內(nèi)，具有良好的穩(wěn)定性。實(shí)施例6:出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的安全性實(shí)驗(yàn)將14-18日齡、體重約10-12g的離乳小鼠隨機(jī)分為2組。分別灌胃接種EHEC0157:H7EDL933(作為對(duì)照組)和本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株，接種劑量均為4xl09CFU/只。同時(shí)對(duì)小鼠腹腔注射絲裂霉素(2.5mg/kg體重)。每天觀察并記錄小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果表明，接種本發(fā)明雍苗菌株的實(shí)驗(yàn)組小鼠生長(zhǎng)正常，無(wú)可見(jiàn)臨床癥狀；17接種野生型強(qiáng)毒株0157:H7EDL933的對(duì)照組小鼠體重迅速減輕，4天內(nèi)小鼠全部死亡。證實(shí)本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株喪失了對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的致病性，具有良好的安全性。實(shí)施例7:出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株免疫后的小鼠排菌實(shí)驗(yàn)20只20g左右的昆明鼠，隨機(jī)分為2組空白對(duì)照組(以相同劑量生理鹽水進(jìn)行灌胃)和本發(fā)明出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株免疫組。免疫14天后用強(qiáng)毒株EHEC0157:H7EDL933進(jìn)行灌胃攻毒，攻毒劑量為5xl(^CFU/只。然后每天無(wú)菌采集小鼠新鮮辨便，lg糞便加入10mL生理鹽水，充分振蕩分散混勻，4。C靜置30分鐘，倍比稀釋后于LB(Na150pg/mL)瓊脂平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定并記錄免疫組和對(duì)照組的平均排菌情況。結(jié)果表明，用生理鹽水的未免疫對(duì)照組小鼠，直到攻毒后13天還可檢測(cè)到糞便中仍然有EHEC0157:H7,EDL933，而免疫組小鼠攻毒后第6天，從糞便中即檢測(cè)不到EHEC0157:H7EDL933，說(shuō)明本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株免疫后，可有效縮短強(qiáng)毒菌株在動(dòng)物腸道內(nèi)的定居時(shí)間。牛、羊等反芻動(dòng)物是EHEC0157的主要攜帶者，也是EHEC0157傳播感染人類(lèi)的主要傳染源。因此，從流行病學(xué)角度考慮，完全可以用本發(fā)明的疫苗對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，以減少細(xì)菌在動(dòng)物腸道內(nèi)的定居數(shù)量或縮短細(xì)菌在動(dòng)物腸道內(nèi)的定居時(shí)間。從而可以直接在食物源頭上控制EHEC0157感染的發(fā)生。實(shí)施例8:出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的被動(dòng)免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)將28g左右的母鼠40只，隨機(jī)分為2組未免疫空白對(duì)照組(以相同劑量的生理鹽水灌胃)和本發(fā)明疫苗菌株免疫組,(免疫劑量約l(^CFU/只小鼠)。首次免疫7天后，將公鼠與母鼠混養(yǎng)交配。再過(guò)7天，對(duì)母鼠加強(qiáng)免疫l次。第2次免疫后大約2周左右，將懷孕母鼠分籠。并對(duì)所生的7日齡乳鼠以強(qiáng)毒菌株EHEC0157:H7EDL933進(jìn)行灌胃攻毒(劑量約5.4><108CFUAR)。記錄小鼠死亡情況，評(píng)價(jià)疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果攻毒后第3天，部分乳鼠開(kāi)始死亡。乳鼠存活率見(jiàn)表l所示，未免疫對(duì)照組母鼠所生乳鼠的存活率只有16.8%，而免疫組母鼠所生乳鼠的存活率為1883.0%。表明本發(fā)明疫苗菌株免疫母鼠后，所生的乳鼠能夠從吸吮母乳時(shí)獲得母源抗體，從而對(duì)乳鼠具有較好的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。表1出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株被動(dòng)免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>以上對(duì)本發(fā)明出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株的穩(wěn)定性、安全性、細(xì)胞毒性和對(duì)強(qiáng)毒菌株在小鼠腸道定居時(shí)間的影響，以及用乳鼠進(jìn)行的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以充分證實(shí)，本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株具有良好的穩(wěn)定性、安全性和免疫原性，并具有良好的免疫保護(hù)作用，完全可以作為一種有價(jià)值的重組疫苗株。該疫苗株可被用于人出血性大腸桿菌0157感染的免疫預(yù)防，還可用于反芻動(dòng)物免疫接種，以預(yù)防出血性大腸桿菌0157在反芻動(dòng)物腸道內(nèi)的定居和繁殖，降低細(xì)菌的環(huán)境和食品污染。序列表<110>馮書(shū)章〈120〉出血性大腸桿菌0157重組疫苗〈141〉<160>12<210>1〈211〉19〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ26)。〈400〉1'GCGTAAGGCGTCTGCTGTG<210>2<211>19〈212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ27)。<400>2CACAGCAGACGCCTTACGC<210>3<211>26<212〉腿<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ31)。<400>3CGGGATCCTTCACAAAfiCGGAGGGGA<210>4<211>26<212>腿<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ32)?！?00〉4CGGAATTCTGTATACTGCATGGTGCC20〈210〉5〈211>26<212>醒<213>人工序列<220〉<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ34)。〈400>5CGGAATTCTGTATACTGCATGGTGCC<210>6〈211〉31〈212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ35)。<400>6GAATTCCATATGCAGTGCTGTGACGATGATG〈210〉7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ36)?！?00〉7ACTGTGACAGCTCAAGCTTTACTTTTTCGGCA<210>8<211〉32〈212〉DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ37)。<400>8TGCCGAAAAAGTAAAGCTTGAGCTGTCACAGT<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列〈220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ38)。<400〉9TAATGCCACGCTCTCGAGGATATCATTAATGCTTC<210>10<211>35<212>DNA〈213>人工序列〈220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ39L<400>10GAAGCATTAATGATATCC丁CGAGAGCGTGGCATTA〈210〉11<211>30<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ40)。<400>11TAATATATCAGACATACTGGAGACTGTGGC<210>12<211〉30<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物(FSZ41)。<400>12GCCACAGTCTCCAGTATGTCTGATATATTA權(quán)利要求1、出血性大腸桿菌O157重組疫苗菌株，特征在于該菌株是在已有的腸出血性大腸桿菌O157基因缺失疫苗菌株基礎(chǔ)上，導(dǎo)入了定點(diǎn)突變后的無(wú)毒性的志賀毒素突變體基因，從而進(jìn)一步加強(qiáng)了該疫苗菌株的免疫原性。2、根據(jù)權(quán)利要求1的重組疫肆菌株，其中所說(shuō)的腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株是如中國(guó)專(zhuān)利號(hào)ZL03157537.4所限定的，保藏登記號(hào)為CGMCCNo.1015的疫苗菌株。3、根據(jù)權(quán)利要求1的重組疫苗菌株，其中所說(shuō)的志賀毒素基因源自出血性大腸桿菌0157:H7基因組中的stx^和stx2基因。4、生產(chǎn)出血性大腸桿菌0157'重組疫苗的方法，該方法包括(1)擴(kuò)增得到出血性大腸桿菌0157:H7的stxl和stx2全基因及其部分側(cè)翼序列，并將擴(kuò)增到的基因片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；(2)分別對(duì)擴(kuò)增得到的stxl和stx2A亞基的基因進(jìn)行點(diǎn)突變，并將突變后的基因克隆到載體中；(3)用步驟(2)得到的重組克隆載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(4)對(duì)步驟(3)得到的重組細(xì)胞培養(yǎng)物上清進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，從中篩選出喪失了細(xì)胞毒性的stxl和stx2:突變體；(5)用步驟(4)得到的喪失了細(xì)胞毒性的stxl和stx2突變體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化腸出血性大腸桿菌0157基因缺失疫苗菌株，得到權(quán)利要求1的疫苗菌株。5、根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中步驟(2)中所說(shuō)的喪失了細(xì)胞毒性的Stxl突變體序列是第167位的谷氨酸突變成天冬氨酸(E167D)，第170位的精氨酸突變成亮氨酸(R170L),第231位的丙氨酸突變成天冬氨酸(A231D)和第234位的甘氨酸突變成谷氨酸(G234E)，并且其中所說(shuō)的喪失了細(xì)胞毒性的Stx2突變體序列是第166位的谷氨酸突變成天冬氨酸(E166D)，第219位的丙氨酸突變成天冬氨酸(A219D)和第232位的甘氨酸突變成谷氨酸(G232E)。6、根據(jù)權(quán)利要求1的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株在生產(chǎn)用于預(yù)防人出血性大腸桿菌0157感染和預(yù)防出血性大腸桿菌0157在反芻動(dòng)物消化道定居與繁殖的疫苗中的應(yīng)用。7、含有根據(jù)權(quán)利要求1的出血性大腸桿菌0157重組疫苗菌株，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑的疫苗組合物。全文摘要本發(fā)明涉及出血性大腸桿菌O157重組疫苗菌株，特別是涉及失去了致病性但保留其特異免疫原性的出血性大腸桿菌O157重組疫苗菌株。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于所說(shuō)的出血性大腸桿菌重組菌株的疫苗和疫苗組合物、其生產(chǎn)方法及其在預(yù)防人出血性大腸桿菌O157感染和預(yù)防出血性大腸桿菌O157在反芻動(dòng)物消化道定居與繁殖中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N1/21GK101629158SQ20081005096公開(kāi)日2010年1月20日申請(qǐng)日期2008年7月17日優(yōu)先權(quán)日2008年7月17日發(fā)明者馮書(shū)章,軍劉,洋孫,郭學(xué)軍申請(qǐng)人:馮書(shū)章